Ici, nous présentons un protocole pour greffer des organoïdes cérébraux humains à plusieurs stades de maturation dans la membrane chorioallantoïdienne (CAM) du poulet. Les organoïdes cérébraux ont été cultivés selon des protocoles standardisés non guidés.
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Article de méthode
Modélisation précoce non guidée de la niche neurovasculaire organoïde du cerveau humain dans la membrane chorioallantoïde permissive de l’embryon de poussin
Dans cet article
Résumé
Résumé
La greffe d’organoïdes dans des tissus vascularisés chez des animaux modèles, tels que la membrane chorioallantoïde (CAM) immunodéficiente de souris ou d’embryon de poussin, s’est avérée efficace pour la modélisation de la néovascularisation. La CAM est une membrane extraembryonnaire richement vascularisée, qui présente une immunoréactivité limitée, devenant ainsi un excellent modèle d’accueil pour les greffes de cellules d’origine humaine.
Cet article décrit la stratégie pour greffer des organoïdes cérébraux humains différenciés à plusieurs stades de maturation dans la CAM. La composition cellulaire des organoïdes cérébraux change avec le temps, reflétant les étapes importantes du développement du cerveau humain. Nous avons greffé des organoïdes cérébraux aux stades de maturation pertinents : expansion neuroépithéliale (18 DIV), neurogenèse précoce (60 DIV) et gliogenèse précoce (180 DIV) dans la CAM d’embryons embryonnaires de poulet jour (E)7. Des organoïdes cérébraux greffés ont été prélevés 5 jours plus tard et leurs caractéristiques histologiques ont été analysées.
Aucun signe histologique de néovascularisation dans les organoïdes greffés ou vaisseaux sanguins anormaux adjacents aux greffes n’a été détecté. De plus, des changements remarquables ont été observés dans la composition cellulaire des organoïdes greffés, à savoir une augmentation du nombre d’astrocytes réactifs à l’acide fibrillaire glial. Cependant, les changements cytoarchitecturaux dépendaient du stade de maturation des organoïdes. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que les organoïdes cérébraux peuvent se développer dans la CAM, et ils montrent des différences dans la cytoarchitecture en fonction de leur stade de maturation à la greffe.
Introduction
Les organoïdes cérébraux humains sont une technique émergente qui nous permet de récapituler le développement précoce du cerveau humain in vitro 1,2,3. Néanmoins, l’une des limites majeures de ce modèle est le manque de vascularisation, qui joue un rôle indispensable non seulement dans l’homéostasie cérébrale mais aussi dans le développement du cerveau4. En plus de l’apport d’oxygène et de nutriments, de plus en plus de preuves suggèrent que le système vasculaire du cerveau régule la différenciation, la migration et la synaptogenèse neuronales....
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Protocole
Les embryons de poulet Leghorn blanc (Gallus gallus) ont été traités en suivant le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Institut des ressources pour les animaux de laboratoire, Commission des sciences de la vie, Conseil national de la recherche, États-Unis, et les expériences ont été approuvées par le Conseil pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’Université de Barcelone.
1. Préparation non guidée d’organoïdes cérébraux
- Maintenir les cellules souches embryonnaires humaines H9 (CSEh) dans mTESR1 préchauffées à température ambiante (RT) sous une confluen....
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Résultats
Sélection du calendrier de maturation embryonnaire pour la greffe
L’expérience commence à J0 lorsque les œufs fécondés sont incubés à 38 °C et 60 % d’humidité relative. La membrane chorioallantoïdienne (CAM) est une membrane extraembryonnaire hautement vascularisée qui se développe après l’incubation de l’œuf. Il est formé par la fusion de l’allantoïde et du chorion. À J1, après 24 h d’incubation, la chambre à air est perforée pour empêcher le CAM de se fixer à la membrane de l’enveloppe interne. La p.......
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Discussion
Dans cette étude, nous décrivons un protocole détaillé avec de nombreuses étapes clés qui assurent une croissance et un développement favorables des organoïdes cérébraux humains lors de la greffe sans perturber la survie des embryons de poulet. Nous avons recommandé l’utilisation d’aiguilles stériles pour percer la chambre à air de l’œuf après 24 h d’incubation (jour 1). De plus, nous avons également essayé de faire la ponction au jour 4 (après avoir vérifié la coquille de l’œuf à la lumière pour tester le développement .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions le Dr Alcántara et le Dr Ortega de l’UB et le reste des membres du laboratoire du Dr Acosta pour ces discussions perspicaces. S.A. est professeur adjoint à la Generalitat de Catalunya de l’Université de Barcelone.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Anti-TUBB3 [Tuj1], souris ; | BioLegend | 801201 | 1:1 000 |
| Anti-GFAP, lapin | GeneTex | GTX108711 | 1:500 |
| Anti-lapin AlexaFluor 488, chèvre. | Invitrogen | A-21206 | 1:1 000 |
| Anti-souris AlexaFluor 594, chèvre | Jackson ImmunoResearch | 715-585-150 | 1:500 |
| Œufs de poulet Leghorn blanc fécondé (Gallus gallus) | Granja Gibert (Cambrils, Espagne) | ||
| DAPI | Invitrogen | D1306 | 1:10 000 |
| DPX | Sigma | 100579 | milieu de montage à base de xylène ; |
| Solution de dissociation douce | CreativeBiolabs | ITS-0622-YT187 | Solution de dissociation cellulaire |
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Mowiol 4-88 Support de montage | Merk | 81381 | |
| Essuie-tout, qualité | laboratoire Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| inhibiteur de ROCK Y27632 | Millipore | SCM075 | 10 nM |
| Ciseaux chirurgicaux à pointe aiguë | VWR | 470106-340 | |
| Superfrost Plus Lames de microscope à adhérence | Epredia | J1800AMNZ |
Références
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in....
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Réimpressions et autorisations
