Ce protocole décrit l’utilisation du tri cellulaire activé par fluorescence des cellules souches mésenchymateuses humaines à l’aide de la méthode de tri unicellulaire. Plus précisément, l’utilisation du tri unicellulaire permet d’atteindre une pureté de 99 % des cellules immunophénotypées d’une population hétérogène lorsqu’elle est associée à une approche multiparamétrique basée sur la cytométrie en flux.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Tri unicellulaire de cellules souches mésenchymateuses immunophénotypées à partir de dents de lait exfoliées humaines
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) d’un organisme possèdent une capacité extraordinaire à se différencier en plusieurs lignées de cellules adultes dans le corps et sont connues pour leurs propriétés immunomodulatrices et anti-inflammatoires. L’utilisation de ces cellules souches est une aubaine pour le domaine de la biologie régénérative, mais en même temps, un fléau pour la médecine régénérative et la thérapeutique en raison des multiples ambiguïtés cellulaires qui leur sont associées. Ces ambiguïtés peuvent provenir de la diversité de la source de ces cellules souches et de leurs conditions de croissance in vitro , qui reflètent toutes deux leur hétérogénéité fonctionnelle.
Cela justifie des méthodologies pour fournir des populations purifiées et homogènes de CSM pour des applications thérapeutiques. Les progrès dans le domaine de la cytométrie en flux ont permis la détection de populations unicellulaires à l’aide d’une approche multiparamétrique. Ce protocole décrit un moyen d’identifier et de purifier les cellules souches des dents de lait exfoliées humaines (SHED) par le biais d’un tri unicellulaire assisté par fluorescence. L’expression simultanée de marqueurs de surface, à savoir l’isothiocyanate de fluorescéine CD90 (FITC), la protéine CD73-péridinine-chlorophylle (PerCP-Cy5.5), l’allophycocyanine CD105 (APC) et CD44-V450, a permis d’identifier les expresseurs positifs « brillants » des CSM à l’aide de la cytométrie en flux multiparamétrique. Cependant, une baisse significative a été observée dans les pourcentages de quadruples expresseurs de ces marqueurs positifs à partir du passage 7 jusqu’aux passages ultérieurs.
Les sous-populations immunophénotypées ont été triées en utilisant le mode de tri unicellulaire où seulement deux marqueurs positifs et un marqueur négatif constituaient les critères d’inclusion. Cette méthodologie a permis d’assurer la viabilité cellulaire des populations triées et de maintenir la prolifération cellulaire après le tri. L’application en aval d’un tel tri peut être utilisée pour évaluer la différenciation spécifique à la lignée pour les sous-populations fermées. Cette approche peut être appliquée à d’autres systèmes à cellule unique afin d’améliorer les conditions d’isolement et d’acquérir des informations sur les marqueurs de surface de plusieurs cellules.
Introduction
Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) peuvent être considérées comme une source évolutive de cellules adaptées aux thérapies cellulaires et peuvent être considérées comme un système de référence en médecine régénérative. Ces cellules peuvent être isolées à partir d’une variété de sources dans le corps avec des origines tissulaires différentes1. En fonction de leur tissu source, chaque type de CSM présente un comportement in vitro ambigu2. Ceci est bien observé dans leurs propriétés morphologiques et fonctionnelles3. De nombreuses études ont montré une variation intra-clonale des dim....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Approbation éthique et consentement à participer : Des échantillons de pulpe dentaire à feuilles caduques exfoliés humains ont été reçus après avoir obtenu un consentement éclairé et une approbation éthique complète par le département buccal et maxillo-facial du Sri Rajiv Gandhi Dental College and Hospital (SRGCDS), à Bangalore, conformément aux normes établies par le Comité d’approbation éthique de l’hôpital, SRGCDS. À la suite de quoi, l’isolement, la culture, l’entretien et l’application des SHED ont été approuvés et conformes aux directives recommandées par le Comité institutionnel pour la recherche sur les cellules souches (IC-SCR) de l’Institut de médecine régén....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Les SHED ont été caractérisés à l’aide de tests d’immunofluorescence standard montrant l’expression de vimentine (filaments intermédiaires rouges de type III), de filaments d’actine (sondes de phalloïdine Alexa fluor 488) et de noyaux colorés au DAPI (Figure 1A). Pour estimer leurs capacités de prolifération et de formation de colonies, des tests standard de croissance cellulaire à court terme ont été effectués. Une augmentation de 14,3 fois du taux de prolifération entre le jour 2 et le jou.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans le domaine de l’ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative, parmi les sources postnatales, les CSM dérivées de tissus oraux ont suscité un vif intérêt en raison de leurs obligations éthiques minimales et de leur potentiel de différenciation multilignage notable21. Les cellules souches de la pulpe dentaire (CSPD) de la troisième molaire et des CSH touchées ont attiré le plus d’attention parmi les CSM dentaires pour leur potentiel thérapeutique dans les maladies neurodégénératives et .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflit d’intérêts concernant la publication de cet article.
Remerciements
Nous remercions l’installation de cellules en flux du Centre Jawaharlal Nehru pour la recherche scientifique avancée, à Bangalore, en Inde, pour l’utilisation de l’installation centrale de cytométrie en flux. La cryo-section de la culture de pastilles de cellules différenciées a été réalisée au laboratoire de référence Neuberg Anand, à Bangalore, en Inde. Ce travail a été soutenu par le financement intra-muros de l’UC de la Manipal Academy of Higher Education (MAHE), en Inde. AG est reconnaissant du soutien de la bourse Dr. T. M. A. Pai de MAHE.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Coloration Bleu Alcian | HiMedia | CCK029-1KT | |
| Antibiotique-Antimycosique (100x) ; | Gibco by ThermoFisher | 15240062 | |
| BD CompBead Plus Anti-souris Ig, &kappa ;/Negative Control (BSA) Compensation Plus (7.5 µ ; m) Set de particules | BD Biosciences | 560497 | |
| BD FACS Accudrop Beads ; | BD Biosciences | 345249 | Utilisé pour configurer le délai laser à l’ouverture du module de tri. |
| Cytomètre en flux BD FACS Aria Fusion | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Diva 9.4 | BD Biosciences | --- | |
| BD FACS Fluide de gaine | BD Biosciences | 342003 | Utilisé comme fluide de gaine pour les expériences d’analyse et de tri dans le BD FACSAria Fusion |
| BD FACSDiva CS& T Research Beads | BD Biosciences | 655050 | Utilisé pour la configuration de l’instrument en fonction de la taille de la buse. |
| BD Horizon V450 Souris Anti-Humain CD44 | BD Biosciences | 561292 | |
| BD Horizon V450 Souris IgG2b, &kappa ; Contrôle d’isotype | BD Biosciences | 560374 | CD44-V450 isotype |
| BD Pharmingen APC Souris Anti-Humaine CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
| BD Pharmingen APC Souris IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes | BD Biosciences | 555751 | isotype CD105-APC |
| BD Pharmingen Solution DAPI | BD Biosciences | 564907 | DAPI Solution mère de 1 mg/mL |
| BD Pharmingen FITC Souris Anti-Humaine CD90 | BD Biosciences | 555595 | |
| BD Pharmingen FITC Souris IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes | BD Biosciences | 555748 | CD90-FITC isotype |
| BD Pharmingen PE Souris Anti-Humain CD45 | BD Biosciences | 555483 | |
| BD Pharmingen PE Souris IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes | BD Biosciences | 555749 | isotype CD45-PE |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Souris anti-humaine CD73 | BD Biosciences | 561260 | |
| BD Pharmingen PerCP-Cy 5.5 Souris IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes | BD Biosciences | 550795 | CD73-PerCP-Cy 5.5 |
| isotype BD Pharmingen Souris purifiée Anti-Vimentine | BD Biosciences | 550513 | |
| Albumine sérique bovine | Hi-Media ; | TC548-5G | |
| Cristal violet | Nice chemical pvt ltd ; | C33809 | |
| Phosphate salin tamponné | Sigma-aldrich de Dulbecco ; ; | D5652-50L | dPBS utilisé pour les travaux de culture et d’entretien. |
| Éthanol ; | --- | --- | Utilisé pour la sterlisation générale. |
| Sérum de Bovin Fœtal ; | Gibco par ThermoFisher ; | 10270-106 | |
| Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de souris à adsorption croisée, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific ; | A-21422 | |
| KO-DMEM | Gibco de ThermoFisher ; | 10829018 | Milieu basal pour CSEh indifférenciées, utilisé dans la préparation de milieux de culture |
| L-Glutamine 200mM (100x) | Gibco par ThermoFisher | 25030-081 | |
| Méthanol, pour la biologie moléculaire ; | Hi-Media ; | MB113 | |
| Huile rouge O | HiMedia ; | CCK013-1KT | |
| Paraformaldéhyde ; | loba chemie | 30525-89-4 | |
| Pénicilline Streptomycine (100x) | Gibco de ThermoFisher ; | 15140- 122 | |
| Phalloïdine (réactif ActinGreen 488 ReadyProbes) | Invitrogen ; | R37110 | |
| Nitrate d’argent | HiMedia ; | MB156-25G | |
| Thiosulfate de sodium pentahydraté | Chemport | 10102-17-7 | |
| Sphero Rainbow Particules fluorescentes, 3.0 - 3.4 & micro ; m | BD Biosciences | 556291 | |
| Tampon de coloration ; | Préparé dans le MIRM ; | ---- | Il a été préparé à l’aide de 2 % FBS dans PBS ; |
| StemPro Adipogenèse Différenciation Média Basal ; | Gibco par ThermoFisher ; | A10410-01 | Milieu de base pour milieu adipogénique |
| Supplément d’adipogenèse StemPro | Gibco de ThermoFisher. | A10065-01 | Milieux d’induction pour milieux adipogènes |
| Supplément de chondrogenèse StemPro | Gibco de ThermoFisher ; | A10064-01 | Milieux d’induction pour milieux chondrogènes |
| Supplément d’ostéogenèse StemPro | Gibco de ThermoFisher ; | A10066-01 | Milieux d’induction pour milieux ostéogènes |
| StemPro Ostéogenèse/chondrogenèse Différenciation des milieux basaux ; | Gibco par ThermoFisher ; | A10069-01 | Milieux de base pour milieux osttégéniques et chondrogènes |
| Triton-X-100 | Hi-Media ; | MB031 | |
| Trypan Bleu ; | Gibco par life technologies ; | 15250-061 | |
| Trypsine - EDTA Solution 1x | Hi-media ; | TCL049 | |
| Tween-20 ; | MERCK ; | Référence 9005-64-5 |
Références
- Kobolak, J., Dinnyes, A., Memic, A., Khademhosseini, A., Mobasheri, A. Mesenchymal stem cells: Identification, phenotypic characterization, biological properties and potential for regenerative medicine through biomaterial micro-engineering of their niche. Methods. 99, 62-68 (2016).
- Wilson, A., Hodgson-Garms, M., Frith, J. E., Genever, P.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
