Hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour la localisation de longs ARN non codants dans les cellules d’ostéosarcome humain

Résumé

Le présent protocole décrit une méthode d’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN pour localiser les ARNlnc dans les cellules d’ostéosarcome humain.

Résumé

Les rôles importants des longs ARN non codants (ARNlnc) dans le cancer ont été étudiés, tels que la régulation de la prolifération, de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), de la migration, de l’infiltration et de l’autophagie des cellules cancéreuses. La détection de localisation des ARNlnc dans les cellules peut donner un aperçu de leurs fonctions. En concevant la séquence de chaîne antisens spécifique de l’ARNlnc suivie d’un marquage avec des colorants fluorescents, l’hybridation in situ par fluorescence de l’ARN (FISH) peut être appliquée pour détecter la localisation cellulaire des ARNlnc. Avec le développement de la microscopie, les techniques RNA FISH permettent même aujourd’hui de visualiser les ARNlnc faiblement exprimés. Cette méthode permet non seulement de détecter la localisation des ARNlnc seuls, mais aussi de détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines en utilisant l’immunofluorescence bicolore ou multicolore. Ici, nous avons inclus la procédure d’opération expérimentale détaillée et les précautions de l’ARN FISH en utilisant le gène hôte 6 (SNHG6) du petit ARN nucléolaire de l’ARN lnc dans les cellules d’ostéosarcome humain (143B) à titre d’exemple, afin de fournir une référence pour les chercheurs qui souhaitent effectuer des expériences RNA FISH, en particulier lncRNA FISH.

Introduction

Notre compréhension du génome humain a été considérablement élargie par les progrès récents de la technologie du génome entier. Environ 93 % du génome humain peut être transcrit en ARN, mais seulement 2 % des ARN peuvent être traduits en protéines ; les 98 % restants d’ARN qui n’ont pas de fonction de traduction protéique sont appelés ARN non codant (ARNnc)¹. En tant que classe d’ARN non codants (ARNnc), les ARNnc longs (ARNlnc), contenant plus de 200 nucléotides², ont attiré une attention croissante en raison de leur implication dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques des cellules, tels que la différe....

Protocole

Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole. La figure 1 montre le protocole global pour l’ARN FISH ; Le tableau 1 contient la composition de toutes les solutions et le tableau 2 contient les séquences d’amorces utilisées dans ce protocole.

1. Préparation de la sonde

1. Identifier et acquérir la séquence FASTA d’un ARNlnc cible d’intérêt, par exemple, à partir de GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). En suivant les indications sur le sit....

Résultats

Des images représentatives de SNHG6 FISH dans des cellules d’ostéosarcome humain sont présentées (Figure 2). Le contrôle négatif est traité avec la sonde Ctrl négative ; Le contrôle positif est traité avec la sonde U6 ²⁰. La sonde SNHG6 et la sonde U6 sont marquées avec Cy3, qui émet une fluorescence rouge. Le DAPI est un colorant qui colore l’ADN, qui émet une fluorescence bleue. Ce résultat montre que SNHG6 est principalement localisé dans le cytoplasme, et cette in.......

Discussion

Ce protocole RNA FISH peut non seulement détecter la localisation des ARNlnc dans les cellules, mais aussi détecter la colocalisation d’autres ARN, ADN ou protéines dans les cellules, qui peuvent également être utilisés pour détecter l’emplacement des ARNlnc dans les tissus enrobés de paraffine. Cependant, le protocole spécifique dans de tels cas est différent car les tissus enrobés de paraffine doivent être déparaffinés²¹. Cette procédure expérimentale peut être appliquée dans des plaques de 48 o.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Compteur automatique de cellules	Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd	IC1000	Comptage des cellules
Plaque de culture cellulaire-12	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	3513,corning	Placez les lamelles dans la plaque
; Lignée cellulaire (143B)	Banque de cellules de l’Académie chinoise des sciences	CRL-8303	Lignée cellulaire du cancer de l’ostéosarcome
Tube à centrifuger (15 mL, 50 mL)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	; 430790, Corning	Centrifuge les cellules
Coverslips	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	abs7026	Les cellules sont ensemencées sur les lamelles
Cy3 mark-SNHG6 Sonde d’ADN	Shanghai GenePharma Co.,Ltd	A10005	Détecter l’emplacement SNHG6
Média DMEM	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	LM-E1141	Milieu de culture cellulaire
Incubateur	à bain secHaimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	DKT200-2  ;	Incubation à différentes températures élevées
Éthanol 100 %  ;	Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd	10009218	déshydratation
Microscope à fluorescence	Shanghai Waihai Biotechnology Co., LTD	Olympus BX43 équipé d’une caméra de Olympus U-TV0.5XC-3 (SN : 5J01719),olympus	Observation et positionnement
Incubateur	Shanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD	DHP-9051	Les échantillons ont été incubés à 37 ° ;C.
Support de montage	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E675004	Fixez les lamelles à la lame
Shaker	Haimen Kylin-Bell Lab Instruments Co., Ltd.	TS-8S	Échantillon de lavage
Diapositive	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	188105	Les lamelles sont placées sur la diapositive
Triton X-100	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600198	Membrane perméable et membrane nucléaire
; Trypsine (0,25 %)	Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd	25200056, Gibco	traitement à la trypsine des cellules
Tween-20	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600560	détergent