Ici, nous présentons une méthode de purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus qui est simple, peu coûteuse et efficace.
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Article de méthode
Purification par affinité d’une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE) est un nouvel agent fibrinolytique qui peut à la fois activer le plasminogène en plasmine et dégrader directement la fibrine, montrant de grands avantages par rapport aux agents thrombolytiques traditionnels. Cependant, en raison du manque d’informations structurelles, tous les programmes de purification de la sFE sont basés sur des purifications chromatographiques en plusieurs étapes, trop compliquées et coûteuses. Ici, un protocole de purification d’affinité de sFE est développé pour la première fois basé sur une structure cristalline de sFE; il comprend la préparation de l’échantillon brut et de la colonne de chromatographie d’affinité matricielle lysine/arginine-agarose, la purification par affinité et la caractérisation de la sFE purifiée. En suivant ce protocole, un lot de sFE peut être purifié en 1 jour. De plus, la pureté et l’activité de la sFE purifiée augmentent à 92% et 19 200 U/mL, respectivement. Il s’agit donc d’une approche simple, peu coûteuse et efficace pour la purification de la sFE. Le développement de ce protocole est d’une grande importance pour l’utilisation ultérieure de la sFE et d’autres agents similaires.
Introduction
La thrombose est une menace majeure pour la santé publique, en particulier suite à la pandémie mondiale de Covid-19 1,2. Cliniquement, de nombreux activateurs du plasminogène (AP), tels que l’activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) et l’urokinase (Royaume-Uni), ont été largement utilisés comme médicaments thrombolytiques. Les AP peuvent activer le plasminogène des patients en plasmine active pour dégrader la fibrine. Ainsi, leur efficacité thrombolytique est fortement limitée par le statut plasminogènedes patients 3,4. Les agents fibrinolyt....
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Protocole
1. Préparation
- Traitement des échantillons
- Disséquer soigneusement S. nudus frais (100 g) et recueillir l’intestin et son liquide interne.
- Ajouter 300 mL de tampon Tris-HCl (0,02 M, pH 7,4) pour l’homogénéisation (1 000 tr/min, 60 s).
- Congeler-décongeler l’homogénat 3x.
- Centrifuger l’échantillon (10,956 × g, 0,5 h, 4 °C) et prélever le surnageant. Conserver l’échantillon à 4 °C jusqu’à nouvelle utilisation.
- Précipitation des protéines
- Mélanger le surnageant avec une solution saturée de sulfate d’ammonium (neuf volumes) et laisser reposer le mélange pendant....
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Résultats
À la suite de ce protocole, des lysats tissulaires bruts ont été extraits, des colonnes de chromatographie de chromatographie matricielle arginine-agarose et lysine-agarose ont été construites, du sFE purifié a été obtenu et la pureté et l’activité fibrinolytique de la sFE purifiée ont été mesurées par SDS-PAGE et des plaques de fibrine, respectivement.
Après centrifugation, le surnageant recueilli était un liquide visqueux transparent bronzé. Les précipitations ont commencé lorsque ce surnage.......
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Discussion
En raison de l’indisponibilité de la séquence génétique exacte de la sFE, la sFE actuellement utilisée a été extraite de S. nudus14 frais. De plus, les procédures de purification de la sFE rapportées dans la littérature étaient compliquées et coûteuses, car elles étaient basées sur certaines caractéristiques générales de la sFE, telles que le poids moléculaire, le point isoélectrique, la force ionique et la polarité15,16. Aucun pr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par le Bureau de la science et de la technologie de la ville de Xiamen (3502Z20227197) et le Bureau de la science et de la technologie de la province du Fujian (n ° 2019J01070, n ° 2021Y0027).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 30 % Acrylamide-Bisacrylamide (29:1) | Biosharp | ||
| 2-Mercaptoethanol | Solarbio | ||
| Agarose G-10 | Biowest | ||
| Persulfate d’ammonium | SINOPHARM | ||
| Sulfate d’ammonium | SINOPHARM | ||
| Arginine-Sepharose 4B | Solarbio | Matrice arginine-agarose | |
| Bleu Bromoxylenol (BPB) | Solarbio | ||
| Kit de teinture Fast Silver | Beyotime | ||
| Fibrinogène | Merck | ||
| Glycine | Solarbio | ||
| Acide chlorhydrique | SINOPHARM | ||
| Kinase | RHAWN | ||
| Lysine-Sepharose 4B | Solarbio | lysine-agarose | |
| N,N,N',N'-Tétraméthyléthylènediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | ||
| (10-170 kD) | Chlorure de sodium Beyotime | ||
| SINOPHARM | |||
| Dodécyl sulfonate de sodium (SDS) | Hydroxyde de sodium Sigma-Aldrich | ||
| SINOPHARM | |||
| Thrombin | Meilunbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Solarbio | ||
| Tris(Hydroxymethyl) Aminomethane | Hydrochloride Solarbio | ||
| Equipment | |||
| AKT Aprotein Purification System pure | GE | ||
| Stérilisateur automatique à vapeur à pression verticale MLS-3750 | SANYO | ||
| Pompe à débit constant GE | |||
| Incubateur à température constante | JINGHONG | ||
| Centrifugeuse réfrigérée de bureau 3-30KS | SIGMA | ||
| DGG-9140AD | SENXIN | ||
| DY89-II | SCIENTZ | ||
| Bain-marie électro-thermostatique DENVER | |||
| Kylin-Bell | |||
| Nettoyeur à ultrasons KQ-500E Agitateur | ShuMei | ||
| Centrifugeuse réfrigérée Zhi wei | |||
| Four à micro-ondes | Galanz | ||
| Milli-Q Référence | Pipette Millipore | ||
| Thermo Fisher Scientific | |||
| pH-mètre de bureau de précision | Sartorious | ||
| Oscillateur vortex de petite taille | verticale Kylin-Bell | ||
| Bio-Rad | |||
| Consumable Material ; | |||
| micro ; L Tube PCR (200 µ ; L) | Axygene | ||
| (1,5 ml) | centrifuger Biosharp | ||
| (5 ml) | Biosharp | ||
| (50 ml) | NEST | ||
| (7 ml) | Biosharp | ||
| (60 mm) | NEST | ||
| (0,22 & micro ; m) | Millex GP | ||
| Parafilm | Bemis | ||
| (1 mL | KIRGEN | ||
| (10 µ ; L) | Axygene | ||
| (200 & micro ; L) | Axygene | ||
| Special Indicator Paper | ultra centrifuge TZAKZY | ||
| (15 mL 3 KDa) | Millipore | ||
| (4 mL 3 KDa) | Indicateur | ||
| Réactif |
Références
- Rosell, A., et al. Patients with COVID-19 have elevated levels of circulating extracellular vesicle tissue factor activity that is associated with severity and mortality-brief report. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 41 (2), 878-882 (2021).
- Schultz, N. H., et al.
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Réimpressions et autorisations
