Article de méthode

Évaluation rapide de la cytotoxicité in vitro du récepteur de l’antigène chimérique exprimant le jurkat à l’aide de l’imagerie fluorescente

DOI :

10.3791/65560

⸱

27 octobre 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Kansas Cancer Center, 2Department of Cancer Biology, University of Kansas Cancer Center, 3BioEngineering Program, University of Kansas, 4Department of Pathology and Laboratory Medicine, University of Kansas Medical Center, 5University of Kansas Cancer Center, 6Kansas Institute for Precision Medicine, University of Kansas Medical Center

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole pour évaluer la destruction quantitative des cellules tumorales par les cellules de Jurkat exprimant le récepteur de l’antigène chimérique (CAR) ciblant l’antigène tumoral unique. Ce protocole peut être utilisé comme plate-forme de criblage pour l’optimisation rapide des constructions de charnières CAR avant la confirmation dans les lymphocytes T dérivés du sang périphérique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) sont à l’avant-garde de l’oncologie. Un CAR est constitué d’un domaine de ciblage (généralement un fragment variable à chaîne unique, scFv), accompagné d’un linker intra-chaîne, suivi d’une charnière, d’une membrane et d’un domaine costimulateur. La modification du domaine de liaison intra-chaîne et de charnière peut avoir un effet significatif sur la destruction médiée par le CAR. Compte tenu des nombreuses options différentes pour chaque partie d’une construction CAR, il existe un grand nombre de permutations. La fabrication de cellules CAR-T est un processus long et coûteux, et la fabrication et le test de nombreuses constructions représentent un investissement important en temps et en matériel. Ce protocole décrit une plate-forme permettant d’évaluer rapidement les constructions CAR optimisées pour les charnières dans les cellules Jurkat (CAR-J). Les cellules Jurkat sont une lignée de lymphocytes T immortalisée avec une absorption élevée des lentivirus, permettant une transduction efficace du CAR. Nous présentons ici une plate-forme permettant d’évaluer rapidement CAR-J à l’aide d’un imageur fluorescent, suivie d’une confirmation de la cytolyse dans les lymphocytes T dérivés de PBMC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La thérapie cellulaire CAR-T s’est révélée très prometteuse dans les hémopathies malignes, comme en témoignent les 6 produits CAR-T approuvés par la FDA depuis 2017, comme l’a rapporté le National Cancer Institute1. Il existe de nombreuses cellules CAR-T dans les essais cliniques pour cibler les tumeurs solides. L’ingénierie de nouvelles cibles CAR et l’optimisation de la construction CAR sont essentielles à l’efficacité d’une cellule CAR-T. Le choix de la construction CAR idéale pour chaque application est essentiel pour cibler avec précision les antigènes associés à la tumeur (TAA) tout en évitant de faibles niveaux d’expression de TAA dans l....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Tous les travaux de culture cellulaire sont effectués dans une enceinte de sécurité biologique avec une blouse de laboratoire, des gants et en suivant les techniques aseptiques standard.

1. Génération de Jurkats exprimant le CAR (CAR-J)

  1. Achetez des cellules Jurkat, clonez E6-1 auprès d’ATCC. Décongeler 1 x 106 cellules dans une fiole T-75 et les cultiver dans des fioles T-75. Maintenez-les en suspension à raison de 0,6 x 106 cellules par ml à l’aide d’un milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) complété par 10 % de FBS dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2.<....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une plage de rapport E :T comprise entre 1 :8 et 8 :1 pour CAR-J1 a été évaluée à 72 h et ciblait l’EGFR sur les cellules TNBC MDA-MB-231. Les cellules Jurkat ont été transduites avec le lentivirus CAR avec du polybrène pour générer des cellules CAR-J comme décrit à l’étape 2. La cytotoxicité du CAR-J1 augmentait significativement avec un rapport E :T plus élevé, sans différence dans la destruction à un rapport de 1 :8 (Figure 1). Plus de 50 % des abattages ont été observés à 4 :1 E :T sur 7.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons proposé ici une méthode rapide pour évaluer efficacement l’activité cytolytique spécifique à la cible induite par l’expression de CAR dans les cellules de Jurkat. Toutes les constructions CAR ont le même scFv mais des domaines de charnière et de transmembrane différents dont il a été démontré qu’ils affectent la puissance des cellules CAR-T13. Une évaluation plus poussée de la destruction non spécifique par ces CAR-J a été effectuée en les cultivant avec des cellules knock-out antigéniq.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MDA-MB-231 était un cadeau aimable du Dr Shane Stecklein. Les auteurs reconnaissent le financement du Centre de cancérologie de l’Université du Kansas pour mener cette recherche.

....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube conique de 15 ml (stérile)Midwest Scientific#C15BTout similaire fonctionnera
Tube conique de 50 ml (stérile)Thermo Scientific339652Tout similaire fonctionnera
Plaque à 96 puits noir/transparentFalcon353219Celligo a une liste de plaques compatibles
Celigo Cytomenter d’imagerie à 4 canauxNexcelcom Bioscience200-BFFL-5CTout similaire fonctionnera
Celigo SoftwareNexcelcom BioscienceVersion 5.3.0.0Tout similaire fonctionnera
Incubateur de culture cellulaireThermo ScientificHeraCell 160iTout similaire fonctionnera
Flacons traités pour culture cellulaire (T75, différentes tailles, stériles)TPP90076Tout similaire fonctionnera
CFSETonbo13-0850-U500Tout similaire fonctionnera
Cytek Muse Cell AnalyzerCytek0500-3115Tout similaire fonctionnera
DMEMGibco11995-040Tout similaire fonctionnera
FBSGemini bio-products900-108Tout similaire fonctionnera
Cytomètre en fluxCytek, BD, etcAurora, LSR II, etcTout similaire fonctionnera
FlowJo SortwareBecton Dickinson & Société  ;Version 10.7.1Tout similaire fonctionnera
Fluorobrite DMEMGibcoA18967-01Tout similaire fonctionnera
LogicielGraphPadVersion 9.3.1 (471)Tout similaire fonctionnera
Multichanel PipetteThermo ScientificFinnpipette F2Tout similaire fonctionnera
PBSGibco10010-031Tout similaire fonctionnera
PenStrepGibco15070-063Tout similaire fonctionnera
Pointes de pipette (stériles, filtrées, 1 mL, différentes tailles)Pr1maPR-1250RK-FL, etcN’importe quel similaire fonctionnera
Pipettors  ;Thermo ScientificFinnpipette F2N’importe quelle similaire fonctionnera
PropidiumIure InvitrogenP1304MPTout similaire fonctionnera
RPMICorning10-041-cvTout similaire fonctionnera
Aide à la pipette sérologiqueDrummond Scientific4-000-105Tout similaire fonctionnera
Pipettes sérologiques (stériles, de différentes tailles)Pr1maPR-SERO-25, etcTout similaire fonctionnera
Pyruvate de sodiumCorning25-000-CITout similaire fonctionnera
Réservoirs stérilesMidwest ScientificRESE-2000Tout similaire fonctionnera
Centrifugeuse de tableEppendorf5810RTout similaire fonctionnera
.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitra, A. From bench to bedside: the history and progress of CAR T cell therapy. Front Immunol. 14, 1188049(2023).
  2. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614, 635-648 (2023).<....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cellules CAR Tcellules Jurkatcriblage haut d bitciblage de l EGFRmodification du domaine charni recellules T d riv es de PBMCplaque de 96 puitsmarquage l iodure de propidium

Articles connexes