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Article de méthode

Un modèle d’infection à Candida albicans lié à un cathéter chez la souris

2.5K vues

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DOI :

10.3791/65307

⸱

22 mars 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Health Science Center, Xi’an Jiaotong University, 2Key Laboratory of Livestock Infectious Diseases in Northeast China, Ministry of Education, College of Animal Science and Veterinary Medicine, Shenyang Agricultural University

Dans cet article

Résumé

Nous établissons un modèle murin d’infection liée au cathéter (IRC) associée à C. albicans, dans lequel un biofilm se forme sur le cathéter, et l’interaction entre C. albicans et l’hôte est bien corrélée avec l’IRC clinique. Ce modèle aide à dépister les thérapies pour l’IRC associé au biofilm de C. albicans , jetant ainsi les bases d’une transformation clinique.

Résumé

L’infection liée au cathéter (IRC) est une infection nosocomiale courante causée par Candida albicans lors de l’implantation du cathéter. En règle générale, des biofilms se forment sur la surface externe du cathéter et entraînent des infections disséminées, qui sont mortelles pour les patients. Il n’y a pas de prévention et de gestion du traitement efficaces dans les cliniques. Par conséquent, il est urgent d’établir un modèle animal d’IRC pour le criblage préclinique de nouvelles stratégies de prévention et de traitement. Dans cette étude, un cathéter en polyéthylène, un cathéter médical largement utilisé, a été inséré dans le dos des souris BALB/c après l’épilation. Candida albicans L’ATCC MYA-2876 (SC5314) exprimant une protéine fluorescente verte améliorée a ensuite été inoculée à la surface de la peau le long du cathéter. Une fluorescence intense a été observée à la surface du cathéter au microscope fluorescent 3 jours plus tard. Des biofilms matures et épais ont été trouvés à la surface du cathéter par microscopie électronique à balayage. Ces résultats ont indiqué l’adhérence, la colonisation et la formation d’un biofilm de candida albicans à la surface du cathéter. L’hyperplasie de l’épiderme et l’infiltration de cellules inflammatoires dans les échantillons de peau ont indiqué les modifications histopathologiques de la peau associée à l’IRC. Pour résumer, un modèle d’IRC de souris a été établi avec succès. On s’attend à ce que ce modèle soit utile dans la recherche et le développement de la prise en charge thérapeutique de l’IRC associé à Candida albicans .

Introduction

Ces dernières années, avec le développement et l’application de matériaux biomédicaux, les infections liées aux implants sont devenues des problèmes cliniques difficiles 1,2. Avec l’utilisation généralisée des cathéters médicaux dans les cliniques, le nombre d’infections et de décès associés est énorme chaque année 3,4. Les voies d’infection courantes d’une infection liée au cathéter (IRC) comprennent : (1) les agents pathogènes à la surface de la peau s’infiltrent dans le corps et adhèrent à la surface externe du cathéter 5,6,7 ; (2) des agents pathogènes dérivés d’une opération aseptique inappropriée envahissent, adhèrent et colonisent le cathéter ; (3) les agents pathogènes présents dans la circulation sanguine adhèrent et colonisent le cathéter ; 4° les médicaments contaminés par des micro-organismes pathogènes.

Le candida est la troisième raison la plus fréquente de l’IRC 8,9. Il est très probable qu’il provoque une infection de la circulation sanguine et d’autres candidoses invasives potentiellement mortelles après la formation de biofilms à la surface de l’implant. Le pronostic est sombre et le taux de mortalité est élevé2. Il est rapporté que des biofilms se forment à la surface du cathéter dans les 2 semaines suivant l’insertion veineuse centrale et dans la lumière du cathéter quelques semaines plus tard 10,11.

Les biofilms de Candida albicans (C. albicans) formés sur les cathéters médicaux présentent un réseau à double couche composé de levure, de stroma et de mycélium12,13. La formation de biofilms de C. albicans est non seulement une clé de la résistance aux médicaments et de l’évasion immunitaire13, mais aussi vitale pour produire des spores disséminées, ce qui conduit à une nouvelle infection hématogène 2,12 et entraîne des conséquences plus graves, voire mortelles. L’IRC associée à C. albicans est une cause majeure d’infections fongiques cliniques de la circulation sanguine 7,14, et plus de 40 % des patients atteints d’une infection à C. albicans dans le cathéter veineux central développeront une bactériémie15.

Selon l’Infectious Disease Society of America, le traitement recommandé de Candida CRI comprend (1) le retrait du cathéter infecté ; (2) soumettre les patients à un traitement antifongique systémique de 14 jours8 ; 3° la réimplantation d’un nouveau cathéter4. Cependant, dans les applications cliniques, les cathéters ne peuvent pas toujours être complètement retirés. Certains patients ne peuvent être traités qu’avec des antibiotiques systémiques et une thérapie antimicrobienne, accompagnée d’effets secondaires importants16,17.

Les modèles animaux existants de C. albicans, tels que le modèle de candidose oropharyngée, le modèle de candidose vaginale et le modèle d’infection systémique invasive causée par la candidose18,19 ne peuvent pas être bien corrélés avec l’IRC clinique. Par conséquent, dans cette étude, un modèle d’IRC associé à C. albicans chez la souris a été établi. Des cathéters en polyéthylène couramment utilisés en clinique ont été utilisés comme implants sous-cutanés20,21, et C. albicans a été inoculé à la surface de la peau pour simuler l’adhérence de C. albicans aux cathéters médicaux et la formation de biofilms.

Ce modèle a été utilisé avec succès dans notre laboratoire pour dépister l’effet anti-biofilm de différentes thérapies22. De plus, en raison du décalage de détection de C. albicans après une infection par cathéter, une souche de C. albicans contenant une protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) a été construite et inoculée chez la souris pour faciliter l’observation intuitive des colonies et des biofilms de C. albicans sur le cathéter implanté.

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Protocole

Des animaux de laboratoire, des souris mâles BALB/c (12-16 g), ont été achetés au Centre des animaux de laboratoire du Centre des sciences de la santé de l’Université Jiaotong de Xi’an. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel d’éthique animale de l’Université Jiaotong de Xi’an avec le numéro de licence SCXK (Shaanxi) 2021-103.

1. Préparation du tampon et de l’équipement

  1. Transfect des souches de C. albicans avec un plasmide à haute expression pCaExp.
    1. Achetez C. albicans (SC5314) auprès de l’ATCC. Obtenir la souche fluorescente à haute expression22 de l’EGFP en transfectant C. albicans avec un plasmide à haute expression pCaExp contenant le cadre de lecture ouvert complet du gène EGFP (la carte plasmidique est illustrée à la figure 1) et l’utiliser pour des expériences ultérieures.
  2. Cultivez les souches transfectées de C. albicans .
    1. Sélectionner des colonies monoclonales de la souche fluorescente de C. albicans à partir de la plaque de milieu de peptone dextrose (YPD) d’extrait de levure et les cultiver pendant une nuit (30 °C et 220 tr/min) dans 5 mL de milieu liquide YPD (YPD + 50 μg/mL de carbénicilline).
    2. Remettre en suspension le C. albicans dans une solution saline normale après centrifugation à 400 x g pendant 5 min à RT.
    3. Ajustez la concentration de la suspension de C. albicans à 1 x 108 cellules/mL en comparant la turbidité à la norme de McFarland de 0,5.
  3. Préparez les instruments chirurgicaux.
    1. Assurez-vous d’autoclaver tous les instruments chirurgicaux (ciseaux, pinces, pinces hémostatiques, porte-aiguilles, aiguilles de suture) à 121°C pendant 30 min. Des cathéters stériles en polyéthylène (diamètre intérieur : 0,28 mm ; diamètre extérieur : 0,63 mm) sont utilisés.
      REMARQUE : Les cathéters utilisés dans cette étude ont été stérilisés avec de l’oxyde d’éthylène gazeux et l’emballage a été ouvert dans une table ultra-propre exposée aux UV pendant plus de 30 minutes. Avant l’implantation chez la souris, les cathéters ont été immergés dans de l’éthanol à 75 % pour éviter toute contamination.

2. Mise en place d’un modèle d’IRC chez la souris

REMARQUE : L’intervention chirurgicale est illustrée à la figure 2.

  1. Acclimater 30 souris BALB/c (12-16 g, mâle) dans des conditions exemptes d’agents pathogènes spécifiques (SPF) avec un libre accès à l’eau et à la nourriture et 12 h à 12 h en alternance de cycle de lumière et d’obscurité.
  2. Divisez au hasard 30 souris BALB/c en trois groupes (n = 10 souris/groupe) : (A) groupe témoin normal ; (B) groupe de cathéters (cathéters implantés sans C. albicans) ; (C) Groupe modèle (cathéters implantés avec C. albicans).
  3. Anesthésiez les souris avec 1 à 4 % d’isoflurane et placez-les sur une table d’opération en position couchée. La perte du réflexe de redressement et l’absence de réponse à la stimulation des orteils confirment le succès de l’anesthésie. Retirez les poils et stérilisez le site chirurgical avec trois séries alternées de gommages à l’iodophor ou à la chlorhexidine et à l’alcool.
  4. Laissez les souris dans le groupe témoin normal sans aucun traitement et donnez-leur un accès libre à la nourriture et à l’eau.
  5. Pour les souris des groupes cathéter et modèle, maintenir l’anesthésie à 3 % d’isoflurane. Confirmer la profondeur adéquate de l’anesthésie par l’absence de réponse au pincement des orteils et ajuster la concentration d’isoflurane au besoin.
  6. Pour les souris du groupe cathéter, insérez par voie intradermique une aiguille de seringue stérile de 1 ml dans la zone épilée dans le dos pour faire un trou. Insérez un cathéter (d’environ 1 cm de longueur) dans le trou après avoir retiré l’aiguille de la seringue.
  7. Pour les souris du groupe modèle, pipeter 20 μL de C. albicans en suspension sur la zone d’épilation du dos pour simuler la commensale C. albicans sur la peau.
  8. Une fois la solution absorbée par la peau, insérez un cathéter dans la zone épilée du dos en suivant les mêmes procédures que celles décrites à l’étape 2.5.
  9. Pipeter 20 μL supplémentaires de suspension de C. albicans le long du cathéter jusqu’au tissu pour simuler C . albicans dans l’environnement externe.
  10. Fixez les cathéters avec du ruban adhésif et de la gaze et remettez les souris dans des cages pour les nourrir. À la fin du traitement, injecter par voie sous-cutanée du méloxicam (4 mg/kg) aux souris comme analgésie pendant trois jours consécutifs.
    REMARQUE : Après la chirurgie, les souris ont été soigneusement nourries avec de l’eau et de la nourriture. Les souris ont été surveillées deux fois par jour. Les souris ont été euthanasiées par une méthode approuvée par l’IACUC si elles éprouvaient des difficultés à s’alimenter, une perte de poids importante (10 à 20 %) et une hypothermie.

3. Évaluation du modèle IRC

  1. Après 3 jours, anesthésiez les souris avec 3% d’isoflurane et sacrifiez-les par luxation cervicale. Prélevez les cathéters et les échantillons de tissu cutané à l’arrière des souris.
  2. Observez C. albicans et les biofilms sur le cathéter par microscopie électronique à balayage.
    1. Plonger les cathéters dans une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % à 4 °C pendant 48 h. Rincez les cathéters avec du PBS stérile trois fois.
    2. Fixez les cathéters avec de l’acide osmique à 1 % pendant 3 h et rincez-les trois fois avec du PBS stérile.
    3. Déshydrater les cellules sur les cathéters dans une solution d’éthanol à gradient avec des concentrations croissantes (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %, 15 min/gradient).
    4. Plongez les cathéters dans de l’alcool tert-butylique trois fois (30 min à chaque fois).
    5. Congelez rapidement les cathéters dans de l’azote liquide et lyophilisez l’échantillon dans un lyophilisateur selon les instructions du fabricant.
    6. Enduire les échantillons de cathéter d’un or de 10 nm par dépôt par faisceau d’ions.
    7. Observer la présence de C. albicans et de son biofilm à la surface du cathéter de chaque groupe au microscope électronique à balayage (sous vide poussé, 1,5 kV) et enregistrer les images dans chaque groupe.
  3. Observer C. albicans sur le cathéter par microscopie à fluorescence.
    1. Immerger les cathéters dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h.
    2. Observer la présence de C. albicans et de son biofilm à la surface du cathéter de chaque groupe à l’aide d’un microscope à fluorescence sous excitation de 484 nm et enregistrer les images de chaque groupe.
      REMARQUE : Le grossissement est de 400x. La fluorescence de Candida albicans peut être observée avec une excitation à 490 nm et une émission à 510 nm.
  4. Observez C. albicans résidant dans la peau de la souris.
    1. Immerger les tissus cutanés dorsaux des souris dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h.
    2. Déshydrater les tissus cutanés dorsaux dans une solution d’éthanol à gradient avec des concentrations croissantes (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %, 15 min/gradient).
    3. Imprégner les tissus cutanés dorsaux déshydratés dans de la paraffine à 55-60 °C. Faites attention à la température pour éviter les tissus cassants. Pour éliminer un maximum d’impuretés, répétez cette étape trois fois (30 min chacune).
    4. Sectionner les tissus cutanés dorsaux (épaisseur = 5 μm) à l’aide d’un microtome.
    5. Décaparaffinez les lames de paraffine en immergeant les lames dans le xylène deux fois pendant 20 min.
    6. Réhydrater les sections par élution avec de l’éthanol de gradient (éthanol absolu, éthanol 90%, éthanol 75%, eau) pendant 5 min à chaque fois.
    7. Teindre les sections avec de l’acide périodique en immergeant la section dans la solution acide périodique pendant 15 min avant de laver une fois à l’eau courante et deux fois à l’eau distillée.
    8. Teindre les sections avec une solution de coloration aux chevrons (selon les instructions du fabricant) pendant 30 minutes dans l’obscurité et rincer les sections à l’eau courante pendant 5 minutes.
    9. Plongez les sections dans une solution d’hématoxyline pendant 3 à 5 minutes avant de les laver à l’eau courante (2 à 3 minutes), à la solution différenciée (5 à 10 minutes) et à l’eau courante, respectivement.
    10. Plongez les sections dans de l’éthanol trois fois (5 min chacune) et du xylène deux fois (5 min chacune) avant de sceller la section avec de la gomme neutre.
    11. Observez les images du spécimen avec un microscope et analysez les résidus de C. albicans dans la peau de la souris.
      REMARQUE : Le grossissement est de 10x pour l’oculaire et de 4x ou 10x pour la lentille de l’objectif.
  5. Observer les changements histopathologiques dans les tissus cutanés dorsaux.
    1. Immerger les tissus cutanés dorsaux dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pour fixation à 4 °C pendant 48 h. Déshydrater les tissus cutanés dorsaux dans une solution d’éthanol à gradient avec des concentrations croissantes (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %, 15 min/gradient).
    2. Intégrez les tissus cutanés dorsaux déshydratés dans de la paraffine comme décrit à l’étape 3.4.3.
    3. Sectionner les tissus cutanés dorsaux (épaisseur = 5 mm) à l’aide d’un microtome.
    4. Décaparaffinez les lames de paraffine en immergeant les lames dans le xylène deux fois pendant 20 min.
    5. Réhydrater les sections par élution avec de l’éthanol de gradient (éthanol absolu, éthanol 90%, éthanol 75%, eau) pendant 5 min à chaque fois.
    6. Tachez les sections avec de l’hématoxyline pendant 4 min avant de rincer à l’eau du robinet pour enlever la couleur du flotteur.
    7. Différencier l’échantillon avec une solution d’acide chlorhydrique et d’éthanol à 1 % avant de rincer les lames à l’eau courante.
    8. Plongez l’échantillon dans de l’éthanol à 85 % et à 95 % pendant 5 min, puis colorez-le avec une solution d’éosine pendant 3 min.
    9. Déshydrater l’échantillon en l’immergeant dans de l’éthanol de gradient (70 %, 90 %, 95 % et 100 %) et du xylène pendant 2 min chacun.
    10. Scellez l’échantillon avec de la résine neutre.
    11. Observez les images de l’échantillon avec un microscope et analysez les changements pathologiques.

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Résultats

Les C. albicans et les biofilms sur les cathéters ont pu être observés par le MEB. Comme le montre la figure 322, la surface des cathéters en polyéthylène du groupe des cathéters était lisse et aucun micro-organisme pathogène adhérent n’a été observé. Cependant, des biofilms matures et denses de C. albicans étaient visibles à la surface des cathéters en polyéthylène dans le groupe modèle, ce qui indique que C. albicans pouvait coloniser et f...

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Discussion

L’IRC est l’une des infections nosocomiales les plus fréquentes dans la pratique clinique23. Les agents pathogènes présents dans les appendices cutanés, tels que l’épiderme, les glandes sébacées et les follicules pileux, sont tous des causes possibles de l’IRC23,24. Le Candida est le troisième plus grand agent pathogène qui cause l’IRC, dans lequel le Candida albicans était le type le plus courant d’infection par le biofi...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents connus ou de relations personnelles qui auraient pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants du soutien financier de la Fondation des sciences naturelles de la province du Shaanxi (numéro de subvention 2021SF-118) et de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (numéros de subvention 81973409, 82204631).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 Mactutrius turbidibrisShanghai Lujing Technology Co., Ltd5106063
solution fixatrice de glutaraldéhyde à 2,5 %Xingzhi Biotechnology Co., LtdDF015
4 ° ; C réfrigérateurElectrolux (Chine) Electric Co., LtdESE6539TA
AgarBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-023
Balances analytiquesShimadzuATX124
Autoclaves StérilisateurSANYOMLS-3750
ButanolTianjin Chemio Reagent Co., Ltd200-889-7
CarbenicillineAmrescoC0885
Eclipse Ci Microscope optique droit Nikon  ;NikonEclipse Ts2-FL
GlucoseMacklin  ;
Anneau d’inoculationThermo Scientific251586
IsofluraneRWD20210103
ParaformaldéhydeBeyotime BiotechnologyP0099
PAS kit de colorantServicebioG1285
PeptoneBeijing Aoboxing Bio-tech Co., Ltd01-001
Cathéter en polyéthylèneShining Plastic MallPE100
RWD R550 appareil d’anesthésie multicanal pour petits animaux  ;RWDR550
SEMHitachiTM-1000
Incubateur de températureShanghai Zhichu Instrument Co., LtdZQTY-50N
Générateur d’eau d’eau ultrapureHeal ForceNW20VF
ÉchographeDo-ChromDS10260D
XyleneSinopharm  ; Chemical Reagent Co., Ltd10023428
Extrait de levureThermo Scientific  ; OxoidLP0021B
D823520

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