Method Article

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

DOI:

10.3791/65605

⸱

July 28th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Abstract

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L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie intestinale grave et potentiellement mortelle qui a été difficile à étudier en raison de sa pathogenèse complexe, qui reste incomplètement comprise. La physiopathologie de la NEC comprend la perturbation des jonctions serrées intestinales, l’augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, la mort des cellules épithéliales, la dysbiose microbienne et l’inflammation déréglée. Les outils traditionnels pour étudier la NEC comprennent des modèles animaux, des lignées cellulaires et des organoïdes intestinaux humains ou murins. Bien que les études utilisant ces systèmes modèles aient amélioré la compréhension de la physiopathologie de la maladie, leur capacité à récapituler la complexité de la NEC humaine est limitée. Un modèle in vitro amélioré de NEC utilisant la technologie microfluidique, appelé NEC-on-a-chip, a maintenant été développé. Le modèle NEC-on-a-chip consiste en un dispositif microfluidique ensemencé avec des entéroïdes intestinaux dérivés d’un nouveau-né prématuré, co-cultivé avec des cellules endothéliales humaines et le microbiome d’un nourrisson atteint d’une NEC sévère. Ce modèle est un outil précieux pour les études mécanistiques sur la physiopathologie de la NEC et une nouvelle ressource pour les tests de découverte de médicaments pour les maladies intestinales néonatales. Dans ce manuscrit, une description détaillée du modèle NEC-on-a-chip sera fournie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’entérocolite nécrosante (ECN) touche les prématurés, avec une incidence allant jusqu’à 10 % chez ceux nés pesant < 1500 g1. La physiopathologie de la NEC est complexe et comprend des lésions de l’épithélium intestinal, une perturbation des jonctions intestinales serrées, une augmentation de la perméabilité de la barrière intestinale, un dérèglement immunitaire et la mort des cellules épithéliales 2,3. Notre compréhension des mécanismes impliqués dans la pathogenèse de la NEC reste incomplète et, malgré des décennies de recherche, il n’existe toujours pas de thérapies ciblées efficaces.

L’un des principaux obstacles à l’avancement de la recherche sur la NEC est la disponibilité limitée et la petite taille des tissus intestinaux primaires isolés chez les nourrissons humains. Les tissus intestinaux réséqués chez les nourrissons atteints d’ECN sont souvent nécrotiques et gravement endommagés, ce qui complique les études sur les mécanismes qui précèdent l’apparition de la maladie. Par exemple, l’intestin grêle des nourrissons atteints d’ECN est inondé de cellules immunitaires, et un nombre réduit de cellules souches intestinales, une diminution de la prolifération des cellules épithéliales et une augmentation de l’apoptose des cellules épithéliales sont également observés 4,5,6,7. Cela entraîne des difficultés à cultiver les cellules épithéliales intestinales à partir de ces échantillons et à isoler l’ARN et les protéines, qui peuvent être dégradés dans cet environnement inflammatoire hostile. De plus, étant donné que le processus de la maladie est déjà avancé chez les nourrissons atteints d’une NEC chirurgicale, les études mécanistiques sur les facteurs qui induisent la maladie sont impossibles. Ces limitations ont conduit à une dépendance à l’égard de modèles animaux pour les études mécanistiques de la NEC.

Des modèles animaux de NEC ont été établis pour les souris, les rats, les porcelets, les lapins et les babouins 5,8,9,11. L’un des points forts des modèles animaux est que la maladie intestinale de type NEC est induite par des facteurs associés à l’apparition de NEC chez l’homme, notamment un microbiome dysbiotique, des épisodes répétés d’hypoxie et l’absence d’allaitement au lait maternel 5,8,10,11. De plus, la réponse inflammatoire et les changements pathologiques observés au cours de la NEC expérimentale sont parallèles à la maladie humaine 5,9,12. Bien que ces modèles imitent de nombreuses caractéristiques de la NEC humaine, il existe des différences inhérentes entre la physiopathologie de la NEC chez les animaux et les humains. Par exemple, le modèle murin de NEC est induit chez des souris nées à terme, et bien que leur développement intestinal soit incomplet, la physiopathologie de NEC est intrinsèquement différente dans ce contexte clinique. L’expression des gènes intestinaux murins à la naissance est similaire à celle d’un fœtus humain préviable et ne se rapproche pas de celle d’un nouveau-né prématuré de 22 à 24 semaines de gestation jusqu’au jour 14 (P14)13. Cela confond le modèle NEC murin parce que les lésions intestinales ne peuvent généralement pas être induites chez les souris après P10. De plus, les souches consanguines de souris n’ont pas la diversité immunologique14 et microbiologique des nouveau-nés humains15, ce qui constitue un autre facteur de confusion. Ainsi, l’incorporation accrue d’échantillons humains primaires dans la recherche NEC améliore la pertinence clinique des études dans ce domaine.

Les études sur les mécanismes de la NEC in vitro ont traditionnellement utilisé des lignées cellulaires monotypiques dérivées de cellules cancéreuses intestinales adultes, telles que les cellules d’adénocarcinome colorectal (Caco2) et d’adénocarcinome du côlon humain (HT-29)16. Ces modèles sont pratiques, mais limités en pertinence physiologique en raison de leur croissance à partir de cellules cancéreuses adultes, de leur architecture non polarisée et des changements phénotypiques liés à des passages répétés en culture. Les entéroïdes intestinaux améliorent ces modèles puisqu’ils peuvent être cultivés à partir des cryptes du tissu intestinal, différenciés en tous les sous-types épithéliaux intestinaux et former une structure tridimensionnelle (3D) semblable à des villosités17,18,19,20. Récemment, les entéroïdes intestinaux ont été combinés à la technologie microfluidique pour développer un modèle d’intestin grêle sur puce et fournir un système modèle in vitro plus pertinent sur le plan physiologique21.

Les premiers dispositifs microfluidiques d’organes sur puce ont été introduits au début des années2000 22,23,24. Le premier modèle d’organe sur puce était le poumon sur puce à respiration humaine25. Il a été suivi par de nombreux modèles mono-organes tels que l’intestin 21, le foie 26, les reins 27, la moelle osseuse 28, la barrière hémato-encéphalique 29 et le cœur30. Ces modèles d’organes sur puce ont été utilisés pour étudier les maladies aiguës, chroniques et rares, notamment le syndrome d’irradiation aiguë31, la bronchopneumopathie chronique obstructive32 et les maladies neurodégénératives33. La nature polarisée des cellules sur ces puces et la présence de deux compartiments cellulaires séparés par une membrane poreuse permettent de modéliser des processus physiologiques complexes tels que la perfusion, les gradients de concentration chimique et la chimiotaxie des cellules immunitaires34,35. Ces systèmes microfluidiques constituent ainsi un nouvel outil pour l’étude de la physiopathologie et des mécanismes des maladies humaines.

Le modèle de l’intestin grêle sur puce a été décrit par Kasendra et al. en 2018, qui ont utilisé des échantillons de biopsie de l’intestin grêle pédiatriques (âgés de 10 à 14 ans) différenciés en entéroïdes et cultivés sur un dispositif microfluidique21. Les cellules endothéliales vasculaires, l’écoulement continu des milieux et l’étirement/relaxation ont également été incorporés dans ce modèle. Ils ont observé la différenciation des sous-types épithéliaux intestinaux, la formation d’axes 3D en forme de villosités, la production de mucus et les modèles d’expression des gènes de l’intestin grêle21. Ce modèle microfluidique a été appliqué aux maladies néonatales avec le développement du système NEC-on-a-chip, qui intègre les entéroïdes intestinaux néonatals, les cellules endothéliales et le microbiome d’un nouveau-né atteint de NEC36. La NEC sur puce récapitule de nombreuses caractéristiques essentielles de la NEC humaine, notamment l’expression des gènes inflammatoires, la perte de cellules épithéliales spécialisées et la réduction de la fonction de barrière intestinale36. Ainsi, ce modèle a de nombreuses applications dans l’étude de la NEC, y compris les études mécanistiques et la découverte de médicaments. Dans ce manuscrit, un protocole détaillé pour les performances du modèle NEC-on-a-chip est fourni.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les entéroïdes ont été obtenus à partir d’échantillons de l’intestin grêle de nourrissons prématurés (nés entre 22 et 36 semaines de gestation) obtenus au moment de la chirurgie pour une NEC ou d’autres affections intestinales d’étiologies non inflammatoires. Tous les prélèvements et traitements d’échantillons ont été effectués après le consentement éclairé et l’approbation des comités d’examen institutionnels de l’Université Washington à St. Louis (numéros de protocole 201706182 et 201804040 de l’IRB) et de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (numéro de protocole IRB 21-3134).

1. Isolement et placage de cryptes de l’intestin grêle néonatal humain pour établir des entéroïdes

  1. Préparation des supports
    1. Préparez tous les supports requis comme décrit dans le tableau 1. S’assurer que la technique aseptique est utilisée pour la préparation de tous les milieux. Filtrer le milieu de stérilisation à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et le conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Laver et hacher les tissus intestinaux
    1. Placez l’hydrogel de matrice de culture cellulaire sur de la glace pour le décongeler. Prélever des tissus intestinaux humains dans la salle d’opération. Placer immédiatement l’échantillon dans 5 mL de milieu de lavage de tissus glacé pour inactiver les protéases endogènes.
    2. Rincez le contenu intestinal avec la solution saline tamponnée au phosphate (D-PBS) de Dulbecco glacée à l’aide d’une seringue de 10 ml munie d’un embout de pipette P1000 coupé. Transférer le tissu intestinal dans une boîte de 35 mm contenant 5 mL de D-PBS glacé.
    3. Coupez le tissu intestinal longitudinalement pour exposer la lumière et coupez-le en petits morceaux à l’aide de ciseaux fins. Rincez les tissus intestinaux en les agitant doucement dans le D-PBS dans la boîte de culture tissulaire.
    4. Transférer les fragments de tissu dans un plat propre de 35 mm. Hacher le tissu avec des ciseaux fins. La taille optimale est de 0,5 cm2 par pièce. Le tissu intestinal doit passer à travers un embout de pipette de 1 mL coupé.
  3. Dissocier le tissu intestinal
    1. Ajouter 1 mL de collagénase I préchauffée au tissu. Mélanger le tissu avec la collagénase en pipetant 10 à 15 fois et transférer dans un tube conique de 15 ml.
    2. Fixez le tube horizontalement sur un agitateur réglé à 50 tr/min. Agiter pendant 20 min à température ambiante.
    3. Après l’incubation, retirez les tubes de l’agitateur et remettez la solution en suspension en pipetant 10 à 15 fois. Facultatif : Retirez une petite aliquote pour vérifier la présence de cryptes uniques à l’aide de la microscopie à contraste de phase.
  4. Isolement des cryptes intestinales
    1. Filtrer les cryptes à travers une crépine de 70 μm dans un tube conique de 50 ml sur de la glace. Lavez la passoire avec 9 mL de tissu de lavage glacé. Transférer le filtrat dans un tube conique de 15 mL.
    2. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C, et retirer délicatement le surnageant. Il restera environ 200 μL de média dans le tube. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de l’intermédiaire de lavage glacé.
    3. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C. Remettre la pastille en suspension dans 1 mL de milieu de lavage de tissu et la transférer dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
    4. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cryptes. Aspirer soigneusement et complètement le surnageant autant que possible à l’aide d’une pipette. Placez le tube sur de la glace.
  5. Placage des cryptes intestinales
    1. Remettre en suspension la pastille dans de l’hydrogel de matrice de culture cellulaire (20 μL/puits d’une plaque de culture tissulaire à 48 puits) à l’aide d’une pointe de pipette pré-refroidie pour faire une suspension homogène des cryptes pendant que le tube reste sur la glace. Évitez de faire des bulles lors du pipetage. Gardez le tube sur de la glace jusqu’à ce qu’il soit prêt à être utilisé.
      REMARQUE : L’hydrogel de la matrice de culture cellulaire polymérise à des températures supérieures à 8 °C. Les cryptes isolées d’un morceau de tissu intestinal de 0,5 cm à 1 cm de longueur sont généralement plaquées dans 10 puits d’une plaque de culture tissulaire à 48 puits.
    2. Plaquer la suspension d’hydrogel de la crypte/matrice de culture cellulaire dans une plaque de culture tissulaire préchauffée à 48 puits. Réchauffez la plaque pour faciliter la solidification de la matrice. Placez la suspension au centre du puits. Évitez les bulles lors du dressage.
    3. Incuber les plaques pendant 20 min à 37 °C pour polymériser la matrice. Il est essentiel que l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire polymérise complètement avant d’ajouter le milieu.
    4. Une fois la matrice polymérisée, ajouter 300 μL de média préchauffé conditionné à 50 % de L-WRN dans chaque puits. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2.
    5. Changez de support tous les 2 à 3 jours. Remplacez-les par un média chaud conditionné à 50 % de L-WRN. Passage tous les 7 à 10 jours. Entéroïdes de passage lorsqu’ils sont confluents à 50 % à 90 % et présentent une formation de bourgeons.
      REMARQUE : Le support peut avoir besoin d’être changé plus fréquemment s’il devient jaune. La fréquence de passage dépendra de la densité d’entéroïdes et du taux de croissance des cellules d’un patient particulier. Les entéroïdes devront être évacués si leur centre devient sombre en apparence.
  6. Passage des entéroïdes
    1. Aspirez doucement le milieu des puits. Lavez soigneusement les puits avec 500 μL de D-PBS chaud. Veillez à ne pas perturber la matrice.
    2. Ajouter 250 μL de solution de récupération des cellules froides dans chaque puits. Grattez le fond de chaque puits avec une pointe de pipette neuve pour perturber l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire. Incuber l’assiette sur de la glace pendant 30 min.
    3. Dissocier les entéroïdes par pipetage vigoureux (~25-50 fois avec la pipette P200) et ajouter 500 μL de milieu de lavage des tissus.
    4. Transférez la suspension entéroïde dans un tube de 15 mL et ajoutez 5 mL supplémentaires de milieu de lavage à froid pour les tissus. Pipeter doucement pour former une solution homogène.
    5. Centrifuger à 400 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les entéroïdes. Placez le tube sur de la glace et aspirez le surnageant aussi complètement que possible. Il restera environ 30 à 60 μL dans le tube.
      REMARQUE : S’il y a des difficultés à briser les entéroïdes avec le pipetage, une trypsine-EDTA à 0,25% ou un réactif de dissociation enzymatique peut être utilisé pour faciliter ce processus.
    6. Remettre en suspension les entéroïdes dans le volume résiduel du milieu de lavage à l’aide d’une pipette P200. Évitez la formation de bulles pendant le pipetage.
    7. Ajouter 20 μL d’hydrogel de matrice de culture cellulaire par nouveau puits d’une plaque à 48 puits à la suspension entéroïde. Divisez les entéroïdes 1 :3, 1 :4 ou 1 :5, en fonction de leur densité.
    8. Ajoutez la suspension à une plaque préchauffée à 48 puits. Incuber la plaque à 37 °C pendant 20 min pour solidifier la matrice.
    9. Après la polymérisation, ajouter 300 μL de milieu préchauffé conditionné à 50 % de L-WRN dans chaque puits. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2.

2. Modèle d’intestin néonatal sur puce

REMARQUE : Pour des instructions détaillées sur la manipulation des puces microfluidiques et l’utilisation de cet équipement, veuillez consulter le protocole de culture de la puce intestinale du duodénumdu fabricant 37.

  1. Préparation des supports
    1. Préparez tous les supports requis comme décrit dans le tableau 2. Assurez-vous que la technique d’asepsie est utilisée. Filtrer le milieu de stérilisation à l’aide d’un filtre de 0,2 μm et le conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Jour (-3) : Décongélation et expansion des cellules endothéliales microvasculaires intestinales humaines (HIMEC)
    1. Décongeler un flacon d’HIMEC et une plaque selon les recommandations du fabricant.
    2. Enduire une fiole de 25 cm 2 d’une solution d’enrobage à base de gélatine pendant2 min. Retirez l’excédent de solution. Ajouter des HIMEC (environ 0,5-1 x 106 cellules) remis en suspension dans 6 mL de milieu HIMEC dans le flacon. Incuber à 37 °C, 5 % de CO2.
    3. Changez le support HIMEC toutes les 48 h. Ajouter les HIMEC dans le canal endothélial (inférieur) de la puce dans les 48 à 72 heures suivant la confluence à 100 %.
  3. Jour (-1) : Activation et enrobage des puces avant l’ajout des entéroïdes
    1. Reconstituer la poudre de réactif d’activation de puce 1 (CR-1) pour obtenir une solution de CR-1. Assurez-vous que la poudre CR-1 et la solution de réactif d’activation de puce 2 (CR-2) sont à température ambiante pour cette étape.
      REMARQUE : Gardez la poudre de CR-1 et la solution de CR-1 qui est préparée dans les étapes suivantes à l’abri de la lumière à tout moment. La lumière doit être éteinte dans le capot pour ces étapes.
      1. Placez la puce et le support de puce dans le support de puce, puis placez-les dans une boîte de culture tissulaire dans la hotte de culture cellulaire. Voir le protocole du fabricant pour la technique appropriée pour le placement des copeaux dans le support37.
      2. Ajouter 1 mL de solution de CR-2 dans le flacon de poudre de CR-1, puis transférer directement la solution du flacon de poudre de CR-1 dans un tube de 15 mL enveloppé dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Ne mélangez pas la solution avec la pipette. L’objectif est d’éviter la formation de bulles.
      3. Ajouter 1 mL de solution de CR-2 dans le flacon de CR-1 et transférer dans le tube de 15 mL. Répétez l’opération pour un total de 4 rinçages et un total de 4 mL de CR-2 rincé dans le flacon de CR-1. Ajoutez le bouchon dans le flacon et retournez-le pour le dernier rinçage afin d’éliminer tout résidu de poudre.
      4. Ajouter 6 mL supplémentaires de CR-2 dans le tube de 15 mL contenant du CR-1 pour obtenir un volume final de 10 mL (0,5 mg/mL). Mélangez cette solution à l’aide d’une pipette sans introduire de bulles. Assurez-vous que CR-1 est complètement dissous avant de passer à l’étape suivante.
    2. Ajout de la solution CR-1 à la puce
      REMARQUE : Il est essentiel d’éviter d’introduire des bulles dans les canaux lors de l’ajout de ces solutions. La solution CR-1 doit rester à l’abri de la lumière pendant cette étape.
      1. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, ajouter 20 μL de solution de CR-1 à l’entrée du canal inférieur jusqu’à ce que la solution commence à sortir de la sortie du canal inférieur. Ajouter 50 μL de solution de CR-1 par l’entrée du canal supérieur jusqu’à ce que la solution commence à sortir de la sortie du canal supérieur. Retirez tout excès de solution CR-1 de la surface de la puce par aspiration douce.
        REMARQUE : Les solutions doivent toujours être ajoutées au canal inférieur avant le canal supérieur. Si des bulles sont observées, rincer les deux canaux avec la solution CR-1 et répéter 2.3.2.1.
      2. Si le couvercle de la boîte de culture tissulaire contenant les copeaux est en place, retirez-le pour cette étape. Placez les copeaux sous la lumière UV pendant 15 min. Retirez CR-1 des canaux supérieur et inférieur.
      3. Répétez les étapes 2.3.2.1 à 2.3.2.2 pour un total de deux étapes d’activation UV. Après cette étape, les puces ne sont plus sensibles à la lumière.
      4. Retirez CR-1 des canaux supérieur et inférieur. Laver les deux canaux avec 100 μL de solution CR-2. Retirez la solution CR-2 des canaux supérieur et inférieur.
      5. Laver les deux canaux avec 100 μL de D-PBS stérile. Répétez les lavages 2x. Ajoutez 100 μL de D-PBS aux deux canaux. Retirez l’excédent de la surface des copeaux mais laissez les canaux pleins.
    3. Enduisez les canaux avec la matrice extracellulaire.
      1. Décongelez la fibronectine, le collagène IV et l’hydrogel de matrice de culture cellulaire sur de la glace immédiatement avant cette étape et conservez ces solutions sur de la glace pour le reste de cette section.
      2. Préparez les solutions de matrice extracellulaire (MEC) suivantes pour les canaux supérieur et inférieur de la puce :
        Canal supérieur : 100 μL de 200 μg/mL de collagène de type IV et 100 μg/mL d’hydrogel de matrice de culture cellulaire dans du D-PBS par puce.
        Canal inférieur : 100 μL de 200 μg/mL de collagène de type IV et 30 μg/mL de fibronectine dans le D-PBS par puce.
      3. Retirez complètement le D-PBS des canaux supérieur et inférieur. Ajoutez 50 μL d’ECM à l’entrée du canal inférieur jusqu’à ce qu’une goutte apparaisse à la sortie. Répétez l’opération pour le canal supérieur. Assurez-vous d’utiliser les solutions ECM appropriées pour chaque canal et ajoutez d’abord la solution au canal inférieur.
      4. Ajoutez le D-PBS dans le réservoir du berceau de la puce et replacez le couvercle sur la plaque de culture tissulaire. Placez les copeaux dans un incubateur humidifié à 37 °C et contenant 5 % de CO2 pendant la nuit.
  4. Jour (0) : Ensemencement de puces avec des HIMEC et des entéroïdes
    1. Équilibrage sous vide des fluides
      1. Ajouter le volume requis de milieu HIMEC et de milieu d’expansion à copeaux, pour terminer l’expérience, dans un tube conique stérile de 50 ml. Équilibrer le milieu à 37 °C dans un bain-marie pendant au moins 1 h.
      2. Raccordez le dispositif de filtration sous vide à des tubes de 50 ml contenant un média réchauffé. Les tubes doivent être orientés avec le média préchauffé au fond du tube conique de 50 ml. Vide à -70 kPa ou plus pendant 10 s.
      3. Retournez les tubes de manière à ce que le média se déplace à travers le filtre. Continuez à aspirer pendant 5 min. Une fois la filtration sous vide terminée, retirez le dispositif de filtration sous vide et placez les tubes de 50 ml contenant le milieu dans l’incubateur à 37 °C.
    2. Lavage des copeaux
      1. Laver le canal endothélial en rinçant avec 100 μL de média HIMEC préchauffé.
        Laver le canal épithélial en rinçant avec 100 μL de fluide d’expansion à copeaux préchauffés. Retirez tout support qui s’est répandu sur la surface des copeaux.
      2. Répétez l’étape de lavage. Le support doit rester dans les canaux ainsi que dans les orifices d’entrée et de sortie après ces chasses d’eau. Replacez le couvercle de la boîte de culture contenant les copeaux et remettez-les dans l’incubateur jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être utilisés.
    3. Récolte d’HIMEC
      1. Aspirer le milieu à partir de la fiole de 25 cm2 contenant les HIMEC. Lavez délicatement la monocouche avec du D-PBS. Ajouter 2 mL de trypsine-EDTA préchauffée à 0,05 % dans le flacon et rincer doucement sur la monocouche.
      2. Incuber le ballon à 37 °C pendant 2 à 5 min. Neutraliser la trypsine avec 10 mL de milieu HIMEC. Remettre les cellules en suspension dans un milieu et les transférer dans un tube de 15 ml.
      3. Essorer au niveau des cellules 150 x g pendant 5 min. à 4 °C. Remettre en suspension des cellules dans 200 μL de milieu HIMEC.
      4. Retirez 10 μL de cellules et placez le tube sur de la glace. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules automatisé. La concentration souhaitée d’HIMEC est de 6 x 106 à 8 x 106 cellules/mL.
    4. Ensemencement d’HIMEC sur la puce
      1. Retirez la puce de l’incubateur et amenez-la dans la hotte. Aspirez tout support qui aurait pu fuir à la surface de la puce.
      2. Rincez le canal épithélial (supérieur) de la puce avec 100 μL de milieu d’expansion de puce préchauffé. Rincer le canal endothélial (inférieur) de la puce avec 100 μL de milieu HIMEC préchauffé.
      3. Remettre délicatement en suspension les HIMEC pour obtenir une distribution homogène. Retirez complètement le milieu du canal endothélial (inférieur). Ajouter 10 μL d’HIMECs (~36 000 cellules/puce) dans le canal endothélial (inférieur).
        REMARQUE : S’il est difficile de remplir le canal HIMEC sans formation de bulles lors de l’utilisation de 10 μL d’HIMEC, augmenter le volume de cellules ajoutées. Il doit s’agir du même nombre de cellules par puce.
      4. Ajouter un milieu de croissance organoïde supplémentaire au canal épithélial (supérieur) s’il n’est pas plein. Vérifier la densité de semis des HIMEC. S’ils ne sont pas répartis uniformément et ne couvrent pas 80 à 90 % de la surface des copeaux, rincez le canal et répétez l’ensemencement.
      5. Retournez la puce dans le berceau de la puce dans la boîte de culture cellulaire. Ajoutez le D-PBS dans le réservoir du support de la puce. Replacez le couvercle de la boîte de culture cellulaire et placez-le dans l’incubateur.
      6. Laissez la puce inversée à 37 °C pendant 2 à 3 h pour permettre aux HIMEC de se fixer à la membrane de la puce. Une fois l’incubation terminée, remettez la puce/le berceau de la puce en position verticale.
      7. Lavez délicatement le canal endothélial (inférieur) avec 100 μL de milieu HIMEC chaud. Laissez le média dans le canal. Lavez délicatement le canal épithélial (supérieur) avec 100 μL de milieu de croissance organoïde. Laissez le média dans le canal.
      8. Remettez les copeaux dans l’incubateur à 37 °C tout en effectuant les étapes suivantes.
    5. Récolte des entéroïdes et semis sur puce
      REMARQUE : Les copeaux sont ensemencés avec des entéroïdes qui ont été divisés 10 à 14 jours auparavant, qui sont confluents à 50 % à 75 % et qui se trouvent aux passages 7 et 20. Veuillez consulter la figure 2 pour l’apparition d’entéroïdes au jour 0. Le temps nécessaire pour que les entéroïdes soient prêts pour l’ensemencement dépendra du taux de croissance des cellules d’un patient particulier.
      1. Aspirez doucement le milieu des puits. Lavez soigneusement les puits contenant de l’hydrogel de matrice de culture cellulaire avec 500 μL de D-PBS chaud. Veillez à ne pas perturber l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire.
      2. Ajouter 250 μL de solution de récupération des cellules froides dans chaque puits. Grattez le fond de chaque puits avec une pointe de pipette neuve pour perturber l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire. Ajouter le contenu des puits dans un tube froid de 15 ml sur de la glace.
      3. Incuber le tube sur de la glace pendant 45 min et le retourner toutes les 3-5 min. Au cours de cette étape, préparez les milieux de dissociation entéroïde. Placez ce milieu dans le bain-marie à 37 °C lorsqu’il reste 10 min dans l’étape d’incubation.
      4. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les entéroïdes. Retirez le surnageant.
      5. Ajouter 2 mL de milieu de dissociation entéroïde par plaque récoltée à la pastille et placer dans un bain-marie à 37 °C pendant 60 à 120 s. Agitez doucement le tube pendant l’incubation. Incuber suffisamment longtemps pour obtenir des entéroïdes fragmentés, mais sans dissociation en une seule suspension cellulaire.
      6. Après l’incubation, ajouter 10 mL de média de lavage de tissus froids dans chaque tube de 15 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les entéroïdes. Aspirer complètement le surnageant.
      7. Remettre la pastille en suspension dans 200 μL de milieu d’expansion à copeaux. Dissocier les entéroïdes par pipetage vigoureux (~25-50 fois avec la pipette P200).
      8. Combinez les cellules dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 ml. Pipeter doucement pour former une solution homogène. L’objectif est d’ensemencer la puce avec des entéroïdes fragmentés en petits groupes de 10 à 30 cellules.
      9. Retirer 10 μL de suspension cellulaire pour le comptage. Placez la suspension cellulaire restante sur de la glace. Ajustez le volume du média d’expansion de la puce pour obtenir une concentration de 6 x 106 cellules/mL.
        REMARQUE : Il peut être nécessaire de centrifuger les entéroïdes et de les remettre en suspension dans un plus petit volume de milieu pour obtenir la densité requise.
      10. Amenez les puces microfluidiques dans le capot et aspirez le milieu à partir du canal épithélial (supérieur) de la puce. Chargez le canal supérieur de la puce avec 30 μL de cellules remises en suspension (~180 000 cellules/puce). Assurer une couverture complète et uniforme du canal épithélial de la puce pour la formation d’une monocouche. Si ce n’est pas le cas, rincez les entéroïdes à travers la puce et réensemencez-les.
        REMARQUE : S’il est difficile d’obtenir une suspension uniforme lors du chargement de plusieurs copeaux, les entéroïdes peuvent être séparés en aliquotes de 40 μL dans des tubes de microcentrifugation individuels de 1,5 mL. Cela minimisera la variabilité du nombre d’entéroïdes et de la taille des fragments au fur et à mesure du chargement.
      11. Remettez les copeaux dans le berceau de la boîte de culture cellulaire (s’ils ont été retirés). Ajoutez le D-PBS dans le réservoir du support de la puce. Replacez le couvercle de la boîte de culture cellulaire et placez les copeaux à 37 °C, 5 % de CO2 pendant la nuit.
  5. Jour (1) : Préparation des gousses et introduction de l’écoulement dans les croustilles
    1. Amenez les copeaux dans la hotte de culture tissulaire. Rincez doucement le canal épithélial deux fois avec 100 μL de produit d’expansion à copeaux. Rincer doucement le canal endothélial deux fois avec 100 μL de milieu HIMEC. Retirez l’excédent de support de la surface des copeaux.
    2. Amorcez les dosettes et régulez-les selon le protocole du fabricant37. Ajouter 2 mL de média approprié dans les réservoirs d’entrée. Ajouter 300 μL du média approprié dans les réservoirs de sortie. Le débit sera de 30 μL/h. L’étirement ne sera pas encore lancé.
  6. Jour (2) : Suivi du développement des monocouches et de l’évolution des milieux
    1. Mettez le module de culture en pause et amenez les gousses dans la hotte.
    2. Inspectez les copeaux et les gousses pour voir s’il y a des bulles. Examinez la monocouche épithéliale à l’aide d’un microscope à contraste de phase. Capturez des images à des endroits cohérents sur la puce pour suivre la progression. Imagez les puces pendant qu’elles restent dans les gousses.
    3. Retirez le média des réservoirs d’entrée du canal supérieur et remplacez-le par 2 mL de média de différenciation des copeaux. Ajouter 1 mL de média HIMEC dans le réservoir d’entrée du canal inférieur. Laissez suffisamment de média dans les réservoirs d’entrée pour vous assurer que le fond du réservoir reste recouvert d’une fine couche de média.
    4. Remettez les gousses dans le module de culture et redémarrez le débit à 30 μL/h.
  7. Jour (3) : Surveillance du développement de la monocouche, lancement de l’étirement et ajout de milieux
    1. Répétez les étapes 2.6.1.1. et 2.6.1.2. Ajouter 1 mL de média de différenciation des copeaux dans le réservoir d’entrée du canal supérieur et ajouter 1 mL de média HIMEC dans le réservoir d’entrée du canal inférieur.
      REMARQUE : Retirez le média des réservoirs de sortie des deux canaux une fois qu’ils commencent à atteindre 50 à 75 % de leur capacité.
    2. Remettez les gousses dans le module de culture. Redémarrez l’écoulement à 30 μL/h et initiez l’étirement à 2 % de contrainte et à une fréquence de 0,2 Hz.
  8. Jour (4) : Surveillance du développement de la monocouche, augmentation de l’étirement et ajout de milieux
    1. Répétez les étapes 2.6.1.1. et 2.6.1.2. Ajouter 1 mL de média de différenciation des copeaux dans le réservoir d’entrée du canal supérieur et ajouter 1 mL de média HIMEC dans le réservoir d’entrée du canal inférieur.
      REMARQUE : Retirez le média des réservoirs de sortie des deux canaux une fois qu’ils commencent à atteindre 50 à 75 % de leur capacité.
    2. Remettez les gousses dans le module de culture. Redémarrez le débit à 30 μL/h et augmentez l’étirement à 10 % de contrainte et à une fréquence de 0,2 Hz.
  9. Jour (5) à Jour (7) : Surveillance du développement des monocouches et ajout de milieux
    1. Répétez les étapes 2.6.1.1. et 2.6.1.2. Ajouter 1 mL de média de différenciation des copeaux dans le réservoir d’entrée du canal supérieur et ajouter 1 mL de média HIMEC dans le réservoir d’entrée du canal inférieur.
    2. Remettez les gousses dans le module de culture, puis redémarrez le flux et l’étirement. Une fois que les axes en forme de villosités sont visualisés, passez au modèle NEC-on-a-chip.

3. Modèle NEC-on-a-chip

  1. Culture de bactéries intestinales
    REMARQUE : Cette étape nécessite un stock congelé pré-titré de bactéries entériques d’un patient atteint d’ECN qui est préparé avant le début de ce protocole. Pour ces expériences, une suspension de bactéries entériques polymicrobiennes précédemment décrite provenant d’un patient atteint d’une NEC chirurgicale sévère a été utilisée38.
    1. Préparez un bouillon de glycérol à 50 % de bactéries entériques et conservez-le au congélateur à -80 °C jusqu’à nouvel usage.
    2. Décongeler une aliquote de la bactérie intestinale et inoculer 10 μL dans 3 mL de milieu Luria-Bertani (LB). Incuber à 37 °C avec agitation à 150 tr/min pendant la nuit.
    3. Le même jour, laver délicatement les canaux avec 100 μL de milieu de différenciation des copeaux préchauffés sans antibiotiques (canal supérieur) ou 100 μL de milieu HIMEC préchauffé sans antibiotiques (canal inférieur). Aspirez complètement le médium et répétez la chasse d’eau pour un total de 3 lavages.
    4. Après avoir aspiré le troisième lavage, replacez le support dans les canaux et laissez-le en place.
    5. Rincez les réservoirs d’entrée des canaux supérieur et inférieur avec du D-PBS stérile, puis remplissez-les de 3 mL du milieu sans antibiotiques approprié. Amorcez les gousses et régulez comme indiqué en 2.5.2.
    6. Remettez la puce dans le module de culture et relancez l’étirement et l’écoulement.
    7. Le lendemain matin, prélevez 1 mL de la culture bactérienne pendant la nuit et inoculez-la dans 25 mL de milieu LB frais.
    8. Remettez cette nouvelle culture dans l’agitateur à 37 °C jusqu’à ce que le diamètre extérieur600 atteigne 0,6 ± 0,02 mesuré à l’aide d’une cuvette de 1 cm. Diluer la culture bactérienne à 7 x 108 unités formant colonie/mL dans un milieu d’expansion à copeaux sans antibiotiques.
    9. Conservez une aliquote de cette culture pour confirmer la concentration de l’inoculum39. Il peut être nécessaire d’ajuster la concentration de la bactérie en fonction de la réponse de l’épithélium.
    10. Retirez le milieu du canal épithélial (supérieur). Ajouter 30 μL de culture bactérienne diluée dans un milieu d’expansion de puce sans antibiotiques dans le canal supérieur de la puce. Soyez très prudent pour éviter la contamination croisée du canal HIMEC (endothélial) avec des bactéries. Retirez tout support supplémentaire de la surface de la puce.
    11. Laisser les puces dans des conditions statiques pendant 30 minutes pour faciliter l’adhérence bactérienne à la face apicale de l’épithélium néonatal. Après l’incubation, rincez le canal supérieur avec 100 μL de milieu d’expansion sans antibiotiques pour éliminer les bactéries non attachées. Remettez les copeaux dans le module de culture et relancez l’étirement et l’écoulement.
    12. Toutes les 24 h, retirez les dosettes du module de culture et rincez lentement 100 μL de milieu d’expansion de puce sans antibiotique à travers le canal épithélial. Cela aidera à prévenir la prolifération bactérienne.

4. Test de perméabilité intestinale

REMARQUE : Cela peut être effectué à n’importe quelle étape du protocole. S’il est initié au moment de l’ensemencement des copeaux, le test de perméabilité intestinale peut être utilisé pour évaluer en série la confluence monocouche. S’il est initié lors de l’ajout de bactéries intestinales, ce test peut être utilisé pour déterminer l’influence des bactéries intestinales sur l’intégrité de la monocouche épithéliale intestinale.

  1. Retirez le milieu du réservoir d’entrée pour le canal épithélial (supérieur). Ajouter le substrat approprié contenant un colorant perméable (50 μg/mL) dans le réservoir d’entrée. Utilisez un milieu de différenciation de puce sans antibiotiques pour le modèle NEC-on-a-chip.
  2. Recueillir les effluents des canaux épithéliaux et endothéliaux toutes les 24 h. Quantifier la concentration du colorant de perméabilité à l’aide d’un lecteur de microplaques selon Lanik et al.36.

5. Immunohistochimie

  1. Lavez délicatement le canal inférieur et le canal supérieur de la puce avec 200 μL de D-PBS. Aspirez complètement le D-PBS des canaux.
  2. Fixez les cellules en rinçant les deux canaux avec 4% de paraformaldéhyde, en laissant la solution dans les canaux. Aspirer l’excédent de la surface des copeaux. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
  3. Laver les deux canaux avec 200 μL de D-PBS. Laissez le D-PBS dans le canal inférieur et retirez-le complètement du canal supérieur.
  4. Perméabiliser la couche épithéliale en rinçant le canal supérieur avec 100 μL de solution détergente à 0,1 %, en laissant la solution dans les canaux. Aspirer l’excédent de la surface des copeaux et incuber à température ambiante pendant 45 minutes.
  5. Laver les deux canaux avec 200 μL de D-PBS. Laissez le D-PBS dans le canal inférieur et retirez-le complètement du canal supérieur.
  6. Ajouter 10 % de sérum d’ânesse (ou un agent bloquant approprié) dans le canal supérieur pendant 1 h à température ambiante. Laver les deux canaux avec 200 μL de D-PBS. Laissez le D-PBS dans le canal inférieur et retirez-le complètement du canal supérieur.
  7. Diluer les anticorps primaires dans du sérum d’âne à 5 % et les ajouter au canal supérieur de la puce (les anticorps et les concentrations précédemment testés sont disponibles dans Lanik et al.36). Incuber à 4 °C pendant la nuit.
  8. Lavez les deux canaux 3 fois avec 200 μL de D-PBS. Laissez le D-PBS dans le canal inférieur et retirez-le complètement du canal supérieur.
  9. Diluer des anticorps secondaires marqués par fluorescence dilués 1 :200 dans du sérum d’âne à 5 % dans du D-PBS et du Hoechst 33342 ou du DAPI (colorants nucléaires). Ajoutez des anticorps secondaires au canal supérieur de la puce. Incuber à température ambiante pendant 1 h, à l’abri de la lumière.
  10. Lavez les deux canaux 3 fois avec 200 μL de D-PBS. Laissez les canaux remplis de D-PBS après le lavage final. Placez la puce dans une boîte d’imagerie avec D-PBS pour l’acquisition d’images par microscopie confocale.
    REMARQUE : Les copeaux fixes, colorés ou non, peuvent être conservés à 4 °C jusqu’à 1 semaine dans du PBS. Assurez-vous que les canaux ne s’assèchent pas pendant cette période.

6. Isolement de l’ARN, préparation de l’ADNc et PCR quantitative en temps réel

  1. Lavez délicatement le canal inférieur et le canal supérieur de la puce avec 200 μL de D-PBS. Aspirez complètement le D-PBS des canaux.
  2. Extraire l’ARN total des cellules à l’aide d’un réactif d’extraction d’ARN selon les instructions du fabricant. Pour isoler l’ARN de l’épithélium uniquement, perfusez uniquement par le canal supérieur.
  3. Quantifier la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre nano-volume. Transcrire inversement 1 μg d’ARN total. Effectuez une PCR quantitative en temps réel. Les apprêts précédemment utilisés dans ce modèle sont disponibles dans Lanik et al. 36.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des entéroïdes ont été ensemencés sur le dispositif microfluidique (Figure 1) et mis en culture comme décrit ci-dessus. La croissance des entéroïdes dans l’hydrogel de la matrice de culture cellulaire avant l’ensemencement, puis l’expansion subséquente de la monocouche de cellules épithéliales intestinales après l’ensemencement du dispositif ont été surveillées par microscopie à fond clair (Figure 2). Une monocouche de cellules épithéliales intestinales confluen...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce système NEC-on-a-chip est un nouvel outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser la physiopathologie de la NEC. Cette plate-forme fournit un microenvironnement complexe qui ressemble plus étroitement au milieu intestinal in vivo que les modèles précédents en incorporant un système de co-culture avec un flux luminal continu et un étirement. Ces conditions favorisent le développement d’une architecture 3D en forme de villosités tapissée d’un épithélium hautement polarisé constitué de sous-types épithélia...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts lié à ce manuscrit.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit a été soutenu par R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) et R01HD105301 (MG) des National Institutes of Health, la subvention de l’initiative Chan Zuckerberg 2022-316749 (MG), une bourse de début de carrière (LCF) du Thrasher Research Fund, une subvention de chercheur en début de carrière (LCF) de l’UNC Children’s Development grâce au généreux soutien de donateurs de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, et le département de pédiatrie de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-Gastrin I humainSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12Gibco12634010
B-27 Supplement, sans sérum (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
BioTek Synergy 2 Lecteur de microplaques multimodeAgilent  ; 7131000
Cuvettes en méthacrylate de marque (PMMA), semi-microBrandTech759085D
Solution de récupération de cellulesCorning354270
CFX Opus Systèmes de PCR en temps réelBio-Rad12011319
Chip CradleEmulateN/A
Chip-S1 Emule de puce extensibleN/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
Plaques à puits multiples transparentes traitées TC,  ; 48 puits  ;Corning3548
Collagène du placenta humainSigma-AldrichC5533
Colgénase, type I, poudreGibco17018029
Milieu complet de cellules endothéliales humaines avec kit  ;Cell BiologicsH-1168
Tubes à centrifuger coniques en polypropylène, 15 mLFisher Scientific05-539-12
Tubes à centrifuger coniques en polypropylène, 50 mLFisher Scientific05-539-8
Lames de chambre de comptage de cellules CountessInvitrogen  ;C10283
Compteur automatisé de cellules Countess IIInvitrogen  ;
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextran, Bleu Cascade, 3000 MW, Anionique, Lysine FixableInvitrogen  ; D7132Colorant de perméabilité  ;
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Unités de filtre PES jetables, 0,2um membrane aPESFisher ScientificFB12566504
DMEM/F-12Gibco11320033
Sérum d’âneSigma-AldrichD9663
Dulbecco&prime ; s Aigle modifié&prime ; s Glycémie moyenne à élevéeSigma-AldrichD5796
Dulbecco&prime ; s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0,5 M,  ; pH 8,0Corning46-034-CI
Réactif d’activation de surface ER-1Émuler leréactif d’activation de puceER-1
réactif d’activation de surface ER-2  ;Émuler leréactif d’activation de la puceER-2
Fibronectine Protéine humaine, PlasmaGibco33016015
Fisherbrand  ; Boîtes de Pétri avec couvercle transparent, 100 mmFisher ScientificFB0875713
Solution de revêtement à base de gélatine.Cell Biologics6950
Genie Temp-Shaker 300Scientific Industries, Inc.SI-G300
Gentamicine  ;Gibco15750060
HEPES, solution liquide 1M (238,3 mg/mL)Corning25-060-CI
Hoechst 33342, chlorhydrate de trihydrate.InvitrogenH3570
Collagène humain de type ISigma-AldrichCC050
Cellules endothéliales microvasculaires primaires de l’intestin grêle humainProduits biologiques cellulairesH-6054
Microscope inverséFisher Scientific03-000-013
Isotemp Bains d’eau de luxe à usage généralFisher ScientificFSGPD10
L-Glutamine  ;Gibco25030-081
Gélose au bouillon Luria (LB), MillerSupelcoL3027
Cellules L-WRN  ;Collection de culture de type américainCRL-3276
Matrigel Matrice de membrane basale réduite, sans LDEV  ;Corning356231Cell Culture Matrix
N-2 Supplément (100x)Gibco17502048
N-acétyl-L-cystéineSigma-Aldrich1009005
NAILSTAR LAMPE UVNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC  ; Spectrophotomètre UV-Vis à microvolumeThermo Scientific840-274200
NicotinamideSigma-Aldrich72340
Orb-HM1 Module de moyeuémulerN/A
ParaformaldéhydeThermoFisher047392.9L
Pénicilline-Streptomycine  ;Gibco15140122
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+Rainin17013805
pointes TR LTS 1000µ ; L S 768A/8Rainin17014966
Pod Moduleportable émuleN/A
Sérum de bovin fœtal de qualité supérieure (FBS) (chaleur inactivée)  ;Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect Kit de transcription inverseQIAGEN205313
Facteur de croissance épidermique murin recombinant (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
Plat carré de biodosage avec poignées, non traité TC.Corning431111
SsoAdvanced Universal SYBR  ; Green SupermixBio-Rad1725271
Steriflip-GV Unité de filtration supérieure de tube de centrifugeuse stérileMilliporeSE1M179M6
Filtres à cellules stériles, 70umFisher Scientific22-363-548
Seringues stériles, 10mLFisher Scientific14-955-453
Ciseaux droits, fins et pointusMiltex  ; InstrumentsMH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD CentrifugeuseThermo Scientific75016052
Triton  ; X-100  ;Sigma-AldrichT8787Détergent
TRIzol Réactif  ;Réactif d’extraction d’ARNInvitrogen15596026
Solution de bleu de trypan, 0,4 % (p/v) dans du PBS, pH 7,5 ± ; 0,5Corning25-900-CI
TrypLE Express Enzyme (1X), sans rouge de phénol.Gibco12604013Réactif de dissociation enzymatique
Solution trypsine-EDTASigma-AldrichT4174
VIOS 160i Incubateur CO2, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë ;-CM1 Module de cultureémulerN/A
AMQAX1000 1 2

References

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