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Article de méthode

Perfusion hépatique Ex vivo Ex Vivo Normothermic chez la souris

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DOI :

10.3791/65363

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25 septembre 2023

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1Experimental Transplantation Surgery, Department of General, Visceral and Vascular Surgery, Jena University Hospital, 2Institute of Pathology, Klinikum Chemnitz GmbH, 3Department of Pathology, Faculty of Veterinary Medicine, Menoufia University

Dans cet article

Résumé

Un système de perfusion hépatique ex vivo normothermique (NEVLP) a été créé pour les foies de souris. Ce système nécessite de l’expérience en microchirurgie mais permet des résultats de perfusion reproductibles. La capacité d’utiliser des foies de souris facilite l’étude des voies moléculaires pour identifier de nouveaux additifs perfusats et permet l’exécution d’expériences axées sur la réparation d’organes.

Résumé

Ce protocole présente un système NEVLP optimisé sans érythrocytes utilisant des foies de souris. La préservation ex vivo des foies de souris a été réalisée en utilisant des canules modifiées et des techniques adaptées de l’équipement de perfusion ex vivo commercial conventionnel. Le système a été utilisé pour évaluer les résultats de la préservation après 12 heures de perfusion. Les souris C57BL / 6J ont servi de donneurs de foie, et les foies ont été explantés en canulant la veine porte (PV) et le canal biliaire (BD), puis en rinçant l’organe avec une solution saline héparinée chaude (37 ° C). Ensuite, les foies explantés ont été transférés dans la chambre de perfusion et soumis à une perfusion machine oxygénée normotherme (NEVLP). Des échantillons de perfusat à l’entrée et à la sortie ont été prélevés à intervalles de 3 heures pour analyse du perfusat. À la fin de la perfusion, des échantillons de foie ont été obtenus pour analyse histologique, l’intégrité morphologique étant évaluée à l’aide de Suzuki-Score modifié par coloration à l’hématoxyline-éosine (HE). Les expériences d’optimisation ont donné les résultats suivants: (1) les souris pesant plus de 30 g ont été jugées plus appropriées pour l’expérience en raison de la plus grande taille de leur canal biliaire (BD). (2) une canule en polyuréthane de 2 Fr (diamètre extérieur = 0,66 mm) était mieux adaptée à la canulation de la veine porte (PV) qu’une canule en polypropylène. Cela a été attribué à l’adhérence accrue du matériau polyuréthane, ce qui a réduit le glissement du cathéter lors du transfert du corps à la chambre de l’organe. (3) pour la canulation des voies biliaires (BD), une canule en polyuréthane de 1 Fr (diamètre extérieur = 0,33 mm) s’est avérée plus efficace que la canule en polypropylène UT - 03 (diamètre extérieur = 0,30 mm). Avec ce protocole optimisé, les foies de souris ont été préservés avec succès pendant une durée de 12 h sans impact significatif sur la structure histologique. La coloration à l’hématoxyline-éosine (HE) a révélé une architecture morphologique bien préservée du foie, caractérisée par des hépatocytes principalement viables avec des noyaux clairement visibles et une légère dilatation des sinusoïdes hépatiques.

Introduction

La transplantation hépatique représente le traitement de référence pour les personnes atteintes d’une maladie hépatique terminale. Malheureusement, la demande de donneurs d’organes dépasse l’offre disponible, ce qui entraîne une pénurie importante. En 2021, environ 24 936 patients étaient sur la liste d’attente pour une greffe de foie, alors que seulement 9 234 greffes ont été réalisées avec succès1. La disparité importante entre l’offre et la demande de greffons hépatiques souligne la nécessité urgente d’étudier des stratégies alternatives pour élargir le bassin de donneurs et améliorer l’accessibilité des greffes de foie. Une façon d’élargir le bassin de donneurs est d’utiliser des donneurs marginaux2. Les donneurs marginaux comprennent ceux qui ont un âge avancé, une stéatose modérée ou sévère. Bien que la transplantation d’organes marginaux puisse donner des résultats favorables, les résultats globaux restent sous-optimaux. En conséquence, l’élaboration de stratégies thérapeutiques visant à renforcer la fonction des donneurs marginaux est actuellement en cours 3,4.

L’une des stratégies consiste à utiliser la perfusion machine, en particulier la perfusion machine oxygénée normotherme, pour améliorer la fonction de ces organes marginaux5. Cependant, il existe encore une compréhension limitée des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets bénéfiques de la perfusion oxygénée normothermique (NEVLP). Les souris, avec leur disponibilité abondante de souches génétiquement modifiées, servent de modèles précieux pour étudier les voies moléculaires. Par exemple, l’importance des voies d’autophagie dans l’atténuation des lésions d’ischémie-reperfusion hépatique est de plus en plus reconnue 6,7. Une voie moléculaire importante dans la lésion d’ischémie-reperfusion hépatique est la voie miR-20b-5p/ATG78. Actuellement, il existe un certain nombre de souches de souris knock-out ATG et knock-out conditionnelles disponibles, mais aucune souche de ratcorrespondante 9.

Sur la base de ce contexte, l’objectif était de générer une plate-forme NEVLP miniaturisée pour les greffes de foie de souris. Cette plateforme faciliterait l’exploration et l’évaluation de stratégies potentielles génétiquement modifiées visant à améliorer la fonctionnalité du foie du donneur. De plus, il était essentiel que le système soit adapté à la perfusion à long terme, permettant le traitement ex vivo du foie, communément appelé « réparation d’organes ».

Compte tenu de la disponibilité limitée de données in vitro pertinentes sur la perfusion du foie de souris, la revue de la littérature s’est concentrée sur des études menées chez le rat. Une recherche systématique dans la littérature couvrant la période de 2010 à 2022 a été effectuée à l’aide de mots clés tels que « perfusion hépatique normothermique », « ex vivo ou in vitro » et « rats ». Cette recherche visait à identifier les conditions optimales chez les rongeurs, nous permettant de déterminer l’approche la plus appropriée.

Le système de perfusion se compose d’un réservoir tampon en verre scellé à chemise d’eau, d’une pompe à rouleaux péristaltiques, d’un oxygénateur, d’un piège à bulles, d’un échangeur de chaleur, d’une chambre d’orgue et d’un système fermé de tubes de cyclage (figure 1). Le système assure le maintien précis d’une température de perfusion constante de 37 °C à l’aide d’une machine thermostatique dédiée. La pompe à rouleaux péristaltiques entraîne le flux du perfusat dans tout le circuit. Le circuit de perfusion commence au niveau du réservoir isolé à chemise d’eau. Par la suite, le perfusat est dirigé à travers l’oxygénateur, qui reçoit un mélange gazeux de 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone provenant d’une bouteille de gaz dédiée. Après l’oxygénation, le perfusat passe à travers le piège à bulles, dans lequel toutes les bulles piégées sont redirigées vers le réservoir par la pompe péristaltique. Le perfusat restant s’écoule à travers l’échangeur de chaleur et pénètre dans la chambre de l’orgue, d’où il retourne au réservoir.

Ici, nous rapportons nos expériences d’établissement d’un NEVLP pour les foies de souris et partageons les résultats prometteurs d’une expérience pilote réalisée en utilisant le milieu oxygéné sans transporteurs d’oxygène.

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Protocole

Les expériences sur les animaux ont été réalisées conformément à la réglementation et aux directives allemandes en vigueur en matière de bien-être animal et aux directives ARRIVE pour la déclaration de la recherche animale. Le protocole d’expérimentation animale a été approuvé par le Thüringer Landesamt für Verbraucherschutz, Thuringe, Allemagne (numéro d’agrément: UKJ - 17 - 106).

NOTE: Des souris mâles C57BL / 6J pesant 34 ± 4 g (moyenne ± erreur type de la moyenne [SEM]) ont été utilisées comme donneurs de foie. Ils ont été maintenus dans des conditions environnementales contrôlées (50% d’humidité et 18 - 23 ° C) avec un accès gratuit à la souris standard et à l’eau. Tout au long de l’intervention chirurgicale, une fréquence respiratoire supérieure à 60 respirations/min a été maintenue et la température corporelle a été maintenue au-dessus de 34 °C.

1. Préparation

  1. Configuration de la table des opérations
    1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux et consommables à des fins de stérilisation.
    2. Allumez tout l’équipement, y compris la planche chauffante et l’électrocoagulation.
    3. Placer une seringue de 50 mL contenant 25 mL de solution saline héparinée (2 500 U/L) dans un incubateur chaud (37 °C).
    4. Placez les instruments chirurgicaux, la suture en soie 6 - 0, l’applicateur de petit coton stérile, la solution saline vétérinaire (500 ml) et les éponges de gaze non tissées (10 cm x 10 cm) sur la table d’opération de manière appropriée.
    5. Placez une aiguille de 26 g sur la table d’opération pour créer un petit trou dans le couvercle du tube microcentrifuge de 0,5 mL pour recevoir le tube biliaire pour la collecte de la bile.
    6. Placez la canule (canule en polyuréthane 1 Fr ou canule en polyéthylène UT - 03) et un tube microcentrifuge stérilisé de 0,5 mL pour la collecte de la bile sur la table d’opération.
  2. Canule de veine porte fabriquée par soi-même
    1. Tenez la canule 2 Fr avec une pince et percez la paroi avec une aiguille de 30 G à une distance de 1 cm de l’extrémité de la canule. Poussez l’aiguille à travers la canule jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille devienne visible.
    2. Coupez la pointe de la canule pour obtenir un triangle pointu.
  3. Préparation de solution saline héparinée
    1. Préparer 25 mL de solution saline héparinée avec une concentration finale de 2 500 UI/mL.
    2. Retirez toutes les bulles d’air et placez la seringue dans l’incubateur à 40 °C.
  4. Démonstration du système de perfusion
    1. Voir la figure 1 pour les principaux composants du système de perfusion de la machine.
  5. Mise en place de la chambre de l’orgue
    1. Voir la figure 2 pour la disposition de la chambre de l’orgue.
  6. Mise en place du système de perfusion
    1. Activez le programme de diagramme de laboratoire pour la surveillance de la pression.
    2. Connectez le calibrateur de pression et le capteur de pression au niveau de la chambre de l’orgue.
    3. Ajustez le calibrateur de pression pour lire 0 mmHg et vérifiez la valeur correspondante sur le logiciel de contrôle de pression.
    4. Ajustez le calibrateur de pression pour lire 20 mmHg et vérifiez à nouveau la valeur correspondante sur le logiciel de contrôle de pression.
    5. Allumez le bain-marie et préchauffez la chambre de l’orgue à 40 °C.
    6. Rincer l’ensemble du système de plomberie deux fois avec de l’eau distillée désionisée pendant 30 minutes chacun, en assurant l’élimination complète de la solution désinfectante.
    7. Initier la circulation de la solution de désinfection dans tout le système pendant une durée de 20 minutes pour assurer une désinfection complète.
    8. Allumez le mélange gazeux (95 % d’oxygène (O2) et 5 % de dioxyde de carbone (CO2).
  7. Remplissage perfusé
    1. Compléter 250 mL de milieu E de Williams avec 50 mL de sérum bovin fœtal, 3 mL de pénicilline/streptomycine (1 mg/mL), 0,17 mL d’insuline (100 IE/mL), 0,34 mL d’héparine (5000 U/mL) et 0,07 mL d’hydrocortisone (100 mg/2 mL) pour préparer le milieu E complet de Williams.
    2. Ajouter des volumes égaux (150 mL) de perfusat au réservoir et à la chambre de l’orgue pour amorcer le système.
      NOTE: Une attention particulière doit être accordée au maintien de la stérilité pendant le processus de remplissage. Le perfusat est constamment pompé à travers ces deux composants clés de la perfusion de la machine de recirculation fermée.
    3. Allumez la pompe péristaltique à vitesse moyenne (15 mL/min) pour amorcer le système de perfusion avec le milieu oxygéné.

2. Explantation hépatique

  1. Préparation préopératoire
    1. Pesez l’animal. Préparer l’analgésique buprénorphine (0,3 mg/mL) (0,05 mg/kg de poids corporel).
    2. Connectez la chambre d’induction à la prise murale. Porter l’oxygène à 0,5 L/min. Tourner l’isoflurane à 3%.
    3. Placez l’animal dans la chambre jusqu’à ce qu’une anesthésie profonde (réflexe de redressement positif) soit atteinte.
    4. Utilisez une micro-seringue pour appliquer une dose d’analgésie adaptée au poids corporel par voie sous-cutanée.
    5. Utilisez un rasoir électrique pour couper la fourrure sur la peau abdominale.
    6. Transférez la souris sur la table d’opération et allumez le vaporisateur d’isoflurane à 2,5% pour maintenir l’anesthésie. Confirmez la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe interdigital de l’orteil.
  2. Préparation de l’abdomen de la souris
    1. Placez la souris en décubitus dorsal.
    2. Testez le réflexe interdigital pour confirmer deux fois la profondeur appropriée de l’anesthésie. Fixez les quatre membres avec du ruban adhésif.
    3. Désinfecter les deux côtés de l’abdomen jusqu’à la ligne axillaire médiane en utilisant trois cycles consécutifs d’alcool iodé. Utilisez de la gaze stérilisée non tissée pour couvrir la zone autour du champ chirurgical.
    4. Faites une incision transversale de 3 cm à 1 cm sous la xiphoïde dans la région abdominale de la souris à l’aide de ciseaux Metzenbaum et de forceps chirurgicaux.
    5. Étendre l’incision cutanée bilatéralement à la ligne midaxillaire des deux côtés.
    6. Faites soigneusement une incision longitudinale de 2 cm le long de la linea alba à l’aide de ciseaux à ressort.
    7. Coupez à travers la couche musculaire abdominale avec l’électrocoagulation et les ciseaux à ressort Vannas.
    8. Placez soigneusement un morceau de gaze humide pour protéger le foie de l’électrocoagulation.
    9. Utilisez une suture de soie 6 - 0 avec l’aiguille ronde pour rétracter le processus xiphoïde pour une meilleure exposition du ligament coronaire.
    10. Utilisez deux rétracteurs de côtes pour exposer complètement la cavité abdominale de la souris.
    11. Déplacez soigneusement l’intestin grêle hors de la cavité abdominale avec un coton-tige humide pour exposer complètement le hile.
  3. Préparation des voies cholédoques
    1. Transecter les ligaments falciformes, phréniques et gastrohépatiques avec des ciseaux tranchants.
    2. Libérez soigneusement le canal cholédoque à l’aide de fines pinces incurvées sans dents.
      REMARQUE: Le canal cholédoque est très facilement endommagé et se brise. Une fois qu’il se brise, il ne peut pas être canulé. En raison de la direction de la position anatomique, il est préférable d’utiliser des pinces incurvées.
    3. Placez deux boucles de suture en soie 6 - 0 sur le canal cholédoque en préparation de l’étape suivante.
  4. Canulation des voies biliaires
    1. Percez soigneusement le canal biliaire avec une aiguille de 30 G. Utilisez des pinces incurvées pointues pour agrandir le petit trou afin de l’adapter à la canulation des canaux biliaires.
    2. Utilisez une pince à canulation vasculaire pour saisir la canule des voies biliaires et la pousser dans le canal biliaire.
    3. Fixez deux fois la canule avec les boucles de suture prédéfinies 6 - 0.
      REMARQUE: Pendant la canulation, la résistance par la bile est ressentie. Si la force n’est pas bien contrôlée, la canule sera poussée hors des voies biliaires par la pression de l’écoulement de la bile. Ajustez soigneusement la profondeur de la canule. S’il est trop profond, il peut endommager le canal biliaire, et s’il n’est pas assez profond, il peut glisser.
    4. Observez l’écoulement de la bile dans la canule après une canulation réussie.
  5. Préparation de la veine porte
    1. Serrez la veine porte avec une pince plate et libérez soigneusement le tissu conjonctif avec une pince incurvée. Ne tirez pas fort pour éviter de provoquer une déchirure de la veine porte. Une fois que la veine porte est endommagée, il est difficile de ré-canuler la veine porte.
    2. Disséquez le PV juste au-dessus de la bifurcation et placez la première boucle de suture en utilisant une suture de soie 6 - 0 sur PV près de la confluence pour une utilisation ultérieure.
    3. Placez la deuxième boucle de suture pour une fixation ultérieure du PV aussi près que possible du hile hépatique.
  6. Canulation de la veine porte
    1. Utilisez un clip artériel pour fermer la veine porte distale.
    2. Très soigneusement, percez la veine porte avec l’une des canules de la veine porte ci-dessus. Le flux sanguin peut être clairement observé dans la canule après une ponction réussie.
    3. Fixez la canule PV avec la boucle de suture 6 - 0 pré-placée.
  7. Bouffées vasomotrices du foie
    1. Augmenter l’isoflurane à 5% et euthanasier la souris avec une surdose d’isoflurane inhalée.
    2. Prenez une solution saline d’héparine préchauffée de l’incubateur. Enlevez toutes les bulles d’air formées à l’intérieur de la solution saline héparinisée.
    3. Fixez la seringue avec une solution saline héparinée préchauffée dans la pompe à seringue.
    4. Connectez le tube d’extension de la pompe à seringue à la canule de la veine porte, réglez la vitesse à 2 mL/min et commencez le rinçage du foie.
    5. Observez la couleur du foie à la fin de la procédure de rinçage. Excise le foie une fois que la couleur devient jaune homogène.
    6. Transecter le diaphragme, la veine cave inférieure suprahépatique, la veine cave infra-hépatique, l’artère hépatique, la veine porte distale et tout tissu conjonctif restant.
    7. Placez le foie dans la boîte de Pétri.

3. Connexion du foie et de la chambre

  1. Transfert de foie
    1. Transférer soigneusement le foie dans la chambre de l’organe à l’aide d’une boîte de Pétri.
    2. Gardez une petite quantité de solution saline dans la boîte de Petri pour empêcher le foie de se dessécher.
      REMARQUE: La veine porte et le canal biliaire peuvent facilement être tordus au cours de cette procédure, ce qui peut affecter la perfusion hépatique et la collecte de la bile.
  2. Raccord de canule de veine porte
    1. Infuser lentement une solution saline normale dans la canule de la veine porte avec une seringue pour évacuer les bulles d’air dans la canule.
    2. Connectez la canule de la veine porte au tube d’écoulement perfusat de la chambre de l’orgue.
  3. Raccord de canule biliaire
    1. Guidez la canule du canal biliaire de la souris à travers la valve d’un capuchon en caoutchouc qui est relié à la chambre de l’organe.
    2. Insérez la canule biliaire dans un microtube prépréparé de 0,5 mL avec un petit trou dans le couvercle.
    3. Placez le microtube sur de l’argile à l’extérieur de la chambre de l’orgue.

4. Ajustez le débit en fonction de la pression PV

  1. Allumez la pompe péristaltique à partir de 1 mL/min.
  2. Vérifiez la lecture de la pression de la veine porte pour ajuster le débit.
  3. Maintenir la pression de la veine porte dans la plage physiologique comprise entre 7 et 10 mmHg en ajustant le débit.
    NOTE: Le débit nominal peut varier légèrement en fonction de l’utilisation et du positionnement des tubes.

5. Prélèvement d’échantillons

  1. Obtenir des échantillons de perfusat d’entrée à partir du tube d’entrée de la veine porte et des échantillons de perfusat de sortie de la chambre d’orgue à intervalles de 3 heures.
  2. Prélever des échantillons de tous les lobes du foie pour analyse histologique à la fin de la période de perfusion de 12 h.

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Résultats

Mise en place d’une intervention chirurgicale
Au total, 17 animaux ont été utilisés pour cette expérience: 14 souris ont été utilisées pour optimiser le processus d’obtention d’organes, y compris la canulation de la veine porte (PV) et du canal biliaire (BD), tandis que 3 souris ont été utilisées pour valider la procédure (tableau 1). Les résultats histologiques (Figure 3) ont été comparés pour faciliter l’identification de l’état optimal de perfusion.

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Discussion

Étapes critiques du protocole
Les deux étapes cruciales de l’explantation hépatique sont la canulation de la veine porte (PV) et la canulation subséquente du canal biliaire (BD). Ces étapes sont d’une importance capitale pour assurer le succès du prélèvement d’organes et des procédures ultérieures de perfusion ou de transplantation.

Défis et solutions
La canulation PV présente trois défis : une blessure de la paroi du vaisseau, le déplacement du cathéter...

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Déclarations de divulgation

Il n’y a pas de conflits d’intérêts financiers à divulguer.

Remerciements

Tout au long de la rédaction de cet article, j’ai reçu beaucoup de soutien et d’aide. Je tiens particulièrement à remercier mon coéquipier XinPei Chen pour sa merveilleuse collaboration et son soutien patient pendant mon opération.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 ml Micro Tube PPSarstedt72699
1 Fr Canule en caoutchoucVygonSample Cannula
10 µ ; L Micro SeringueHamilton701N
2 Fr Canule en caoutchoucVygonCanule
24 g Canule papillonTerumoSR+OF2419
26 g Canule papillonTerumoSR+DU2619WX
30 g Aiguille hypodermiqueSterican100246
50 ml Pompe à seringueBraun110356
6-0 Perma-Hand SeideEthicon639H
Clip ArtérielBraunBH014R
Chambre humide autoclavableHugo Sachs Elektronik73-4733
Big Cotton Applicator  ;NOBA Verbandmittel Danz GmbH974018
Piège à bullesHugo-Sachs-ElektronikV83163
Buprenovet (0,3 mg / ml)Elanco/
CIDEX OPA solution (2 L)Cilag GmbH20391
Unité électrochirurgicale pour la coupe monopolaire VIO® ; 50 CERBE/
Sérum de veau fœtal (500 ml)  ;Sigma-AldrichF7524-500ML
Mélange de gaz (95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone)Alimentation domestique/
chauffage Bains circulants Appareilde Harvard75-0310
Héparine 5000 (c’est-à-dire /5 ml)Braun1708.00.00
Hydrocortisone (100 mg / 2 ml)Insuline15427276
Pfizer(100 IE / ml)SigmaI0516-5ML
Ciseaux à iris  ;Fine Science Instruments15000-03
Isofluran (250 ml)Cp-Pharma1214
Oxygénateur à membraneHugo Sachs ElektronikT18728
Microscope de microchirurgie  ;LeicaM60
Carfil Quality180000056
NanoZoomer 2.0 HTHamamatsu/
Éponges non tissées  ;Kompressen866110
Pénicilline Streptomycine (1 mg / ml)  ;C.C.ProZ-13-M
Tube d’extension de perfusion (30 cm)Braun4256000
Pompe péristaltiqueHarvard-ApparatusP-70
Petri Dishc 100x15 mmVWR® ;391-0578
Povidon-Jod (Vet-Sep Spray)Livisto799-416
Simulateur de transducteur de pressionUTAH Medical Products650-950
Transducteurs de pression artérielle réutilisablesAD InstrumentsMLT-0380/D
S & Pince à canulation en TFine Science Instruments00608-11
Petit Applicateur en CotonNOBA Verbandmittel Danz GmbH974116
Pince Droite 10 cm  ;Fine Science Instruments00632-11
Pince à sutureFine Science Instruments11063-07
Seringue 50ml Original PerfusorBraun8728810F-06
UT - 03 CanuleUnique Medical, Japon/
Vannas Spring ScissorsFine Science Instruments15018-10
Veterinary Saline (500 ml)WDT18X1807
Réservoir à chemise d’eau  ; 2 LHarvard-Apparatus73-3441
William’s E Medium (500 ML)ThermofischerScientific A1217601
d’échantillonEnsemble d’écarteurs de souris

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