Imagerie de mtHyPer7, un biocapteur ratiométrique pour le peroxyde mitochondrial, dans des cellules de levure vivantes

Résumé

Le peroxyde d’hydrogène (H2,_O2) est à la fois une source de dommages oxydatifs et une molécule de signalisation. Ce protocole décrit comment mesurer le H 2 O₂mitochondrial à l’aide de HyPer7 (mtHyPer7) ciblant les mitochondries, un biocapteur ratiométrique génétiquement codé, chez la levure vivante. Il détaille comment optimiser les conditions d’imagerie et effectuer des analyses cellulaires et subcellulaires quantitatives à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement.

Résumé

Le dysfonctionnement mitochondrial, ou altération fonctionnelle, se retrouve dans de nombreuses maladies et affections, y compris les troubles neurodégénératifs et musculo-squelettiques, le cancer et le vieillissement normal. Ici, une approche est décrite pour évaluer la fonction mitochondriale dans les cellules de levure vivantes à des résolutions cellulaires et subcellulaires à l’aide d’un biocapteur ratiométrique codé génétiquement, peu invasif. Le biocapteur, HyPer7 (mtHyPer7), qui cible les mitochondries, détecte le peroxyde d’hydrogène (H 2 O₂) dans les mitochondries. Il se compose d’une séquence de signal mitochondrial fusionnée à une protéine fluorescente permutée circulairement et du domaine_H2O_2-sensible d’une protéine bactérienne OxyR. Le biocapteur est généré et intégré dans le génome de la levure à l’aide d’un système CRISPR-Cas9 sans marqueur, pour une expression plus cohérente par rapport aux constructions à transmission plasmidique.

mtHyPer7 est quantitativement ciblé sur les mitochondries, n’a pas d’effet détectable sur le taux de croissance de la levure ou la morphologie mitochondriale, et fournit une lecture quantitativede H 2 O₂ mitochondrial dans des conditions normales de croissance et lors d’une exposition au stress oxydatif. Ce protocole explique comment optimiser les conditions d’imagerie à l’aide d’un système de microscope confocal à disque rotatif et effectuer une analyse quantitative à l’aide d’un logiciel disponible gratuitement. Ces outils permettent de collecter de riches informations spatio-temporelles sur les mitochondries à la fois au sein des cellules et entre les cellules d’une population. De plus, le flux de travail décrit ici peut être utilisé pour valider d’autres biocapteurs.

Introduction

Les mitochondries sont des organites cellulaires eucaryotes essentiels qui sont bien connus pour leur fonction dans la production d’ATP par phosphorylation oxydative et transport d’électrons¹. De plus, les mitochondries sont des sites de stockage du calcium, de synthèse des lipides, des acides aminés, des acides gras et des clusters fer-soufre, et de transduction du signal ^2,3. À l’intérieur des cellules, les mitochondries forment un réseau dynamique avec une morphologie et une distribution caractéristiques, qui varient en fonction du type de cellule et de l’état métabolique. De plus, bien que les mitochondries puissent fusionner et se diviser, toutes les mitochondries d’une cellule ne sont pas équivalentes. De nombreuses études ont documenté l’hétérogénéité fonctionnelle des mitochondries au sein des cellules individuelles dans des attributs tels que le potentiel membranaire et l’état oxydatif ^4,5,6. Cette variation de la fonction mitochondriale est due en partie aux dommages causés à l’organite par les mutations de l’ADNmt (qui se produisent à un taux plus élevé que dans l’ADN nucléaire) et aux dommages oxydatifs causés par les espèces réactives de l’oxygène (ROS) générées à la fois à l’intérieur et à l’extérieur de l’organite ^7,8,9. Les dommages à l’organite sont atténués par des mécanismes de contrôle de la qualité mitochondriale qui réparent les dommages ou éliminent les mitochondries endommagées de manière irréparable¹⁰.

Le peroxyde d’hydrogène(H 2 O₂) est une espèce réactive de l’oxygène qui est une source de dommages oxydatifs aux protéines cellulaires, aux acides nucléiques et aux lipides. Cependant, H 2 O₂sert également de molécule de signalisation qui régule les activités cellulaires par l’oxydation réversible des thiols dans les protéines cibles^11,12. H 2 O₂est produit à partir d’électrons qui fuient de la chaîne de transport d’électrons mitochondriales et par des enzymes spécifiques, telles que la NADPH oxydase et les monoamines oxydases 13,14,15,16,17,18,19,20. Il est également inactivé par les systèmes antioxydants, y compris ceux à base de thiorédoxine et de glutathion^21,22,23. Ainsi, l’analyse des niveaux mitochondriaux de H 2 O₂est essentielle pour comprendre le rôle de ce métabolite dans la fonction mitochondriale et cellulaire normale et dans des conditions de stress oxydatif.

L’objectif global de ce protocole est de détecter le H 2 O 2mitochondrial à l’aide d’un biocapteur_H2O₂ ratiométrique codé génétiquement, HyPer7, qui est ciblé sur l’organite (mtHyPer7). mtHyPer7 est une chimère constituée de la séquence de signal mitochondrial de l’ATP9 (la préséquence Su9), d’une forme de protéine fluorescente verte (GFP) permutée circulairement et du domainede liaison H 2 O₂ de la protéine OxyR de Neisseria meningitidis²⁴ (Figure 1). Dans la GFP permutée circulairement, les terminaisons N et C de la GFP native sont fusionnées et de nouvelles terminaisons sont formées près du chromophore, ce qui confère une plus grande mobilité à la protéine et une plus grande labilité de ses caractéristiques spectrales par rapport à la GFP²⁵ native. L’interaction du domaine OxyR de mtHyPer7 avec H 2 O₂ est sélective pour H ₂et conduit à une oxydation réversible des résidus de cystéine conservés et à la formation de ponts disulfure. Les changements conformationnels associés à l’oxydation d’OxyR sont transférés à la GFP permutée circulairement dans mtHyPer7, ce qui entraîne un décalage spectral du maximum d’excitation du chromophore mtHyPer7 de 405 nm à l’état réduit à 488 nm à l’état H 2 O_2-oxydé²⁶. Ainsi, le rapport de fluorescence de mtHyPer7 en réponse à l’excitation à 488 nm par rapport à 405 nm reflète l’oxydation de la sonde parH 2 O₂.

Idéalement, un biocapteur devrait fournir une lecture quantitative, absolue et en temps réel de sa molécule cible. Malheureusement, cela n’est pas toujours possible dans les mesures réelles. Dans le cas des capteurs d’oxydation, tels que mtHyPer7, la lecture en temps réel est affectée par le taux de réduction du pont disulfure. Les systèmes de réduction utilisés par les biocapteurs ROS diffèrent, et ceux-ci peuvent modifier considérablement la dynamique de réponse de la sonde, comme le montre la comparaison de HyPer7, réduit par le système thiorédoxine, et de roGFP2-Tsa2ΔC_R, réduit par le cytosol de levure glutathion dans le cytosol²⁷. Ainsi, pour tirer une conclusion sur la concentration relative de_H2O₂ à partir des rapports mtHyPer7, il faut supposer que le système de réduction maintient une capacité constante pendant l’expérience. Nonobstant ces considérations, HyPer7 et les sondes apparentées ont été utilisées dans divers contextes pour obtenir des informations sur_H2O₂ dans les cellules vivantes^25,28,29.

Figure 1 : Conception, mécanisme moléculaire et spectres d’excitation/émission du biocapteur_H2O₂ mtHyPer7. (A) La sonde mtHyPer7 est dérivée par l’insertion d’une GFP permutée circulairement dans le domaine OxyR-RD de Neisseria meningitidis. Il contient la séquence de ciblage mitochondrial de la sous-unité 9 de l’ATP synthase de Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration du mécanisme de détection de_H2O₂ de mtHyPer7. L’oxydation des cystéines dans le domaine RD augmente l’émission de fluorescence lors de l’excitation à 488 nm et diminue l’émission produite par l’excitation à 405 nm. (C) Spectres d’excitation et d’émission de HyPer7 sous formes oxydées et réduites. Cette figure est reproduite avec la permission de Pak et ^al.24. Abréviations : GFP = protéine fluorescente verte ; cpGFP = GFP permuté circulairement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cette imagerie ratiométrique de mtHyPer7 offre des avantages importants pour la quantification mitochondriale de H 2 O₂^24,27 ; Il fournit un contrôle interne de la concentration de la sonde. De plus, le décalage du pic d’excitation produit par l’exposition à_H2O 2 n’est pas complet, même à des concentrations saturées de H 2 O₂. Ainsi, l’imagerie par rapport peut augmenter la sensibilité en incorporant deux points spectraux dans l’analyse.

La sonde mtHyPer7 utilisée ici a une très grande affinité pour H 2O₂ et une sensibilité relativement faible à pH²⁴, et a été ciblée avec succès sur les mitochondries³⁰ de Caenorhabditis elegans. Cette protéine a également été utilisée dans la levure ^27,31. Cependant, des études antérieures se sont appuyées sur l’expression plasmidique de mtHyPer7, ce qui entraîne une variabilité de cellule à cellule dans l’expression de la sonde²⁷. De plus, la construction décrite dans ce protocole a été intégrée dans une région conservée et sans gène sur le chromosome^{X 32} à l’aide d’une approche basée sur CRISPR pour une intégration sans marqueur. L’expression du gène intégré du biocapteur est également contrôlée par le promoteur constitutif fort TEF1 (Figure 2). En conséquence, il y a une expression plus stable et cohérente du biocapteur dans les populations de cellules de levure par rapport à celle observée à l’aide de l’expression du biocapteur transmis par plasmide, et les cellules portant le biocapteur peuvent être propagées sans avoir besoin de milieux sélectifs.

Figure 2 : Génération de cellules exprimant mtHyPer7 par CRISPR. Le plasmide contenant Cas9 et l’ARNsg (YN2_1_LT58_X2site) et la construction du biocapteur mtHyPer7 amplifié par PCR sont introduits dans les cellules de levure bourgeonnantes par transformation de l’acétate de lithium. Le site d’insertion sans gène sur le chromosome X (X2) est reconnu et coupé par la protéine Cas9 avec l’ARNsg, et le biocapteur est intégré dans le génome par recombinaison homologue. Après l’identification des transformants réussis par criblage microscopique, PCR de colonie et séquençage, le plasmide Cas9 est éliminé (durci) par croissance dans des milieux non sélectifs. Abréviations : sgRNA = ARN guide unique ; TEF = facteur d’amélioration de la transcription. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, mtHyPer7 offre des avantages par rapport aux autres biocapteurs ROS. Par exemple, les colorants organiques utilisés pour détecter les ROS (p. ex., le dihydroéthidium [DHE]² et le MitoSOX³) peuvent produire une coloration inégale ou non spécifique et sont souvent administrés dans des solvants tels que l’éthanol ou le diméthylsulfoxyde, qui nécessitent des contrôles supplémentaires pour les effets des solvants. Une autre classe de biocapteurs ROS sont les biocapteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de fluorescence (FRET) (par exemple, Redoxfluor pour l’état redox cellulaire⁴ et les capteurs de peroxyde HSP-FRET⁵, OxyFRET 6 et PerFRET⁶). Ces sondes sont génétiquement codées et très sensibles en principe et peuvent être quantitativement ciblées sur les mitochondries à l’aide de séquences de signaux mitochondriaux bien caractérisées. Cependant, il existe des défis dans l’utilisation de sondes à base de FRET, y compris le bruit de fond dû à l’excitation croisée et au saignement, et des exigences strictes pour la proximité et l’orientation des fluorophores pour que FRET se produise^33,34. De plus, les sondes FRET sont constituées de deux protéines fluorescentes qui nécessitent des constructions plus grandes pour être exprimées dans les cellules d’intérêt par rapport aux sondes à décalage spectral. Le protocole décrit ici a été développé pour tirer parti des forces du biocapteur à base d’HyPer7 et pour utiliser cette sonde compacte, ratiométrique, de haute affinité et codée génétiquement pour l’imagerie quantitative du peroxyde dans les mitochondries de la levure vivante.

Protocole

1. Génération du plasmide biocapteur, intégration dans le génome de la levure et évaluation du ciblage de mtHyPer7 sur les mitochondries et des effets sur la morphologie mitochondriale, les taux de croissance cellulaire ou la sensibilité au stress oxydatif

REMARQUE : Reportez-vous au fichier supplémentaire 1, au tableau supplémentaire S1, au tableau supplémentaire S2 et au tableau supplémentaire S3 pour la construction des plasmides des biocapteurs, les souches, les plasmides et les amorces, respectivement, utilisés pour la construction et la caractérisation des biocapteurs. Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Amplifier la construction du biocapteur à partir du plasmide du biocapteur à l’aide des amorces Y290 et Y291 (Figure 2) par réaction en chaîne par polymérase (PCR).
2. Mélanger 500 ng du plasmide Cas9/ARN guide (YN2_1_LT58_X2site³²) avec 50 μL du produit PCR de l’étape 1.1 (la construction du biocapteur). Transformer le mélange en levure bourgeonnante à l’aide de la méthode de l’acétate de lithium³⁵ et sélectionner les transformants sur des plaques YPD contenant 200 mg/mL de G418.
3. Cribler les candidats transformants par amplification PCR de l’ADN génomique à l’aide des amorces Y292 et Y293. Pour les transformants portant un insert de la taille attendue (positif : 3,5 kb ; négatif : 0,3 kb), séquencez la région insérée pour une validation ultérieure.
4. Évaluer l’effet du biocapteur sur la croissance et la fonction mitochondriale (Figure 3). Si le biocapteur semble affecter la fonction des cellules ou des mitochondries, essayez de minimiser l’effet en changeant le promoteur, le site d’intégration ou la souche parente.
   1. Déterminer l’effet de la construction du biocapteur sur le taux de croissance en présence ou en l’absence d’un facteur de stress oxydatif (p. ex., le paraquat), comme décrit précédemment³⁶.
      1. Diluer les cellules en phase mi-logarithmique à une densité optique de 600 nm (OD 600) de 0,0035 dans₂₀₀ μL de milieux correspondants avec et sans traitement dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. Mesurer la densité optique de la culture toutes les 20 min pendant 72 h à l’aide d’un lecteur de plaques. Calculer le taux de croissance maximal (pente) comme la variation maximale de la DO sur un intervalle de 240 minutes pendant le cours de 72 h.
   2. Visualisez les cellules par microscopie à fluorescence et évaluez la luminosité et la morphologie mitochondriale comme décrit précédemment³⁷.
      1. Cultivez les cellules jusqu’à la phase mi-logarithmique, colorez les mitochondries avec 250 nM MitoTracker Red pendant 30 minutes et lavez-les deux fois avant l’imagerie. Capturez des piles Z d’une profondeur de 6 μm à des intervalles de 0,3 μm sur un microscope à fluorescence à grand champ ou confocal et inspectez-les visuellement. Recherchez les mitochondries formant des structures tubulaires allongées.

Figure 3 : mtHyPer7 est ciblé sur les mitochondries et n’affecte pas la morphologie mitochondriale, la croissance cellulaire ou la sensibilité au stress oxydatif. (A) Morphologie mitochondriale dans les cellules de levure vivantes exprimant mtHyPer7. Panneau de gauche : mtHyPer7 visualisé avec une excitation de 488 nm. Panneau central : mitochondries marquées avec MitoTracker Red 250 nM. Panneau de droite : images fusionnées. Des projections d’intensité maximale sont présentées. Le contour de la cellule est affiché en blanc. Barre d’échelle = 1 μm. (B,C) Courbes de croissance et taux de croissance maximal des cellules de type sauvage et des cellules exprimant mtHyPer7 cultivées en présence (+PQ) ou en absence de 2,5 mM de paraquat dans les milieux YPD. (D,E) Courbes de croissance et taux de croissance maximal des cellules de type sauvage et exprimant mtHyPer7 cultivées en présence (+PQ) ou en l’absence de 2,5 mM de paraquat dans les milieux SC. Toutes les courbes de croissance sont les moyennes de trois répétitions indépendantes. Les taux de croissance maximaux sont représentés par la moyenne ± l’erreur-type de la moyenne (SEM). L’analyse de la courbe de croissance a été effectuée en diluant des cellules en phase mi-logarithmique à un OD 600 de 0,0035 dans₂₀₀ μL de milieux correspondants dans chaque puits d’une plaque à fond plat de 96 puits. La DO de la culture a été mesurée toutes les 20 min pendant 72 h à l’aide d’un lecteur de plaques. Chaque souche ou condition a été plaquée en trois exemplaires et le taux de croissance moyen a été tracé. Le taux de croissance maximal (pente) a été calculé à l’aide des variations de la DO sur un intervalle de 240 minutes sur une période de 72 h. Abréviations : WT = caractères sauvages ; PQ = paraquat. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Culture cellulaire et préparation pour l’imagerie (Figure 4)

1. Propager les cellules dans un milieu synthétique jusqu’à la phase mi-logarithmique pour l’imagerie. Une culture de 5 mL en phase mi-logarithmique fournit suffisamment de cellules pour quatre ou cinq lames et un total de > 100 cellules bourgeonnées pour l’analyse.
   1. Le matin de la veille de l’expérience, préparer des précultures liquides en inoculant 5 mL de milieu synthétique complet (SC) dans un tube à fond conique de 50 mL avec une seule colonie de cellules de levure.
   2. Incuber la préculture dans un agitateur orbital à 200 tr/min et 30 °C pendant 6 à 8 h. Mesurer la DO 600 de la préculture, qui doit être au milieu de la phase logarithmique : ~0,5-1 × 10⁷ cellules/mL, DO_{600 ~0,1-0,3}.
   3. Préparer une culture en phase mi-logarithmique en utilisant la préculture pour l’imagerie le lendemain. Calculer la quantité de préculture nécessaire pour une culture en phase mi-logarithmique après une nuit de croissance (8-16 h). Lorsque les cellules sont cultivées en milieu SC, le temps de doublement est de ~2 h. Par conséquent, le volume (V) de préculture pour l’inoculation d’une culture de nuit de 5 mL est calculé à l’aide de l’équation (1) :
      (1)
   4. Inoculer 5 mL de milieu SC dans un tube à fond conique de 50 mL avec la quantité de préculture calculée à l’étape 2.1.3. Cultivez dans un agitateur orbital à 200 tr/min et 30 °C pendant 8-16 h.
2. Le jour de l’imagerie, confirmer que la culture générée à l’étape 2.1.4 est à la phase mi-logarithmique (OD₆₀₀ ~0,1-0,3). Concentrer les cellules à partir de 1 mL de culture en phase mi-logarithmique par centrifugation à 6 000 × g pendant 30 s. Retirez le surnageant en laissant 10 à 20 μL de surnageant dans le tube. Remettre en suspension la pastille cellulaire en la mélangeant doucement avec le milieu résiduel à l’aide d’une micropipette.
3. Utilisez un souffleur d’air ou un mouchoir non pelucheux pour enlever la poussière d’une lame de microscope en verre et ajoutez 1,8 μL de suspension cellulaire à la lame. Couvrez les cellules avec une lamelle en verre #1,5 (170 μm d’épaisseur), en abaissant lentement la lamelle en biais pour éviter d’introduire des bulles.
4. Imagez immédiatement et jetez la diapositive après 10 min d’imagerie.

Figure 4 : Croissance cellulaire et imagerie. Les cellules de levure bourgeonnantes exprimant mtHyPer7 sont cultivées jusqu’à la phase mi-logarithmique. Les images de la série Z sont collectées par microscopie confocale à disque rotatif, puis soumises à une reconstruction et à une analyse 3D. Voir les sections 2 et 3 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Optimisation des conditions d’imagerie et de la collecte d’images (Figure 5)

1. Sélectionnez un mode d’imagerie. Pour la coupe optique sans post-traitement, il est préférable d’utiliser un instrument confocal à disque rotatif. Toutefois, si le signal est faible ou si cet instrument n’est pas disponible, utilisez l’imagerie à grand champ, en veillant à ce que les images à grand champ soient déconvoluées pour éliminer le flou flou, comme décrit précédemment³⁸.
2. Sélectionnez l’optique. Utilisez un objectif à immersion dans l’huile à ouverture numérique élevée, tel que 100x/1,45 Plan-Apochromat.
3. Sélectionnez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission. Pour l’imagerie confocale à disque rotatif, utiliser une excitation laser à 405 nm et 488 nm et un filtre d’émission GFP standard. Pour l’imagerie à grand champ, utilisez une diode électroluminescente (LED) ou une excitation par lampe, mais assurez-vous que la configuration du filtre permet une variation de l’excitation tout en faisant passer l’émission à travers le filtre GFP standard.
   REMARQUE : Cela peut être accompli, par exemple, en retirant le filtre d’excitation d’un cube GFP et en utilisant une LED ou une roue à filtres pour sélectionner l’excitation.
4. Sélectionnez le temps d’exposition et l’intensité de l’éclairage.
   1. Établissez des conditions d’acquisition qui produisent un signal facilement détectable et une résolution acceptable dans chaque canal de fluorescence. Par exemple, sur un microscope confocal à disque rotatif équipé d’une caméra sCMOS, utilisez un binning 2 x 2, une puissance laser de 20 à 40 % et une exposition de 200 à 600 ms.
   2. Examinez l’histogramme de l’image. Dans une image 12 bits (4 096 niveaux de gris possibles), assurez-vous que la plage dynamique totale des valeurs de pixel est d’au moins plusieurs centaines de niveaux de gris, sans saturation (Figure 5A). De plus, assurez-vous que la plage est supérieure d’un ordre de grandeur au niveau de bruit. Calculez le niveau de bruit comme l’écart-type des valeurs de pixel dans une zone sans cellule d’une image, mesuré comme décrit à l’étape 4.1.3.1.
   3. Testez le photoblanchiment ou le stress mitochondrial induit par l’imagerie dans les conditions d’imagerie sélectionnées. Si un photoblanchiment excessif ou une augmentation de l’H2 O₂ mitochondrial est observé, réduire la puissance du laser et augmenter l’exposition ou le binning.
      1. Collectez une série d’images en accéléré, sans délai entre les acquisitions, afin d’évaluer les effets des conditions d’imagerie sur la stabilité du signal et le stress oxydatif dans les mitochondries. À l’aide du logiciel d’acquisition au microscope ou d’ImageJ, mesurez la valeur moyenne des pixels dans chaque canal de fluorescence pour confirmer la stabilité du signal (variation de <5 % ; Graphique 5B). Si l’expérience n’implique pas d’imagerie en accéléré, assurez-vous que la fluorescence est stable sur deux ou trois empilements Z répétés (25-35 expositions).
         REMARQUE : Une diminution de la fluorescence des deux canaux peut indiquer un photoblanchiment ; cependant, une diminution de la fluorescence excitée à 405 nm accompagnée d’une augmentation du canal excité à 488 nm peut indiquer une augmentation de l’H 2 O₂mitochondrial et un stress oxydatif induit par l’imagerie dans l’organite.
5. Acquérir des images. Si vous collectez des piles Z, assurez-vous que l’intervalle Z est le même pour toutes les images du jeu de données et incluez la cellule entière. Pour la levure bourgeonnante, image avec un intervalle Z de 0,5 μm et une profondeur totale de pile de 6 μm. Acquérez des images en lumière transmise pour documenter les limites des cellules.
6. Analysez les images manuellement ou semi-automatiquement à l’aide des scripts disponibles dans le fichier supplémentaire 2 et à https://github.com/theresaswayne/biosensor, à l’aide de la distribution fidjienne d’ImageJ³⁹ et du logiciel statistique R (Figure 6). Dans les instructions du logiciel, les commandes de menu hiérarchiques sont affichées en gras avec « | », indiquant une séquence de sélections de menu. Les options et les boutons sont affichés en gras.

Figure 5 : Optimisation de l’imagerie. (A) Évaluation des images et des histogrammes pour la plage d’intensité correcte. Des projections d’intensité maximale d’images confocales à disque rotatif sont présentées. Les histogrammes sont représentés à la fois avec un axe Y linéaire (noir) et un axe Y à l’échelle logarithmique (gris) pour illustrer la plage dynamique de l’image. Panneaux de gauche : une image bruitée avec une faible intensité et une faible plage dynamique. Panneaux centraux : une image avec une plage dynamique (~1 000 niveaux de gris) et une intensité acceptables. Panneaux de droite : une image dont le contraste n’est pas correctement amélioré pour produire une saturation excessive. Barre d’échelle = 1 μm. (B,C) Analyse du photoblanchiment de mtHyPer7. Des piles Z successives ont été collectées sans délai, des piles Z ont été additionnées et l’intensité moyenne des mitochondries a été mesurée et normalisée au premier point temporel. Les résultats des trois premiers points temporels (27 expositions) sont présentés. (B) Longueur d’onde d’excitation : 405 nm. (C) Longueur d’onde d’excitation : 488 nm. Les valeurs indiquées sont les moyennes de trois cellules de chacun des trois essais indépendants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Analyse semi-automatisée avec des scripts

1. Générez et mesurez des images de rapport à l’aide d’un script d’analyse de biocapteur (par exemple, biosensor.ijm ou biosensor-image-subtraction.ijm).
   1. Sélectionnez le script à utiliser. Le protocole d’utilisation de chaque script est similaire ; Toute différence sera spécifiée dans le texte.
      1. biosensor.ijm : Dans ce script, l’arrière-plan et le bruit sont corrigés à l’aide de zones d’image sélectionnées par l’utilisateur, de valeurs fixes ou d’aucune soustraction. Sélectionnez les méthodes de correction de l’arrière-plan et du bruit de manière indépendante.
      2. biosensor-image-subtraction.ijm : dans ce script, l’arrière-plan et le bruit sont tous deux gérés par la même méthode sélectionnée par l’utilisateur, qui peut être l’une des suivantes : image vide, zone sélectionnée par l’utilisateur dans l’image, valeur fixe ou aucune correction.
   2. Aux Fidji, ouvrez une image de pile Z multicanal acquise à l’étape 3.5. Ouvrez le fichier de script d’analyse du biocapteur souhaité. Exécutez le script en cliquant sur Exécuter dans la fenêtre Éditeur de script . Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, saisissez les informations demandées.
      1. Sélectionnez les numéros de canal du numérateur et du dénominateur pour le calcul du rapport. Pour mtHyPer7, le numérateur est le canal excité à 488 nm, et le dénominateur est le canal excité à 405 nm. Sélectionnez le numéro de canal de l’image à lumière transmise, s’il est présent, ou 0 s’il n’y en a pas.
      2. Sélectionnez la méthode de soustraction d’arrière-plan souhaitée parmi les quatre options suivantes. Si l’arrière-plan est relativement uniforme, choisissez Sélectionner une zone d’image, qui mesure directement le niveau d’arrière-plan de l’image. Si l’arrière-plan varie considérablement d’un champ à l’autre, utilisez le script biosensor-image-subtraction.ijm et sélectionnez Image vierge (pour collecter une image vierge à corriger, capturez une pile Z multicanal avec des conditions d’acquisition identiques dans un champ de vision sans cellule, ou à partir d’une diapositive réalisée avec un milieu de culture sans cellule). La valeur fixe permet la saisie d’une valeur de fond précédemment mesurée. Aucun ne laisse l’arrière-plan non corrigé, mais peut réduire la précision de la mesure.
      3. Sélectionnez la méthode de soustraction de bruit souhaitée. La valeur de bruit est utilisée comme seuil inférieur sur les images de canal masquées soustraites de l’arrière-plan afin de réduire l’effet de la variation aléatoire dans la lecture du détecteur. Optez pour Sélectionner une zone d’image ou Valeur fixe pour permettre la saisie d’un niveau de bruit précédemment mesuré, ce qui fonctionne généralement bien car les niveaux de bruit sont constants si les conditions d’imagerie sont maintenues constantes. Vous pouvez également choisir Aucun et utiliser une valeur de 1 comme seuil inférieur, ce qui peut augmenter la variabilité des mesures.
      4. Sélectionner un algorithme de seuillage pour détecter les mitochondries de manière précise et cohérente ; Otsu ou MaxEntropy sont recommandés. Idéalement, utilisez le même algorithme pour toutes les images d’une expérience, mais assurez-vous de la reconnaissance précise des mitochondries. Utilisez une méthode de seuillage différente s’il y a des changements de morphologie au cours d’une expérience.
      5. Sélectionnez le nombre de régions d’intérêt (ROI) par cellule. Par exemple, si vous mesurez les différences entre la mère et les bourgeons, sélectionnez 2.
      6. Sélectionnez le dossier de sortie dans lequel les images de mesures et de rapport seront enregistrées.
   3. Suivez les instructions pour la correction de l’arrière-plan et du bruit.
      1. Sélection de zone (le cas échéant) : si vous avez choisi Sélectionner une zone d’image pour la mesure de l’arrière-plan ou du bruit, suivez les instructions pour dessiner une zone d’arrière-plan (en dehors des cellules ou des artefacts fluorescents) à l’aide de l’outil ROI rectangulaire. Après avoir dessiné la zone, cliquez sur OK.
      2. Entrée de valeur fixe (le cas échéant) : si une valeur fixe a été choisie pour la mesure du bruit de fond ou du bruit, suivez les instructions pour saisir les valeurs de bruit de fond et/ou de bruit pour chaque canal de fluorescence.
      3. Image de référence vierge (le cas échéant) : dans le script biosensor-image-subtraction.ijm, si l’option Image vierge a été choisie pour la correction de l’arrière-plan ou du bruit, suivez les instructions pour sélectionner un fichier image vide.
   4. Marquez les retours sur investissement pour la mesure. Dans les cultures en phase mi-logarithmique, limitez l’analyse aux cellules bourgeonnées.
      1. Dessinez des ROI correspondant à des cellules individuelles ou à des régions subcellulaires en fonction de l’image en fond clair. Le retour sur investissement n’a pas besoin de correspondre exactement au contour de la cellule, car seules les mitochondries seuillées dans le retour sur investissement seront mesurées. Vous pouvez également ouvrir un ensemble de ROI précédemment enregistré : dans le Gestionnaire de ROI, cliquez sur Plus, puis sélectionnez le fichier de ROI.
      2. Appuyez sur T après avoir créé chaque ROI pour ajouter le ROI sélectionné au gestionnaire de ROI. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, cochez la case Afficher tout pour documenter les cellules qui ont été marquées. Chaque région ajoutée apparaîtra sous la forme d’un élément numéroté dans la liste ROI Manager. Si vous analysez plus d’un retour sur investissement par cellule (par exemple, la mère et le bourgeon), marquez les retours sur investissement dans le même ordre pour chaque cellule analysée.
      3. Une fois que tous les ROI souhaités ont été ajoutés au gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur OK dans la boîte de dialogue Marquer les cellules .
   5. Choisissez le format du tableau de mesure. Dans la boîte de dialogue Multimesure qui s’affiche, cochez la case Mesurer toutes les tranches. Cochez l’option Une ligne par tranche pour produire un tableau au format souhaité. Utilisez le process_multiROI_tables. Script R pour traiter les tables créées avec l’option Une ligne par tranche ; ne cochez pas la case Ajouter les résultats. Répétez cette étape 3 fois (pour la mesure du numérateur [488], du dénominateur [405] et du rapport [488/405] images).
   6. Le script enregistrera les fichiers de sortie dans le dossier sélectionné à l’étape 4.1.2.6.
2. Calcul des rapports moyens pondérés pour chaque région ou cellule
   1. À l’aide des résultats obtenus à l’étape précédente, calculez les rapports moyens pondérés pour chaque région ou cellule à l’aide de l’équation (2). Calculez les ratios « pixels » ou « régions » (voir la discussion pour plus de détails).
      (2)
      REMARQUE : Les valeurs de surface et de densité intégrée (IntDen) incluent uniquement les pixels à l’intérieur des mitochondries seuillées. Ce calcul peut être automatisé à l’aide de la process_multiROI_tables. Script R et logiciel statistique R.
3. Générez une image au format colorisé. Comme les changements de teinte (couleur) sont plus évidents pour l’œil humain que les changements d’intensité, convertissez la valeur du rapport en une échelle de couleurs pour faciliter l’interprétation visuelle. Le script colorize_ratio_image.ijm colorisera une image de ratio masqué.
   1. Aux Fidji, ouvrez une image de pile de ratio Z générée à l’étape 4.1.6. Ouvrez le fichier de script colorize_ratio_image.ijm. Exécutez le script en cliquant sur Exécuter dans la fenêtre Éditeur de script . Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, saisissez les informations demandées.
      1. Méthode de colorisation : dans l’option Non modulé , tous les pixels mitochondriaux apparaissent à la même luminosité. Cependant, certaines images peuvent sembler bruitées, car les pixels sombres et lumineux contribuent à l’image de ratio. Pour réduire cet effet, utilisez l’option Intensité modulée .
      2. Valeur minimale et maximale affichées : ces valeurs contrôlent la plage de valeurs de ratio qui seront colorisées. Choisissez des valeurs proches des valeurs minimales et maximales moyennes observées dans une expérience (en fonction des rapports moyens pondérés calculés à l’étape 4.2.1). Dans le cadre d’une expérience, assurez-vous d’acquérir toutes les images avec des conditions d’imagerie identiques et d’afficher toutes les images avec des valeurs minimales et maximales identiques.
      3. Mode de projection : les piles Z sont affichées sous forme de projections pour montrer l’ensemble de la population mitochondriale. La projection est créée avant la colorisation. Sélectionnez Max pour une projection d’intensité maximale (en conservant les valeurs maximales de rapport et d’intensité) ou Average pour une projection d’intensité moyenne.
      4. Dossier de sortie : sélectionnez le dossier dans lequel enregistrer les images colorisées.
   2. Si l’option Non modulé a été sélectionnée, sélectionnez une combinaison de couleurs (table de correspondance ; LUT) dans la boîte de dialogue qui s’affiche. Utilisez les LUT RVB Fire ou Rainbow intégrées à Fidji, ou n’importe quelle LUT souhaitée au format .lut d’ImageJ (Importer à partir d’un fichier LUT). La LUT Rainbow Smooth⁴⁰ est recommandée (incluse dans le fichier supplémentaire 2 et sur GitHub).
   3. Le script enregistre les fichiers de sortie dans le dossier sélectionné à l’étape 4.3.1.4. Il s’agit notamment de l’image du rapport colorisé (Color_RGB.tif) et de l’image du rapport colorisé avec une barre de calibrage indiquant la correspondance entre les valeurs du rapport et la couleur de l’image (Color_with_bar.tif).

5. Analyse manuelle

REMARQUE : Cette approche prend plus de temps, mais permet une flexibilité dans le prétraitement et la définition du seuil.

1. Corriger pour l’arrière-plan.
   1. Définissez des options aux Fidji.
      1. Cliquez sur Analyser | Définissez les mesures. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cochez les cases Zone, Moyenne, StdDev, IntDen et Étiquette d’affichage. Définissez les décimales sur 3.
      2. Cliquez sur Modifier | Les options | Entrée/Sortie. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cochez les cases Enregistrer les numéros de ligne et Enregistrer les en-têtes de colonne.
   2. Pour augmenter la sensibilité du calcul du rapport, soustrayez le bruit de fond de chaque canal de fluorescence. Si l’arrière-plan est relativement uniforme, mesurez l’intensité moyenne d’une zone sans cellule dans une image et soustrayez cette valeur de l’image entière (étape 5.1.2.1). Sinon, si l’arrière-plan varie considérablement d’un champ à l’autre, utilisez une image vierge pour la correction (étape 5.1.2.2.).
      1. Pour soustraire une région sélectionnée par l’utilisateur, cliquez sur Image | Couleur | Divisez les canaux et gardez toutes les images de canaux ouvertes, car elles seront nécessaires plus tard. Pour chaque canal de fluorescence, dessinez un ROI sur l’arrière-plan (en dehors de toute cellule) et cliquez sur Analyser | Mesurer, ou pour les piles, cliquez sur Image | Piles | Mesurer la pile. Observez la valeur moyenne du retour sur investissement qui apparaît dans le tableau Résultats . Cliquez sur Modifier | Sélectionnez Aucun, puis Traiter | Mathématiques | Soustraire. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, entrez la valeur d’arrière-plan moyenne mesurée, arrondie à l’entier le plus proche.
         REMARQUE : L’arrondi permet d’éviter les erreurs lors d’opérations binaires ultérieures.
      2. Pour soustraire une image vierge d’un fichier de données, collectez une image vierge à partir d’un champ de vision totalement acellulaire ou d’une lame préparée avec un milieu de culture sans cellule. Cliquez sur Traiter | Calculateur d’image. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, définissez l’opération sur Soustraire, puis définissez Image1 et Image2 sur l’image de cellule et l’image vide, respectivement. Cochez la case Créer une nouvelle fenêtre et Résultat 32 bits.
2. Pour limiter l’analyse aux mitochondries, effectuez une segmentation. Étant donné que chaque canal peut changer d’intensité en fonction de l’état du biocapteur, utilisez la somme des deux canaux pour définir la zone des mitochondries de manière cohérente.
   1. Pour créer une somme d’images, cliquez sur Traiter | Calculateur d’image. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, définissez l’opération sur Ajouter, puis définissez Image1 et Image2 sur les deux canaux fluorescents soustraits de l’arrière-plan dans n’importe quel ordre. Cochez la case Créer une nouvelle fenêtre et un résultat 32 bits et attendez qu’une image de somme apparaisse.
   2. Définissez le seuil de définition des mitochondries sur l’image de somme.
      1. Cliquez sur l’image | Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Threshold (Seuil ) qui s’affiche, cochez la case Dark Background (Arrière-plan sombre et Histogramme de pile). Définissez Method sur l’algorithme souhaité (par exemple, Otsu ou MaxEntropy). Utilisez le seuillage automatisé pour la reproductibilité, mais si aucune méthode automatique ne convient, ajustez manuellement le seuil.
         REMARQUE : Idéalement, le même algorithme devrait être utilisé pour toutes les images d’une expérience, mais les changements de morphologie au cours d’une expérience peuvent nécessiter une méthode de seuillage différente dans certaines conditions.
      2. Lorsque le seuil est satisfaisant, cliquez sur Appliquer. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, choisissez Convertir en masque. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cochez la case Arrière-plan noir et ne cochez pas les autres cases. Enregistrez l’image de masque résultante pour évaluer la précision de la segmentation.
   3. Convertissez les valeurs de masque de 0 et 255 en 0 et 1, respectivement, en cliquant sur Processus | Mathématiques | Diviser. Définissez la valeur sur 255 et, lorsque vous y êtes invité, sélectionnez l’option permettant de traiter toutes les images.
   4. Appliquez le masque aux canaux de fluorescence soustraits de l’arrière-plan en cliquant sur Traiter | Calculateur d’image. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, définissez l’opération sur Multiplier. Définissez Image1 et Image2 sur le canal du numérateur et le masque, respectivement. Cochez la case Créer une nouvelle fenêtre et Résultat 32 bits ; Répétez la multiplication du masque avec le canal du dénominateur.
   5. Préparez chaque canal masqué pour le calcul du ratio en définissant les pixels d’arrière-plan sur NaN (« pas un nombre »).
      1. Sélectionnez le canal de numérateur masqué et cliquez sur Image | Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Seuil , cliquez sur Définir, puis dans la boîte de dialogue qui s’affiche, définissez le minimum sur le niveau de bruit calculé ou sur 1, et laissez le maximum tel quel.
      2. Dans la fenêtre Seuil , cliquez sur Appliquer. Dans la boîte de dialogue suivante, choisissez Définir sur NaN. Répétez l’opération pour le canal du dénominateur masqué.
3. Générez l’image du ratio.
   1. Cliquez sur Traiter | Calculateur d’image. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, définissez l’opération sur Diviser. Définissez Image1 et Image2 sur les canaux de numérateur et de dénominateur masqués soustraits en arrière-plan, respectivement. Pour mtHyPer7, le numérateur est la forme oxydée excitée à 488 nm, et le dénominateur est la forme réduite excitée à 405 nm. Par conséquent, des ratios plus élevés indiquent un H 2 O₂plus élevé.
   2. Cochez la case Créer une nouvelle fenêtre et Résultat 32 bits. Enregistrez l’image du rapport pour l’analyse.
4. Marquez et quantifiez les zones d’intérêt. Chaque cellule ou région subcellulaire est sélectionnée et stockée en tant que ROI dans le gestionnaire de ROI. Il n’est pas nécessaire que les ROI correspondent parfaitement aux contours des cellules, car seules les régions des mitochondries masquées seront mesurées.
   1. À l’aide de l’image en lumière transmise pour éviter les biais, créez des ROI correspondant à des cellules individuelles (ou à des régions subcellulaires). Dans les cultures en phase mi-logarithmique, limitez l’analyse aux cellules de levure portant des bourgeons, qui sont activement engagées dans la division cellulaire. Appuyez sur T après avoir créé chaque ROI pour l’ajouter au gestionnaire de ROI. Cochez la case Afficher tout pour documenter les cellules marquées.
   2. Cliquez sur l’image de ratio créée ci-dessus, et dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Plus ... | MultiMesure. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cochez la case Mesurer toutes les tranches. Ne cochez pas la case Ajouter les résultats. Cochez l’option Une ligne par tranche pour produire un tableau au format souhaité. Le process_multiROI_tables. Le script R traite les tables créées à l’aide de l’option Une ligne par tranche dans le logiciel de statistiques R.
   3. Enregistrez les résultats. Cliquez sur la fenêtre Résultats , puis sur Fichier | Enregistrez et enregistrez le tableau des résultats au format .csv ou .xls. Définissez le nom du fichier pour qu’il corresponde au nom de l’image.
   4. Enregistrez les ROI. Dans le gestionnaire de retour sur investissement, assurez-vous d’abord qu’aucun retour sur investissement n’est sélectionné : cliquez sur Désélectionner, puis sur Plus | Sauvegarder. Ouvrez les ROI enregistrés avec l’image d’origine aux Fidji pour croiser les mesures avec l’image.
5. Calculez les rapports moyens pondérés par cellule ou région à l’aide des résultats obtenus à l’étape précédente et de l’équation (3). Calculez les ratios « pixels » ou « régions » (voir la discussion pour plus de détails).
   (3)
   REMARQUE : Les valeurs de surface et de densité intégrée incluent uniquement les pixels à l’intérieur des mitochondries seuillées. Ce calcul peut être automatisé à l’aide de la process_multiROI_tables. R dans le logiciel statistique R.
6. Générez une image au format colorisé.
   REMARQUE : Les images colorisées peuvent être non modulées, c’est-à-dire que tous les pixels mitochondriaux apparaissent à la même luminosité, ou modulées en intensité, c’est-à-dire que l’intensité des pixels de l’image d’origine est utilisée pour définir les intensités de l’image colorisée.
   1. Pour produire une image colorisée non modulée :
      1. Ouvrez l’image de ratio générée ci-dessus. Cliquez sur l’image | Dupliquer pour générer une copie de l’image, puis fermer l’image d’origine.
      2. Si l’image est une pile Z, sélectionnez une seule tranche ou générez une projection Z pour afficher toutes les mitochondries. Utilisez une projection d’intensité maximale (en conservant les valeurs maximales de rapport et d’intensité à chaque coordonnée de pixel XY) ou une projection d’intensité moyenne.
      3. Cliquez sur l’image | Tables de correspondance et définissez la LUT sur le jeu de couleurs souhaité (par exemple, Rainbow RGB ou Fire [disponible par défaut dans ImageJ]). Vous pouvez également cliquer sur Fichier | Importez la LUT et sélectionnez la LUT souhaitée au format .lut d’ImageJ, tel que Rainbow Smooth⁴⁰ (inclus dans le fichier supplémentaire 2 et sur GitHub). Assurez-vous que la LUT a une couleur foncée affectée à la valeur 0.
      4. Réglez le contraste de l’affichage en cliquant sur Image | Ajuster | Luminosité/Contraste. Dans la fenêtre Luminosité/Contraste, cliquez sur Définir, puis dans la boîte de dialogue qui s’affiche, entrez les valeurs souhaitées pour les valeurs minimales et maximales affichées. Pour maximiser les différences de couleur observées, réglez-les approximativement sur le minimum et le maximum obtenus sur toutes les images. Définissez toutes les images d’un test sur les mêmes niveaux de contraste.
         REMARQUE : Ne cliquez pas sur Appliquer, car cela modifierait les valeurs des pixels et empêcherait la génération d’une barre de calibrage précise à l’étape suivante.
      5. Ajoutez une barre de calibrage des couleurs en cliquant sur Analyser | Outils | Barre d’étalonnage. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, cochez l’option Superposition pour supprimer la barre, si vous le souhaitez, en cliquant sur Image | Superposition | Supprimer la superposition.
      6. Si vous le souhaitez, ajoutez une barre d’échelle en cliquant sur Analyser | Outils | Barre d’échelle. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, définissez la taille, l’emplacement et la couleur souhaités pour la barre. Cochez l’option Superposition pour conserver la couleur de la barre, quelle que soit la LUT utilisée.
      7. Générez une image RVB pour publication en cliquant sur Image | Superposition | Aplatir. Enregistrez l’image résultante.
         REMARQUE : Cette image est uniquement destinée à la présentation ou à la publication. Les valeurs d’intensité sont modifiées, de sorte qu’elles ne peuvent pas être mesurées. Les barres sont également gravées de façon permanente sur l’image.
   2. Pour créer une image avec modulation d’intensité :
      1. Cliquez sur l’image | Dupliquer pour générer une copie de l’image, puis fermer l’original.
      2. S’il s’agit d’une pile Z, sélectionnez une seule tranche ou générez une projection Z pour afficher toutes les mitochondries.
      3. Réglez le contraste d’affichage de l’image de rapport en cliquant sur Image | Ajuster | Luminosité/Contraste, puis dans la fenêtre Luminosité/Contraste, cliquez sur Définir. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, entrez les valeurs souhaitées pour les valeurs minimales et maximales affichées. Pour maximiser les différences de couleur observées, réglez-les approximativement sur le minimum et le maximum obtenus sur toutes les images, et réglez toutes les images d’une expérience sur les mêmes niveaux de contraste. Cliquez sur Appliquer pour redimensionner les valeurs de pixel.
      4. Pour créer une barre de calibrage, dupliquez cette image améliorée et générez-la en accédant à Analyser | Outils | Barre d’étalonnage. Convertissez l’image et la superposition au format RVB en cliquant sur Image | Superposition | Aplatir. Si vous le souhaitez, collez cette barre sur l’image RVB avec modulation d’intensité obtenue à l’étape 5.6.2.12 pour la présentation ou la publication.
      5. Créez une nouvelle image avec la même largeur et la même hauteur que l’image en cliquant sur Fichier | Nouveau | L’image.... Dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, définissez les paramètres comme suit : Type : RVB ; Remplir avec : Noir ; Largeur et hauteur : 9largeur et hauteur de l’image) ; Tranches : 1.
      6. Convertissez la nouvelle pile en une pile d’images TSL (teinte, saturation, luminosité) en cliquant sur Image | Tapez | Pile HSB.
      7. Cliquez sur l’image au rapport ajusté en fonction du contraste en accédant à Modifier | Sélectionnez Tout, puis Modifier | Copier. Ensuite, cliquez sur la pile TSL, sélectionnez la première tranche (Teinte) et cliquez sur Modifier | Collez pour transférer les valeurs de ratio.
      8. Sélectionnez la tranche 2 (Saturation) de la pile TSL. Définissez la couleur de premier plan sur le blanc en accédant à Édition | Les options | Couleurs. Cliquez sur Modifier | Sélectionnez Tout, puis Modifier | Remplir, puis dans la boîte de dialogue qui s’ouvre, sélectionnez Non pour remplir uniquement la tranche actuelle avec du blanc.
      9. Ouvrez l’image des données brutes et divisez les canaux en cliquant sur Image | Couleur | Diviser les canaux.
      10. Générez la moyenne des deux canaux de rapport à l’aide de la calculatrice d’image et en cliquant sur Traiter | Calculateur d’image. Dans la boîte de dialogue qui s’affiche, définissez l’opération sur Moyenne, puis définissez Image1 et Image2 sur les images du numérateur et du dénominateur, respectivement. Cochez la case Créer une nouvelle fenêtre.
      11. Cliquez sur l’image moyenne créée ci-dessus en accédant à Modifier | Sélectionnez Tout, puis Modifier | Copier. Ensuite, cliquez sur la pile TSL, sélectionnez la troisième tranche (Valeur) et cliquez sur Modifier | Collez pour transférer les valeurs d’intensité.
      12. Convertissez la pile TSL dans l’espace colorimétrique RVB en cliquant sur Image | Tapez | Couleur RVB. Enregistrez l’image résultante.

Figure 6 : Schéma de l’analyse et de la présentation de l’image. Les images confocales à disque rotatif sont d’abord soustraites de l’arrière-plan. Les mitochondries sont segmentées par seuillage et converties en masques pour chaque tranche. Ces masques sont appliqués aux deux couches et les images masquées sont utilisées pour calculer le rapport de l’image. Les ROI sont dessinés pour mesurer le rapport mtHyPer7 dans les cellules ou les régions subcellulaires. Des images au format colorisé peuvent également être générées pour la présentation des données. Barre d’échelle = 1 μm. Abréviation : ROI = région d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Pour confirmer que mtHyPer7 est une sonde appropriée pour évaluer le H 2 O₂mitochondrial, la localisation de mtHyPer7 et son effet sur les mitochondries de levure et la santé cellulaire ont été évalués. Pour évaluer le ciblage de mtHyPer7, les mitochondries ont été colorées avec le colorant vital MitoTracker Red spécifique aux mitochondries dans les cellules de levure témoins et les levures qui expriment mtHyPer7. À l’aide de la coloration MitoTracker Red, les mitochondries ont été résolues sous forme de longues structures tubulaires alignées le long de l’axe mère-bourgeon et accumulées à l’extrémité du bourgeon et à l’extrémité de la cellule mère distale au bourgeon⁴¹. La morphologie mitochondriale était similaire dans les cellules témoins et les cellules exprimant mtHyPer7. De plus, mtHyPer7 a co-localisé avec les mitochondries colorées en rouge de MitoTracker (Figure 3A). Ainsi, mtHyPer7 a été ciblé efficacement et quantitativement sur les mitochondries sans affecter la morphologie ou la distribution mitochondriale normale.

Ensuite, des expériences de validation supplémentaires ont été réalisées pour évaluer l’effet de mtHyPer7 sur la fitness cellulaire et la sensibilité au stress oxydatif dans les mitochondries. Les taux de croissance des cellules exprimant mtHyPer7 dans les milieux riches ou synthétiques à base de glucose (YPD ou SC, respectivement) sont similaires à ceux des cellules de type sauvage non transformées (Figure 3B,D). Pour évaluer les effets possibles sur le stress oxydatif dans les mitochondries, les levures témoins et exprimant mtHyPer7 ont été traitées avec de faibles niveaux de paraquat, une petite molécule redox active qui s’accumule dans les mitochondries et entraîne des niveaux élevés de superoxyde dans l’organite^24,27. Si l’expression de mtHyPer7 induit un stress oxydatif dans les mitochondries ou protège les mitochondries du stress oxydatif, alors les cellules exprimant mtHyPer7 devraient présenter une sensibilité accrue ou diminuée au traitement au paraquat, respectivement. Le traitement avec de faibles niveaux de paraquat a entraîné une diminution des taux de croissance des levures. De plus, les taux de croissance des cellules de type sauvage et des cellules exprimant mtHyPer7 en présence de paraquat étaient similaires (Figure 3C,E). Par conséquent, l’expression du biocapteur n’a pas créé de stress cellulaire significatif dans les cellules de levure bourgeonnantes ni modifié la sensibilité de la levure au stress oxydatif mitochondrial.

Compte tenu de la preuve que mtHyPer7 convient à l’étude de l’H 2 O 2 mitochondrial dans la levure bourgeonnante, il a été testé si mtHyPer7 pouvait détecter l’H 2 O 2 mitochondrial dans la levure de type sauvage en phase mi-logarithmique et les changements dans l’H 2 O 2 mitochondrial induits par l’ajout externe de H 2 O ₂. Une expérience de titrage H 2 O₂a été réalisée et le rapport moyen oxydé/réduit (O/R) mtHyPer7 a été mesuré dans les mitochondries.

Les scripts d’analyse automatisés ont produit plusieurs fichiers de sortie.

L’image de ratio (ratio.tif) : une pile Z constituée du rapport des piles de 488 nm et 405 nm corrigées en arrière-plan. Cette pile peut être consultée aux Fidji sans traitement supplémentaire ; Cependant, il est recommandé d’améliorer le contraste et/ou de coloriser l’image comme décrit à l’étape 4.3 ou 5.6 du protocole avant le visionnage.

L’image de masque (mask.tif) : une pile Z constituée des zones mitochondriales seuillées utilisées pour l’analyse. Cette image doit être utilisée pour évaluer la précision du seuillage.

Les ROI utilisés pour l’analyse (ROI.zip) : lorsque ce fichier est ouvert aux Fidji, avec l’image source, les ROI sont superposés à l’image pour croiser la table des résultats et l’image source. Chaque ROI est renommé avec un numéro de cellule et un numéro de ROI.

Tableaux de mesure (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) contenant la surface, la moyenne et la densité intégrée des mitochondries seuillées pour chaque tranche dans les images de numérateur, de dénominateur et de ratio, respectivement. Dans les tranches où les mitochondries étaient absentes ou floues, le NaN est enregistré.

Fichier journal (Log.txt) documentant les options utilisées pour la correction de l’arrière-plan et du bruit, le seuillage et le calcul du ratio.

Le rapport O/R de mtHyPer7 a montré une réponse dose-dépendante à laconcentration de H 2 O 2, qui a atteint un plateau à 1-2 mM ajouté de H 2 O ₂de l’extérieur (Figure 7). Étonnamment, le rapport HyPer7 était plus faible dans les cellules exposées à 0,1 mM H 2 O₂que dans les cellules témoins, bien que cette différence ne soit pas statistiquement significative. Une explication de ce phénomène peut être une réponse à l’hormèse, dans laquelle l’exposition à un faible niveau de facteur de stress peut induire des réponses au stress, telles que des mécanismes antioxydants, qui à leur tour réduisent la quantité de ROS détectable par la sonde. Des niveaux plus élevés de facteurs de stress, en revanche, peuvent submerger les réponses internes au stress et entraîner une lecture plus élevée de HyPer7.

Figure 7 : Réponse de mtHyPer7 à H 2 O 2 ajouté de l’extérieur. (A) Projection maximale d’images excitées à 405 nm et 488 nm et projection d’intensité moyenne d’images ratiométriques de mtHyPer7 dans des cellules en phase mi-logarithmique exposées à différentes concentrations de H 2 O 2. La pseudocouleur indique le rapport mtHyPer7 oxydé/réduit (échelle en bas). Barre d’échelle = 1 μm. Le contour de la cellule est affiché en blanc ; n > 100 cellules par condition. (B) Quantification du rapport mtHyPer7 oxydé/réduit dans les cellules de levure bourgeonnantes traitées avec différentes concentrations de H 2O₂. Les moyennes de cinq essais indépendants sont indiquées, avec des symboles de formes et de couleurs différentes pour chaque essai. MEB moyen ± du rapport mtHyPer7 oxydé/réduit : 1,794 ± 0,07627 (sans traitement), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (ANOVA à un facteur avec le test de comparaisons multiples de Tukey). Les valeurs de p sont notées : ****p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Enfin, des études antérieures ont révélé que les mitochondries plus saines, qui sont plus réduites et contiennent moins de superoxyde, sont préférentiellement héritées par les cellules filles de levure⁴, et que les catalases cytosoliques sont transportées et activées dans les cellules filles de levure^42,43,44,45. Ces études documentent l’hérédité asymétrique des mitochondries au cours de la division cellulaire de la levure et le rôle de ce processus dans la valeur adaptative et la durée de vie des cellules filles, ainsi que l’asymétrie d’âge mère-fille. Pour tester s’il existe des différences de H 2 O₂entre les mères et les bourgeons, mtHyPer7 a été mesuré dans les bourgeons et les cellules mères. Des différences dans les mitochondries_H2O 2 ont été observées dans les cellules de levure, et une diminution subtile mais statistiquement significative de la lecture du biocapteur H 2 O₂a été détectée dans les mitochondries du bourgeon par rapport à celles de la cellule mère (Figure 8). Ces résultats sont cohérents avec les résultats précédents selon lesquels les mitochondries du bourgeon sont mieux protégées du stress oxydatif. Ils fournissent également une documentation indiquant que mtHyPer7 peut fournir une lecture quantitative de H 2 O₂mitochondriale avec une résolution cellulaire et subcellulaire chez la levure bourgeonnante.

Figure 8 : Le taux mitochondrial de H 2 O₂est plus bas dans la cellule fille. (A) Projection maximale d’une image ratiométrique de mtHyPer7 dans une cellule représentative. La pseudocouleur indique le rapport mtHyPer7 oxydé/réduit (échelle en bas). Les différences subcellulaires dans le rapport sont évidentes (pointes de flèche). Barre d’échelle = 1 μm. Contour de la cellule : blanc. (B) Différence entre le rapport mtHyPer7 dans le bourgeon et la cellule mère. Pour chaque cellule individuelle, la valeur du rapport mère a été soustraite de la valeur du rapport des bourgeons et tracée sous forme de point. n = 193 cellules regroupées à partir de cinq expériences indépendantes, représentées par des symboles de couleurs différentes pour chaque expérience. Moyenne ± MEB de la différence entre le rapport mtHyPer7 dans le bourgeon et les cellules mères : -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (test t apparié) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Souches utilisées dans cette étude. Liste des souches de levure utilisées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S2 : Plasmides utilisés dans cette étude. Liste des plasmides utilisés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire S3 : Amorces utilisées dans cette étude. Liste des apprêts utilisés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Protocole pour la construction de plasmides de biocapteurs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Scripts pour l’analyse automatisée. Pour chaque script, des exemples de fichiers d’entrée et de sortie sont fournis. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans ce protocole, une méthode est décrite pour utiliser mtHyPer7 comme biocapteur afin d’évaluer le H 2 O₂mitochondrial dans des cellules de levure bourgeonnantes vivantes. Le biocapteur est construit à l’aide d’une méthode basée sur CRISPR et introduit dans une région conservée sans gène du génome de la levure sans l’utilisation de marqueurs sélectionnables. Par rapport aux biocapteurs plasmidiques, les biocapteurs intégrés sont exprimés dans toutes les cellules et à des niveaux constants, ce qui permet d’obtenir des résultats de quantification plus fiables. Aucun marqueur sélectionnable n’est utilisé pour générer des cellules exprimant mtHyPer7, ce qui permet d’utiliser un plus large éventail de fonds de souches et facilite la modification génétique des cellules exprimant des biocapteurs. La protéine mtHyPer7 est correctement ciblée sur les mitochondries sans effets notables sur la morphologie, la fonction, la distribution ou les taux de croissance cellulaire des mitochondries. mtHyPer7 montre une réponse dose-dépendante à H 2 O₂ajouté de l’extérieur. De plus, mtHyPer7 est capable de rendre compte de l’hétérogénéité de la qualité mitochondriale avec une résolution subcellulaire. Enfin, l’utilisation d’un microscope confocal à disque rotatif par opposition à la microscopie à grand champ pour l’imagerie de biocapteurs ciblant les mitochondries réduit le photoblanchiment des fluorophores et génère des images à haute résolution pour l’analyse des différences subcellulaires.

Limites et approches alternatives
Cette méthode ne convient pas à l’imagerie des cellules pendant plus de 10 minutes, car les cellules se dessèchent sous la lamelle. Pour l’imagerie à plus long terme, il est préférable d’utiliser la méthode du tampon gélosé⁴⁶ ou d’immobiliser les cellules dans une boîte de culture à fond de verre remplie de milieu SC.

Le choix du biocapteur doit être guidé par la concentration de la cible dans des conditions expérimentales. Si la sensibilité de HyPer7 est trop élevée, une autre version de HyPer est recommandée, telle que HyPer3 ou HyPerRed^47,48. Cependant, il convient de noter que d’autres sondes HyPer sont plus sensibles au pH. Pour une sensibilité plus élevée, le roGFP à base de peroxyrédoxine pourrait être plus approprié (roGFP2Tsa2ΔCR)²⁷.

L’état d’équilibre de l’oxydation du capteur H 2 O₂est lié à la fois aux taux d’oxydation et de réduction. Le taux d’oxydation des biocapteurs est principalement causépar H 2 O₂, mais le taux de réduction dépend des systèmes de réduction des antioxydants actifs dans la cellule et l’organite. Il a été démontré que HyPer7 est principalement réduit par le système thiorédoxine dans le cytosol de levure, et que sa réduction est plus rapide que celle de roGFP2Tsa2ΔCR²⁷. Par conséquent, les différents mécanismes de réduction et la dynamique de réponse de la sonde doivent être pris en compte lors de l’interprétation des mesures des biocapteurs_H2O₂. En particulier, pour déduire les niveaux de H 2 O₂à partir de la lecture du biocapteur, il faut supposer que le système de réduction maintient une capacité constante pendant l’expérience. En guise d’alternative aux scripts décrits ici, une variété d’autres logiciels ont été mis gratuitement à disposition pour l’analyse des capteurs redox⁴⁹.

Étapes critiques
Avec n’importe quel biocapteur, il est essentiel de démontrer que le biocapteur lui-même n’affecte pas le processus mesuré. Par conséquent, il est important de comparer la croissance et la morphologie mitochondriale des souches dans chaque condition expérimentale. Ici, la morphologie mitochondriale est évaluée à l’aide de MitoTracker Red, qui colore les mitochondries d’une manière dépendante du potentiel membranaire. Cependant, la comparaison des mitochondries dans les cellules non transformées et transformées par biocapteur peut être réalisée en les colorant avec de l’ester méthylique de tétraméthylrhodamine (TMRM), un colorant vital mitochondrial alternatif à détection de potentiel membranaire, ou MitoTracker Green, qui colore les mitochondries indépendamment du potentiel membranaire. Si des effets délétères sont suspectés, il peut être utile de réduire le niveau d’expression ou de modifier le site d’intégration.

La validation du comportement dose-réponse de la sonde et du rapport signal/bruit de la technique d’imagerie est également essentielle pour recueillir des résultats robustes. Si la variabilité au sein d’un groupe dépasse la variabilité entre les groupes, les différences deviennent difficiles à détecter. La variabilité intragroupe peut résulter de la variation réelle de la population ou du bruit dans le processus de détection. Les étapes clés pour augmenter le rapport signal/bruit sont l’acquisition d’images (plage de valeurs de pixels et bruit), la soustraction de l’arrière-plan et le seuillage.

Les effets de bruit peuvent également être réduits pendant les étapes de calcul. L’approche la plus simple consiste à calculer l’intensité moyenne pondérée à partir des mesures d’image de rapport (Results.csv), où chaque pixel représente le rapport local entre les efficacités d’excitation. Cela produit un rapport « pixelwise ». Cependant, si le rapport signal/bruit de l’image est faible, des résultats plus robustes peuvent être obtenus en calculant l’intensité moyenne pondérée d’un retour sur investissement dans les canaux du numérateur et du dénominateur, puis en calculant le rapport entre ces deux moyennes pondérées (rapport « régional »).

Pour sélectionner une méthode de seuillage, la commande Fidji Image | Ajuster | Auto Threshold peut être utilisé pour essayer automatiquement toutes les méthodes Fidji intégrées. Pour évaluer la segmentation (seuillage), un masque enregistré est converti en sélection en cliquant sur Modifier | Sélection | Créer une sélection, ajouté au gestionnaire de retour sur investissement (en appuyant sur T), puis activé sur le fichier image brut. Si les mitochondries ne sont pas détectées de manière adéquate, une autre méthode de segmentation doit être tentée.

Lors de la comparaison d’images, il est essentiel d’acquérir toutes les images avec des conditions d’imagerie identiques, ainsi que d’afficher toutes les images avec une amélioration de contraste identique.

Le mouvement mitochondrial doit être pris en compte lors de l’optimisation des conditions d’imagerie. Si les mitochondries se déplacent de manière significative entre l’excitation à 405 et 488 nm, l’image du rapport ne sera pas précise. Il est recommandé de maintenir le temps d’exposition <500 ms et de modifier l’excitation par la méthode la plus rapide disponible (par exemple, une impulsion de déclenchement ou un filtre accordable acousto-optique). Lors de la capture d’une pile Z, les deux excitations doivent être effectuées pour chaque étape Z avant de passer à l’étape Z suivante.

Pour l’affichage des résultats, les changements de teinte (couleur) sont plus évidents pour l’œil humain que les changements d’intensité. Par conséquent, la valeur du rapport est convertie en une échelle de couleurs pour faciliter l’interprétation visuelle. Les images colorisées peuvent être non modulées, où tous les pixels mitochondriaux apparaissent à la même luminosité, ou modulées en intensité, où l’intensité des pixels de l’image d’origine est utilisée pour définir les intensités de l’image colorisée.

Modification et dépannage
Comme alternative à la confirmation de la fonction mitochondriale par provocation au paraquat, les cellules peuvent être répliquées ou inoculées en sources de carbone fermentescibles et non fermentescibles.

Pour la soustraction de l’arrière-plan, la soustraction de la bille roulante (en accédant à Processus | Soustraire l’arrière-plan...) Peut également être utilisé pour éliminer la non-uniformité de l’éclairage. Il faut s’assurer que la présence de cellules n’altère pas l’arrière-plan soustrait (en cochant l’option Créer un arrière-plan et en examinant le résultat).

En résumé, la sonde mtHyPer7 fournit une méthode cohérente et peu invasive pour relier l’état morphologique et fonctionnel des mitochondries de levure dans les cellules vivantes, et permet l’étude d’un important facteur de stress cellulaire et d’une molécule de signalisation dans un système modèle génétiquement traitable et facilement accessible.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Objectif 100x/1.45 Plan Apo Lambda	Nikon	MRD01905
Adénine sulfate	Sigma-Aldrich	A9126
Bacto Agar	BD Difco	DF0145170
Bacto Peptone	BD Difco	DF0118170
Bacto Tryptone	BD Difco	DF211705
Bacto Yeast Extract	BD Difco
BamHI	New England Biolabs	R0136S
BglII	New England Biolabs	R0144S
Carbenicilin	Sigma-Aldrich	C1389
Carl Zeiss Immersol Huile d’immersion	Carl Zeiss	444960
Dextrose (D-(+)-Glucose)	Sigma-Aldrich	G8270
E. cloni 10G chimique cellule compétente	Bioserch Technologies	60108
FIJI	NIH		Schindelin et al 2012
G418 (Geneticin)	Sigma-Aldrich	A1720
Filtre d’émission GFP	Chroma		525/50
Gibson	assembly New England Biolabs	E2611
Graphpad Prism 7	GraphPad		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
H2O2 (stable)	Sigma-Aldrich	H1009
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO	Pon Lab	JYE057/EP41	Liao et al 20201
Incubateur Shaker	New Brunswick Scientific	E24
KAPA HiFi PCR kit	Roche Séquençage et sciences de la vie, Kapa Biosystems, Wilmington, MA	KK1006
Chlorhydrate de L-arginine	Sigma-Aldrich	A8094
laser	Agilent		405 et 488 nm
Chlorhydrate de L-histidine	Sigma-Aldrich	H5659
L-leucine	Sigma-Aldrich	L8912
Chlorhydrate de L-lysine	Sigma-Aldrich	L8662
L-méthionine	Sigma-Aldrich	M9625
L-phénylalanine	Sigma-Aldrich	P5482
L-tryptophane	Sigma-Aldrich	T8941
L-tyrosine	Sigma-Aldrich	T8566
mHyPer7 plasmide	Cette étude	JYE116
Lamelles de microscope	ThermoScientific	3406	#1.5 (170 et micro ; m épaisseur)
Lames de microscope	ThermoScientific	3050
MitoTracker Red CM-H2Xros	ThermoFisherScientific	M7513
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix	New England Biolabs	E2621
Nikon Elements	Logiciel d’acquisition de microscope	Nikon
Microscope inversé Nikon Ti Eclipse	Nikon
Paraquat (dichlorure de méthyl viologen hydraté)	Sigma-Aldrich	Cat. 856177  ;
RStudio	Posit.co		de bureau gratuite
Spectrophotomètre	Beckman	BU530
Incubateur sur scène	Tokai Hit	INU
Uracil	Sigma-Aldrich	U1128
Base d’azote de levure (YNB) contenant du sulfate d’ammonium sans acides aminés	BD Difco	DF0919073
YN2_1_ LT58_X2site	Addgene	177705	Pianale et al 2021
Zyla 4.2 sCMOS caméra	Andor