Transformation racinaire poilue du soja pour l’analyse de la fonction génique

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la production à haute efficacité de racines velues de soja transgéniques.

Résumé

Le soja (Glycine max) est une culture précieuse en agriculture qui a des milliers d’utilisations industrielles. Les racines de soja sont le principal site d’interaction avec les microbes du sol qui forment une symbiose pour fixer l’azote et les agents pathogènes, ce qui rend la recherche sur la génétique des racines de soja d’une importance primordiale pour améliorer sa production agricole. La transformation génétique des racines velues du soja (HR) est médiée par la souche Agrobacterium rhizogenes NCPPB2659 (K599) et constitue un outil efficace pour étudier la fonction des gènes dans les racines de soja, ne prenant que 2 mois du début à la fin. Ici, nous fournissons un protocole détaillé qui décrit la méthode pour surexprimer et réduire au silence un gène d’intérêt dans les HRs de soja. Cette méthodologie comprend la stérilisation des graines de soja, l’infection des cotylédons par K599, ainsi que la sélection et la récolte de RR génétiquement transformés pour l’isolement de l’ARN et, s’il y a lieu, l’analyse des métabolites. Le débit de l’approche est suffisant pour étudier simultanément plusieurs gènes ou réseaux et pourrait déterminer les stratégies d’ingénierie optimales avant de s’engager dans des approches de transformation stables à long terme.

Introduction

Le soja (Glycine max) est l’une des cultures les plus précieuses en agriculture. Il a des milliers d’utilisations commerciales et industrielles, telles que l’alimentation, l’alimentation animale, l’huile et comme source de matières premières pour la fabrication¹. Sa capacité à former une relation symbiotique avec les microorganismes fixateurs d’azote du sol, à savoir les rhizobiums, accroît encore l’importance de l’étude de la génétique du soja². Par exemple, le réglage fin des propriétés de fixation de l’azote dans les racines de soja peut entraîner une réduction des émissions de carbone et réduire considérable....

Protocole

REMARQUE : Il est recommandé que toutes les étapes de la procédure soient effectuées dans des conditions stériles.

1. Stérilisation des semences de soja

1. Dans une enceinte de biosécurité, placer 16 à 20 graines de soja Williams 82 rondes en parfait état (c.-à-d. sans fissures ni imperfections) dans un tube à centrifuger de 50 mL.
2. Ajouter 30 mL d’alcool isopropylique à 70 %, agiter doucement pendant 30 s, puis décanter l’alcool.
3. Agiter doucement les graines avec 30 ml d’eau de Javel à 10 % pendant 10 s et laisser reposer les graines dans la solution pendant 5 minutes à température ambiante (RT, 2....

Résultats

Les résultats représentatifs proviennent des données publiées ^19,20. Les résultats de la PCR (cPCR) de la colonie K599 Agrobacterium transformée sont présentés à la figure 1. Comme l’indiquent les colonies positives de la figure 1, le gène d’intérêt a été détecté par PCR (figure 1A). Cependant, un tiers à la moitié des colonies étaient négatives pour le criblage du .......

Discussion

Au cours de la dernière décennie, la méthode HR du soja a été développée comme un outil puissant pour étudier les gènes impliqués dans la fixation de l’azote 22,23, la tolérance au stress biotique et abiotique 24,25 et les voies de biosynthèse des métabolites ^26,27. La connaissance de la façon dont les plantes produisent des métabolites présente u.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Acétosyringone	Caïman	23224
Eau de Javel	lavo	21124
DMSO	Bioréactifs Fisher	195679
Gelzan	Phytotech	HYY3251089A
Hygromycine	Phytotech	HHA0397050B
Alcool isopropylique	Fisher	206462
Kanamycin	Phytotech	SQS0378007G
LB poudre	Bioréactifs Fisher	200318
poudre MS Laboratoires	Caisson	2210001
Na2HPO4	Fisher bioréactifs	194171
NaCl	Fisher 192946
chimique Boîtes de Pétri	Fisherbrand	08-757-11	100 mm x 25 mm
Phosphinothricine	Cedarlane	P034-250MG
REDExtract-N-Amp Kit PCR	Sigma	R4775
Sucrose	Bioshop	2D76475
Timentin	Caisson labs	12222002
Vitamins	Caisson	labs 2211010

chimique