Perles modifiées par la porphyrine utilisées comme témoins de compensation en cytométrie en flux

Résumé

Le protocole décrit comment les billes de compensation à base de porphyrine pour la cytométrie en flux sont préparées par la réaction de billes de polystyrène fonctionnalisées aux amines avec le TCPP de porphyrine et le réactif de couplage amide EDC. Une procédure de filtration est utilisée pour réduire les sous-produits particulaires.

Résumé

La cytométrie en flux peut rapidement caractériser et quantifier diverses populations cellulaires en fonction des mesures de fluorescence. Les cellules sont d’abord colorées avec un ou plusieurs réactifs fluorescents, chacun fonctionnalisé avec une molécule fluorescente différente (fluorophore) qui se lie sélectivement aux cellules en fonction de leurs caractéristiques phénotypiques, telles que l’expression de l’antigène de surface cellulaire. L’intensité de fluorescence de chaque réactif lié aux cellules peut être mesurée sur le cytomètre en flux à l’aide de canaux qui détectent une gamme spécifiée de longueurs d’onde. Lorsque plusieurs fluorophores sont utilisés, la lumière des fluorophores individuels déborde souvent dans des canaux de détection indésirables, ce qui nécessite une correction des données d’intensité de fluorescence dans un processus appelé compensation.

Des particules de contrôle de compensation, généralement des billes de polymère liées à un seul fluorophore, sont nécessaires pour chaque fluorophore utilisé dans une expérience de marquage cellulaire. Les données des particules de compensation du cytomètre en flux sont utilisées pour appliquer une correction aux mesures d’intensité de fluorescence. Ce protocole décrit la préparation et la purification de billes de compensation de polystyrène fonctionnalisées par covalence avec le réactif fluorescent méso-tétra(4-carboxyphényl) porphine (TCPP) et leur application dans la compensation de cytométrie en flux. Dans ce travail, des billes de polystyrène fonctionnalisées à l’amine ont été traitées avec du TCPP et le réactif de couplage amide EDC (chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N′-éthylcarbodiimide) à pH 6 et à température ambiante pendant 16 h avec agitation. Les billes TCPP ont été isolées par centrifugation et remises en suspension dans un tampon de pH 7 pour le stockage. Les particules liées au TCPP ont été observées comme sous-produit. Le nombre de ces particules pourrait être réduit à l’aide d’un protocole de filtration facultatif. Les billes TCPP résultantes ont été utilisées avec succès sur un cytomètre en flux pour la compensation dans des expériences avec des cellules d’expectorations humaines marquées avec plusieurs fluorophores. Les billes du RRCT se sont avérées stables après avoir été conservées au réfrigérateur pendant 300 jours.

Introduction

Les porphyrines intéressent depuis de nombreuses années le domaine biomédical en raison de leur fluorescence et de leurs propriétés de ciblage tumoral ^1,2,3. Les applications thérapeutiques telles que la thérapie photodynamique (PDT) et la thérapie sonodynamique (SDT) impliquent l’administration systémique d’une porphyrine à un patient cancéreux, l’accumulation du médicament dans la tumeur et l’exposition localisée de la tumeur à une lumière laser d’une longueur d’onde spécifique ou à des ultrasons. L’exposition à la lumière laser ou aux ultrasons conduit à la génération d’es....

Protocole

Toutes les procédures doivent être effectuées à l’aide d’un équipement de protection individuelle approprié.

1. Préparation de la solution mère du TCPP, 1,0 mg/mL

NOTE: Cela peut être préparé mensuellement.

1. À l’aide d’une balance analytique, d’une spatule et d’un papier de pesée, peser de 49,0 à 50,9 mg de RRCT. Arrondir le poids à 1/10 de milligramme. Mettez de côté la quantité mesurée de TCPP à l’abri de la lumière.
   REMARQUE: Utilisez un pistolet statique si la lecture du poids est instable.
2. Déterminer les quantités requises d’eau purifiée et d’isopropanol (IPA) à partir ....

Résultats

Ce protocole pour l’étiquetage TCPP des billes est relativement rapide et efficace. La figure 1 montre un résultat représentatif du processus d’étiquetage des billes du TCPP, déterminé par cytométrie en flux. La figure 1A montre le profil normalisé des perles arc-en-ciel, tel qu’il a été détecté dans le canal approprié pour détecter le TCPP. Ces billes servent de CQ pour la normalisation des tensions laser pour la détection du TCPP par le cytomètre en flux.

Discussion

Malgré les nombreuses applications des porphyrines dans le diagnostic et la thérapeutique du cancer², il existe peu de littérature sur leur utilisation potentielle comme réactif cytométrique en flux pour l’identification des populations de cellules cancéreuses par rapport aux populations de cellules non cancéreuses dans les tissus humains primaires^24,25,26. Nos recherches sur l’analyse cytométrique en flu.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Flacons en plastique ambré, 2 mL, fond en U, polypropylène	Research Products International  ;   ;	ZC1028-500
Billes de polystyrène divinylbenzène réticulé (PS/DVB) fonctionnelles aux amines, 10.6 &mu ; m Diamètre, 2,5 % p/v suspension aqueuse, 3,82 x 107 billes/mL, 7,11 x 1011 amine groupes/bille	Spherotech	APX-100-10	Diamètre spec. 8.0-12.9 um, suspension 2.5 % w/v 3.82 x 107 billes/mL, 7.11 x 1011 groupes d’amines/bille
Tubes coniques, 50 mL, Falcon	Fisher Scientific	14-432-22
Centrifugeuse			avec rotor approprié
Bouteille jetable en polystyrène avec bouchon, 150 mL	Fisher Scientific	09-761-140
EDC (chlorhydrate de N- (3-diméthylaminopropyle)- N'- éthylcarbodiimide), &ge ; 98 %	Sigma	03450-1G	N° CAS :  ; 25952-53-8
Logiciel d’analyse de cellule unique FlowJo (v10.6.1)	BD
Lamelles en verre, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-540-BP
Filtres à seringue en fibre de verre (Finneran, 5 µ ; m, 13 mm de diamètre)	Thomas Scientific	1190M60
Lames de microscope en verre, 275 x 75 x 1 mm	Fisher Scientific	12-550-143
Solution saline équilibrée Hanks (HBSS)	Fisher Scientific	14-175-095
Isopropanol, grade ACS	Fisher Scientific	AC423830010
Pipette mécanique, 1 canal, 100-1000 uL avec pointes	Eppendorf
MES (22- (N- mopholino)- Acide n'- éthanesulfonique, sel hémisodique	Sigma	M0164	N° CAS : 117961-21-4
Cytomètre en flux Navios EX	Beckman Coulter
Microscope Olympus BX-40 avec caméra DP73 et objectif 40X avec logiciel cellSens	Olympus		ou similaire
Pipettes Pasteur, verre, 5,75"	Fisher Scientific	13-678-6B
pH-mètre (UB 10 Ultra Basic)	Denver Instruments
Contrôleur de pipette (Drummond)	Pipete.com	en plastique DP101
, 5 mL	Fisher Scientific	14955452 Particules de
polystyrène (non fonctionnalisées), SPHERO, 2,5 % p/v, 8,0-12,9   ; m	Spherotech	PP-100-10  ;
Tubes en polypropylène, 15 ml, coniques	Fisher Scientific	14-959-53A
Tubes en polystyrène, fond rond	Fisher Scientific	14-959-2A
Perles arc-en-ciel (Spherotech URCP-50-2K)	Fisher Scientific	NC9207381
Pipettes sérologiques, jetables - 10 mL	Fisher Scientific	07-200-574
Pipettes sérologiques, jetables - 25 mL	Fisher Scientific	07-200-576
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)	Sigma	S6014	N° CAS :  ; 144-55-8
TCPP (méso-tétra(4-carboxyphényl)porphine)  ; Frontier Scientific  ;	Fisher Scientific	50-393-68	N° CAS :  ; 14609-54-2
Tecan Spark Plate Reader (ou similaire)	Tecan Life Sciences
Revolver/rotator Tube	Thermo Fisher Fisher	88881001
Vortex	mixer Fisher Scientific	2215365

3123000918 Seringue