Article de méthode

Modélisation précoce non guidée de la niche neurovasculaire organoïde du cerveau humain dans la membrane chorioallantoïde permissive de l’embryon de poussin

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DOI :

10.3791/65710

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16 février 2024

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1Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET - Universidad de Buenos Aires, 2Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética, Universidad de Buenos Aires, 3Institute of Neurosciences, Pathology and Experimental Therapeutics Dept, University of Barcelona, 4Functional Neurogenomics Group, Neurodevelopmental Disorders, IDIBELL, L’Hospitalet de Llobregat, 5IBE, Institute of Evolutionary Biology (UPF-CSIC), Department of Medicine and Life Sciences, Universitat Pompeu Fabra, 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA) and Universitat Pompeu Fabra, 7Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 8BarcelonaBeta Brain Research Center, Pasqual Maragall Foundation, 9Instituto de Investigación en Biomedicina (IBioBA) – CONICET – Instituto Partner de la Sociedad Max Planck

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour greffer des organoïdes cérébraux humains à plusieurs stades de maturation dans la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet. Les organoïdes cérébraux ont été cultivés selon des protocoles standardisés non guidés.

Résumé

La greffe d’organoïdes dans des tissus vascularisés chez des animaux modèles, tels que la membrane chorioallantoïde (CAM) immunodéficiente de souris ou d’embryon de poussin, s’est avérée efficace pour la modélisation de la néovascularisation. La CAM est une membrane extraembryonnaire richement vascularisée, qui présente une immunoréactivité limitée, devenant ainsi un excellent modèle d’accueil pour les greffes de cellules d’origine humaine.

Cet article décrit la stratégie pour greffer des organoïdes cérébraux humains différenciés à plusieurs stades de maturation dans la CAM. La composition cellulaire des organoïdes cérébraux change avec le temps, reflétant les étapes importantes du développement du cerveau humain. Nous avons greffé des organoïdes cérébraux aux stades de maturation pertinents : expansion neuroépithéliale (18 DIV), neurogenèse précoce (60 DIV) et gliogenèse précoce (180 DIV) dans la CAM d’embryons embryonnaires de poulet jour (E)7. Des organoïdes cérébraux greffés ont été prélevés 5 jours plus tard et leurs caractéristiques histologiques ont été analysées.

Aucun signe histologique de néovascularisation dans les organoïdes greffés ou vaisseaux sanguins anormaux adjacents aux greffes n’a été détecté. De plus, des changements remarquables ont été observés dans la composition cellulaire des organoïdes greffés, à savoir une augmentation du nombre d’astrocytes réactifs à l’acide fibrillaire glial. Cependant, les changements cytoarchitecturaux dépendaient du stade de maturation des organoïdes. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les organoïdes cérébraux peuvent se développer dans la CAM, et ils montrent des différences dans la cytoarchitecture en fonction de leur stade de maturation à la greffe.

Introduction

Les organoïdes cérébraux humains sont une technique émergente qui nous permet de récapituler le développement précoce du cerveau humain in vitro 1,2,3. Néanmoins, l’une des limites majeures de ce modèle est le manque de vascularisation, qui joue un rôle indispensable non seulement dans l’homéostasie cérébrale mais aussi dans le développement du cerveau4. En plus de l’apport d’oxygène et de nutriments, de plus en plus de preuves suggèrent que le système vasculaire du cerveau régule la différenciation, la migration et la synaptogenèse neuronales au cours du développement 5,6. Par conséquent, il est urgent d’établir des modèles fiables capables de fournir la signalisation vasculaire et la structure manquantes aux organoïdes cérébraux, augmentant ainsi la complexité de la génération d’organoïdes cérébraux humains7.

Parmi les méthodes de vascularisation proposées, deux axes principaux peuvent être envisagés : la greffe d’organoïdes dans un organisme vivant et les technologies purement in vitro co-cultivant des cellules endothéliales et des cellules neurales 8,9,10,11,12. La transplantation intracérébrale chez la souris est coûteuse et prend du temps, ce qui rend d’autres technologies pertinentes pour des modèles plus simples. Le test de la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet a été largement utilisé pour étudier l’angiogenèse 13,14,15. Au cours de la dernière décennie, plusieurs groupes ont réussi à greffer différents types d’organoïdes, notamment des organoïdes rénaux16,17, cardiaques18 et tumoraux19,20, dans des CAM. Néanmoins, on sait peu de choses sur l’efficacité, la toxicité/rejet, l’effet physiologique et les méthodes de greffe d’organoïdes cérébraux humains dans la MCA. Un autre aspect intéressant et encore inexploré est la formation d’une barrière hémato-encéphalique chimérique (BHE) entre la CAM et l’interface astrocytaire organoïde. Des travaux pionniers antérieurs ont suggéré la faisabilité présumée de générer une BHE dans le CAM en transplantant des astrocytes et un milieu conditionné par les astrocytes 21,22,23. Cependant, les astrocytes matures semblent incapables d’atteindre ce24,25. Ainsi, la formation de la BHE induite par les astrocytes reste discutable, et la transplantation d’organoïdes cérébraux humains permettrait de faire la lumière sur cette controverse.

Cet article vidéo décrit un protocole de greffe d’organoïdes cérébraux humains in ovo dans la MCA qui favorise la croissance, l’amélioration et la vascularisation, ce qui permet d’obtenir des organoïdes qui englobent des éléments de la BHE histologiquement compatibles. Ici, nous présentons un protocole assurant la survie de l’embryon de poulet et rapportons la permissivité de la CAM pour soutenir la croissance des organoïdes cérébraux.

Protocole

Les embryons de poulet Leghorn blanc (Gallus gallus) ont été traités en suivant le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Institut des ressources pour les animaux de laboratoire, Commission des sciences de la vie, Conseil national de la recherche, États-Unis, et les expériences ont été approuvées par le Conseil pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Barcelone.

1. Préparation non guidée d’organoïdes cérébraux

  1. Maintenir les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) dans mTESR1 préchauffées à température ambiante (RT) sous une confluence de 70 % dans des plaques à 6 puits recouvertes de Matrigel dissous dans du DMEM (1:40) dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C.
    REMARQUE : Le Matrigel doit être conservé dans la glace jusqu’à son utilisation comme revêtement pour empêcher sa polymérisation.
  2. Générer des organoïdes cérébraux en suivant le protocole cérébral non guidé 2.
    1. Dissocier les CSEh H9 à l’aide de 500 μL de la solution de dissociation cellulaire et incuber pendant 3 à 5 min à 37 °C. Remise en suspension dans mTESR1 contenant un inhibiteur de ROCK Y27632 (concentration finale de 50 μM) et ensemencer 9 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits prétraitée à faible adhérence.
    2. Une fois que les organoïdes se sont agrégés dans mTESR1 contenant un inhibiteur de ROCK Y27632 (concentration finale de 50 μM), transférez-les dans un milieu d’induction pendant 5 à 6 jours.
    3. En suivant le protocole26 des organoïdes cérébraux non guidés, transférer les organoïdes dans des milieux d’induction neuronale à ~jours 4-5.
    4. Une fois qu’ils ont acquis la taille et l’anneau de neuroépithélium, transférez-les dans une goutte de Matrigel glacée. Une fois le Matrigel polymérisé, transférez les organoïdes dans une boîte de Pétri à faible adhérence de 5 cm avec 5 ml de milieu de maturation préchauffé.
    5. Après 4 jours, mettez les organoïdes cérébraux sous agitation orbitaire.
  3. Recueillir les organoïdes pour la récolte dans des DPBS frais immédiatement avant la greffe.

2. Entretien des œufs, activation du développement et perforation de la coquille d’œuf

  1. Conserver les œufs fécondés (au jour 0) dans un incubateur à 18 °C jusqu’à utilisation.
    REMARQUE : À cette température, ils ne se développent pas, restant au même stade de maturation.
  2. Si nécessaire, incubez-les à 38 °C et 60 % d’humidité relative avec une rotation à bascule douce à un angle de 45 °C.
  3. Le jour 1, nettoyez la surface de la coquille d’œuf avec de l’éthanol à 70 % et séchez-la avec une serviette en papier pour la stériliser.
  4. Placez un pansement adhésif en papier chirurgical, ci-après appelé « pansement », sur l’œuf, en recouvrant la chambre à air de l’œuf.
    REMARQUE : Cela empêchera la poussière de la coquille d’œuf de tomber dans le CAM où elle se coince.
  5. Effectuer la ponction de perforation de la chambre à air, ci-après appelée trou de la chambre à air (ACH), avec une aiguille stérile de 21 G x 1 po, en perforant doucement la coquille de l’œuf. Ouvrez l’ACH à l’extrémité supérieure de l’œuf pour éviter de déranger le CAM, qui à ce stade pond séparé de la coquille.
  6. Pour trouver la meilleure position pour percer l’ACH, utilisez une lampe pour déterminer la surface de la coquille d’œuf la plus fine à l’extrémité supérieure de l’œuf. La transmission directe du faisceau lumineux indique la meilleure position pour percer.
  7. Couvrez l’ACH avec un nouveau pansement pour protéger l’embryon de l’environnement extérieur et replacez l’ovule dans l’incubateur.
  8. À partir de ce moment, arrêtez la rotation dans l’incubateur et maintenez les œufs en position verticale avec la fenêtre sur le dessus.
    REMARQUE : Cela facilitera le développement de l’embryon, et le CAM devient disponible en haut avec une chambre d’air entre l’embryon et la coquille d’œuf, permettant une greffe ultérieure.
  9. Ouvrez l’ACH du jour 1 au jour 4. La viabilité augmente le jour 4 (3 jours avant le jour du greffage).

3. Greffe d’organoïde cérébral

  1. Effectuez le greffage le jour 7 lorsque la CAM est bien développée et vascularisée, couvrant l’ovule sur tout l’embryon.
  2. Retirez le pansement et essuyez la surface de la coquille d’œuf avec de l’éthanol à 70 % pour stériliser la coquille d’œuf, avant d’élargir soigneusement l’ACH en une fenêtre de greffe.
  3. Placez un nouveau pansement plus gros couvrant l’extension au-delà de la fenêtre de greffe finale pour éviter que des fragments de coquille d’œuf ne tombent dans le CAM tout en agrandissant la fenêtre de greffe.
    REMARQUE : Cette fenêtre plus grande est nécessaire pour sélectionner la meilleure position de greffage et pour la greffe ultérieure.
  4. Agrandissez la fenêtre de greffe en perforant doucement la coquille d’œuf jusqu’à ce que la fenêtre atteigne un diamètre d’environ 2 cm. Retirez délicatement les bords de la fenêtre en coquille d’œuf avec une pince à épiler jusqu’à ce que la fenêtre soit agrandie. Enlevez la poussière restante et les morceaux de coquille d’œuf qui resteront attachés au pansement en décollant doucement le pansement.
  5. Placez l’organoïde avec une pipette automatique P200. Coupez les pointes avec des ciseaux stériles et tranchants pour agrandir l’ouverture en fonction de la taille de l’organoïde et éviter d’endommager l’organoïde ou utilisez des pointes stériles de transfert de gros calibre. Prélevez l’organoïde dans un volume maximum de 50 μL de PBS et transférez-le directement dans le CAM, sur un côté opposé à l’emplacement de l’embryon.
  6. Assurez-vous que la position du greffon est éloignée du jaune pour éviter sa rupture lors du prélèvement, et de préférence, placez-le près d’un vaisseau sanguin.
  7. Placez une goutte de 7 μL de Matrigel autour de l’organoïde après avoir placé l’organoïde sur le CAM.
    REMARQUE : Cela empêchera l’organoïde de se déplacer autour de la membrane.
  8. Fermez la fenêtre à l’aide d’un petit morceau de parafilm de la taille exacte de la fenêtre et fixez-le à la coque avec un pansement adhésif.
    REMARQUE : Il est important de couvrir entièrement la fenêtre avec le parafilm pour éviter que l’embryon ne se dessèche tout en permettant l’échange gazeux. Délimitez correctement l’extension de la couverture de la fenêtre, en évitant de dépasser la fenêtre, car cela pourrait entraver l’échange gazeux nécessaire au bon développement de l’embryon27.

4. Prélèvement d’organoïdes transplantés

  1. Récoltez les organoïdes greffés et le CAM environnant au jour 12 du développement du poulet, correspondant au stade de développement 38 Hamburger et Hamilton (HH38)28, 5 jours après la greffe. À ce stade, le CAM est complètement différencié avec un système vasculaire mature tandis que les germes de plumes recouvrent les ailes ainsi que la paupière supérieure de l’embryon.
  2. Après avoir retiré le pansement adhésif, agrandissez davantage la fenêtre pour faciliter la récolte des échantillons à l’aide de ciseaux et d’une pince à épiler fine.
  3. Visualisez l’organoïde à l’aide d’une microscopie à dissection binoculaire si nécessaire, suivie d’une étape de préfixation de 2 minutes avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pour faciliter la récolte des organoïdes et des CAM.
  4. Prélevez une section de 1,5 cm2 du CAM contenant l’organoïde.
  5. Fixation de l’échantillon
    1. Laver les échantillons avec 1x PBS et les fixer avec 4% de PFA (en PBS, pH 7,2) pendant 30 min à 4 °C. Ensuite, lavez les échantillons pendant 3 x 5 min dans du PBS.
    2. Stocker les échantillons à 4 °C dans du PBS avec de l’azoture de sodium ou les cryoprotéger directement dans du saccharose-PBS à 30 % pendant la nuit à 4 °C.
    3. Après cryoprotection, intégrer les échantillons dans un composé à température de coupe optimale (OCT) et les stocker à -20 °C jusqu’à la section. Couper des tranches de tissu de 20 μm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et les recueillir sur des lames xylanisées. Conservez les lames à -20 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour la coloration.

5. Immunofluorescence

  1. Retirer l’OCT des sections avec une solution PBS avec 0,1 % de Triton X-100 (PBS-T) pendant 10 min à température ambiante (RT).
  2. Traiter les sections avec une solution de blocage (BS) avec une solution de PBS-T à 0,01 % de BSA à 2 %, 3 % de sérum d’ânesse pendant 1 h à RT.
  3. Diluer l’anticorps primaire sélectionné (voir le tableau des matières) dans la BS et incuber les échantillons pendant la nuit à 4 °C.
  4. Le lendemain, laver les échantillons 3 x 10 min dans 1x PBS à RT.
  5. Diluer l’anticorps secondaire dans BS et incuber pendant 2 h à RT (voir le tableau des matériaux).
  6. Incuber les échantillons pendant 10 min avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour marquer les noyaux cellulaires à RT, dilués dans du PBS-T à une dilution de 1:1 000.
  7. Montez les diapositives avec un support de montage et recouvrez-les avec des lamelles en verre.
  8. Prenez toutes les images à l’aide d’un microscope à fluorescence à grand champ à 2,5, 10, 20 et 40x.
  9. Conservez les tranches à 4 °C.

6. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

REMARQUE : Pour prouver que la greffe a fonctionné, effectuez une coloration H&E.

  1. Éliminer l’OCT avec PBS-T 0,1 % pendant 10 min à RT.
  2. Effectuer une déshydratation en série dans une hotte comme suit : 10 min dans de l’eau distillée (DW), 45 s dans de l’hématoxyline, 1 min dans DW, 20 s dans du PBS, 2 x 30 s dans 70 % d’EtOH, 2 x 30 s dans 80 % d’EtOH, 2 x 30 s dans 96 % d’EtOH, 30 s dans de l’éosine, 2 x 15 s dans 96 % d’EtOH, 2 x 15 s dans 100 % d’EtOH, 1 min dans le xylol-100 % ETOH, 1 min dans le xylol, 1 min dans le xylol (frais).
  3. Montez les lamelles en verre avec un support de montage à base de xylène.

Résultats

Sélection du calendrier de maturation embryonnaire pour la greffe
L’expérience commence à J0 lorsque les œufs fécondés sont incubés à 38 °C et 60 % d’humidité relative. La membrane chorioallantoïdienne (CAM) est une membrane extraembryonnaire hautement vascularisée qui se développe après l’incubation de l’œuf. Il est formé par la fusion de l’allantoïde et du chorion. À J1, après 24 h d’incubation, la chambre à air est perforée pour empêcher le CAM de se fixer à la membrane de l’enveloppe interne. La perforation de la chambre à air à D1 améliore la qualité de la chambre à air par rapport à la perforation aux stades ultérieurs (D4). Le CAM continue de croître jusqu’à J12, où il enveloppe tout le contenu de l’œuf et adhère fermement à la membrane interne de l’enveloppe (figure 1). Le trou réalisé à J7 est agrandi pour faciliter la récolte des échantillons. D7 est le moment optimal pour le greffage lorsque le CAM atteint sa maturité et recouvre le sac vitellin et la surface de l’embryon. À ce stade, le trou de la chambre à air est agrandi et les organoïdes sont transférés dans le CAM à l’aide d’une pipette automatique.

Greffe d’organoïdes cérébraux
Tout au long de la maturation inhérente des organoïdes cérébraux in vitro, leur composition cellulaire passe des progéniteurs neuraux aux neurones matures et aux cellules gliales. La neurovascularisation et la neurogenèse sont des processus de développement entremêlés et interdépendants chez les vertébrés, et la signalisation conduisant à cette diaphonie dépend fortement du stade de maturation de la contrepartie neurale29. Les progéniteurs neuronaux sont la principale source de facteurs proangiogéniques dans le cerveau en développement29,30. Au contraire, les neurones et les astrocytes soutiennent la néoangiogenèse aux stades matures et à l’âge adulte grâce à la sécrétion du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire31,32. Ces changements dans la cytoarchitecture cérébrale, qui se reflètent également dans les organoïdes cérébraux, pourraient entraîner des changements différentiels dans l’intégration et la réponse à la greffe de MCP, en fonction du stade de maturation des organoïdes cérébraux. Par conséquent, nous avons greffé des organoïdes cérébraux au jour 13 de différenciation in vitro (DIV), lorsque les cellules neuroépithéliales et la glie radiale se dilatent ; à la DIV 37, au début de la neurogenèse ; à la DIV 60, lorsque la neurogenèse est robuste et que les neurones d’identités différentes sont différenciés en phase terminale ; et à la DIV 120, lorsqu’une pléthore de neurones matures peuplent l’organoïde, générant un réseau neuronal bien développé et l’astrogenèse est également répandue.

Dans tous les cas, les échantillons ont été prélevés après 5 jours d’incubation in ovo (DIO). Pour éviter les biais dus à l’effet de lot dans les organoïdes cérébraux, toutes les comparaisons entre les organoïdes greffés et non greffés ont été effectuées dans le même lot par paires. Les organoïdes ont été dérivés d’au moins deux expériences indépendantes par point temporel et d’un total de six différenciations indépendantes. Une greffe de plusieurs stades de maturation a été réalisée en parallèle dans chaque expérience de greffage. Lors de la greffe, les organoïdes ont poursuivi le processus de maturation adjacent aux vaisseaux CAM sans aucun signe d’infiltration de vaisseaux sanguins dans l’organoïde (Figure 2).

La survie des organoïdes lors de la greffe varie de 80 % chez les plus jeunes et tombe à ~66 % chez les organoïdes matures après 5 jours après la greffe, ce qui suggère que la permissivité et la plasticité de la greffe d’organoïdes pourraient changer avec le temps (tableau 1). La viabilité organoïde a été déterminée par la présence de noyaux pynotiques dans les colorations H&E. Le nombre de noyaux pycnotiques était similaire entre les organoïdes témoins transplantés et non transplantés (Figure 3), ce qui suggère que la MCA est permissive pour maintenir l’organoïde vivant lors de la transplantation. De plus, aucune libération histologique ou hémogénique n’a été détectée au CAM, et les embryons restent vivants, ce qui suggère que ni la procédure de greffe ni l’organoïde ne perturbent l’intégrité du CAM ou n’affectent de manière significative le développement embryonnaire.

Composition cellulaire dans des organoïdes cérébraux greffés
Les organoïdes cérébraux non guidés ont une variabilité cellulaire inter- et intra-organoïde marquée. Cependant, ils sont principalement neuronaux, générant des ondes de progéniteurs, de neurones et d’astrocytes à un rythme séquentiel 2,26. Ensuite, nous avons évalué si la greffe modifie la composition neuronale des organoïdes cérébraux. Les organoïdes plus jeunes (13 DIV + 5 DIO : 18 jours) ne montrent aucune différence par rapport à leurs organoïdes témoins non greffés en présence de neurones (TUBB3+). Aux stades de maturation ultérieurs (60 DIV +5 DIO : 65 jours et 120 DIV + 5 DIO : 125 jours), la proportion de neurones (TUBB3+) est considérablement diminuée par rapport à celle des organoïdes non greffés (Figure 4). Dans les organoïdes non greffés matures pour 60 DIV, les neurones sont largement répartis tout autour des organoïdes.

Notamment, le nombre et la localisation des astrocytes positifs à la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP+) ont mis en évidence une augmentation par rapport à ceux observés chez les témoins non greffés. De plus, ces astrocytes GFAP+ ont acquis une localisation inattendue dans la face externe de l’organoïde. Chez 18 DIV, organoïdes libres (non greffés), peu d’astrocytes peuvent être vus et aucune distribution structurelle n’a pu être détectée ; au contraire, ils semblent répartis de manière homogène dans tout l’organoïde (Figure 3).

figure-results-1
Figure 1 : Chronologie de la mise en place du test CAM pour la transplantation organoïde. (A) Application d’un pansement adhésif en papier chirurgical sur le dessus de l’œuf. (B) Faire un trou dans la coquille avec une aiguille sur le pansement adhésif. (C) Ouvrez la fenêtre de la coquille d’œuf, vue d’en haut, prête pour la transplantation d’un organoïde de cerveau humain (D) (jour 60). Barre d’échelle = 100 μm. (E) Visualisation de l’organoïde greffé au CAM après 5 jours d’incubation in ovo. (F) Caractéristiques du développement des organoïdes cérébraux du jour 0 au jour 120. La flèche indique l’emplacement de l’organoïde. Abréviation : CAM = membrane chorioallantoïde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine d’organoïdes greffés dans la membrane chorioallantoïde. (A) organoïde 13 DIV + 5 DIO ; (B) organoïde 37 DIV + 5 DIO ; (C) organoïde 60 DIV + 5 DIO ; et (D) 120 DIV + 5 DIO organoïdes ; Des carrés rouges marquent l’organoïde. Barre d’échelle = 500 μm. Abréviations : DIV = jour in vitro ; DIO = jour en ovo. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Immunocytochimie des organoïdes à différents stades de développement. Le GFAP a été utilisé pour la coloration et le DAPI pour les noyaux. Barre d’échelle = 100 μm. (A,B) Images du même organoïde greffé 13 DIV + 5 DIO où les astrocytes sont visibles autour du bord de l’organoïde. (C) Image d’un organoïde libre de 18 DIV où les astrocytes sont à peine visibles. La différence entre les organoïdes libres et greffés est très perceptible. (D, E) Images de 37 DIV + 5 DIO greffés organoïdes où l’on peut voir peu d’astrocytes. (F) Image d’un organoïde libre de 42 DIV. Les flèches jaunes indiquent l’emplacement des astrocytes. Abréviations : DIV = jour in vitro ; DIO = jour in ovo ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Immunocytochimie de 120 organoïdes DIV. TUBB3 a été utilisé pour colorer les neurones et DAPI pour les noyaux. Barre d’échelle = 100 μm ; les images ont été prises à 20x. (A) Un organoïde greffé de 120 DIV +5 DIO où peu de neurones peuvent être vus. (B) Un organoïde libre de 125 DIV avec beaucoup de neurones. L’astérisque indique l’emplacement de l’organoïde tandis que la ligne pointillée représente la limite entre l’organoïde et le CAM (déterminée par analyse histologique). Abréviations : DIV = jour in vitro ; DIO = jour in ovo ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; CAM = membrane chorioallantoïdienne. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Organoïdes13 DIV37 DIV60 DIV120 DIV
Vivant6 (75%)10 (83%)6 (66%)6 (66%)
Mort2 (25%)2 (16%)3 (34%)3 (34%)

Tableau 1 : Taux de survie embryonnaire après greffe d’organoïdes CAM. Abréviations : DIV = jour in vitro ; DIO = jour in ovo ; CAM = membrane chorioallantoïdienne.

Discussion

Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé avec de nombreuses étapes clés qui assurent une croissance et un développement favorables des organoïdes cérébraux humains lors de la greffe sans perturber la survie des embryons de poulet. Nous avons recommandé l’utilisation d’aiguilles stériles pour percer la chambre à air de l’œuf après 24 h d’incubation (jour 1). De plus, nous avons également essayé de faire la ponction au jour 4 (après avoir vérifié la coquille de l’œuf à la lumière pour tester le développement du système vasculaire pour être sûrs que nous ne travaillions qu’avec des embryons sains). Cependant, cela a entraîné une baisse de la viabilité des embryons en raison de la proximité des vaisseaux CAM avec la coquille de l’œuf. Il convient de noter qu’une force excessive peut entraîner la rupture de la coquille d’œuf et endommager le système vasculaire CAM. L’utilisation d’une source lumineuse pour détecter les zones amincies de la coquille de l’œuf a été utile pour faire des trous contondants tout en empêchant la surpénétration et le passage à travers l’œuf, entraînant une invasion de la CAM.

Même si la rotation des œufs semble obligatoire pour le bon développement des embryons de poule pendant l’incubation, il est nécessaire de l’éviter après avoir perforé la chambre à air. L’élimination de l’albumine n’était pas justifiée pour ce modèle, pas plus que l’ajout de PBS pour éviter la déshydratation de l’œuf. De plus, l’utilisation d’une solution d’éthanol à 70 % doit être faite à bon escient, en prenant soin de sécher toute solution d’éthanol restante sur la coquille pour préserver la viabilité embryonnaire. Un autre point critique est la taille du trou de coquille d’œuf utilisé pour la greffe, ce qui nécessite d’équilibrer le plus petit trou possible qui permet le confort de manipulation de la greffe. La sélection du stade embryonnaire pour les greffes (E7) a été motivée par le stade de maturation du CAM et sa taille relative, favorisant l’intégration de la greffe. Cependant, dans le cas où les organoïdes transplantés nécessitent une maturation in ovo plus longue, le greffage peut être effectué au jour E5.5/6. La variabilité des organoïdes cérébraux est contrôlée pour assurer la viabilité expérimentale. Les organoïdes du même âge présentent des tailles similaires, et il est important de noter que, quel que soit l’âge des organoïdes, ils ont tous été incubés pendant 5 jours après la transplantation. De plus, pour plus de cohérence, les organoïdes de contrôle ont été méticuleusement choisis pour correspondre à la taille exacte de leurs homologues greffés. Un autre aspect technique, pertinent pour soutenir la survie des organoïdes greffés et de l’embryon, est de fermer le trou de greffe avec un morceau carré de parafilm, afin de maintenir un environnement in ovo contrôlé.

Contrairement à nos hypothèses initiales, les jeunes organoïdes ont mieux survécu après le processus de greffage et l’intégration des MCP que les plus âgés. Nous avons émis l’hypothèse que les organoïdes plus jeunes sont plus plastiques en raison de leur présence enrichie chez les progéniteurs à un stade précoce33, tandis que les neurones matures ont besoin d’un environnement neuronal permissif pour leur maintien. De plus, des changements cytoarchitecturaux dans les greffes organoïdes cérébrales précoces (D18) ont été détectés dans la distribution des astrocytes. Nous avons notamment détecté que les astrocytes ne se différenciaient à ce stade précoce que lorsqu’ils étaient greffés et qu’ils se répartissaient pour générer une pseudo-capsule sous la surface de l’organoïde. Cette structure pourrait être une réminiscence du potentiel de l’organoïde à générer une interface neurovasculaire qui pourrait imiter la BHE. Alternativement, la réactivité accrue des astrocytes, positionnés dans une structure de type barrière, pourrait indiquer une réponse immunogène de l’organoïde à la signalisation sécrétée par la CAM. Cependant, des travaux supplémentaires sont nécessaires pour démontrer cette hypothèse. En résumé, cet article décrit les étapes de la greffe d’organoïdes à plusieurs stades de développement dans la MCA du poulet, étant une situation plus permissive pour les organoïdes de développement précoce, et l’effet cellulaire de ces greffes dans les neurones et la GFAP.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Dr Alcántara et le Dr Ortega de l’UB et le reste des membres du laboratoire du Dr Acosta pour ces discussions perspicaces. S.A. est professeur adjoint à la Generalitat de Catalunya de l’Université de Barcelone.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anti-TUBB3 [Tuj1], souris  ;BioLegend8012011:1 000
Anti-GFAP, lapinGeneTexGTX1087111:500
Anti-lapin AlexaFluor 488, chèvre.InvitrogenA-212061:1 000
Anti-souris AlexaFluor 594, chèvreJackson ImmunoResearch715-585-1501:500
Œufs de poulet Leghorn blanc fécondé (Gallus gallus)Granja Gibert (Cambrils, Espagne)
DAPIInvitrogenD13061:10 000
DPXSigma100579milieu de montage à base de xylène  ;
Solution de dissociation douceCreativeBiolabsITS-0622-YT187Solution de dissociation cellulaire
MatrigelBD Biosciences356234
Mowiol 4-88 Support de montageMerk81381
Essuie-tout, qualitélaboratoire Sigma-AldrichZ188956
inhibiteur de ROCK Y27632MilliporeSCM07510 nM
Ciseaux chirurgicaux à pointe aiguëVWR470106-340
Superfrost Plus Lames de microscope à adhérenceEprediaJ1800AMNZ

Références

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