Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques

Elena Levi-D’Ancona; Vaibhav Sidarala; Scott A. Soleimanpour

doi:10.3791/65789

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Article de méthode

Approches complémentaires pour interroger le flux de mitophagie dans les cellules β pancréatiques

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DOI :

10.3791/65789

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15 septembre 2023

Elena Levi-D’Ancona¹^,² , Vaibhav Sidarala¹ , Scott A. Soleimanpour¹^,³^,⁴

¹Department of Internal Medicine, Division of Metabolism, Endocrinology and Diabetes, University of Michigan, Ann Arbor, ²Graduate Program in Immunology, University of Michigan Medical School, ³Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, ⁴VA Ann Arbor Healthcare System

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit deux méthodes pour l’analyse quantitative de la mitophagie dans les cellules β pancréatiques : premièrement, une combinaison de colorants spécifiques aux mitochondries perméables aux cellules, et deuxièmement, un rapporteur de mitophagie génétiquement codé. Ces deux techniques sont complémentaires et peuvent être déployées en fonction de besoins spécifiques, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’adressage quantitatif du contrôle de la qualité mitochondriale.

Résumé

La mitophagie est un mécanisme de contrôle de la qualité nécessaire au maintien d’une fonction mitochondriale optimale. Une mitophagie dysfonctionnelle à β cellules entraîne une libération insuffisante d’insuline. Les évaluations quantitatives avancées de la mitophagie nécessitent souvent l’utilisation de rapporteurs génétiques. Le modèle murin mt-Keima, qui exprime une sonde à double rapport d’excitation sensible au pH ciblant les mitochondries pour quantifier la mitophagie par cytométrie en flux, a été optimisé dans les cellules β. Le rapport entre les émissions de longueur d’onde mt-Keima acides/neutres peut être utilisé pour quantifier de manière robuste la mitophagie. Cependant, l’utilisation de rapporteurs de mitophagie génétique peut être difficile lorsque l’on travaille avec des modèles murins génétiques complexes ou des cellules difficiles à transfecter, telles que les îlots humains primaires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode complémentaire à base de colorants pour quantifier la mitophagie à cellules β dans les îlots primaires à l’aide de MtPhagy. MtPhagy est un colorant sensible au pH et perméable aux cellules qui s’accumule dans les mitochondries et augmente son intensité de fluorescence lorsque les mitochondries se trouvent dans des environnements à faible pH, tels que les lysosomes pendant la mitophagie. En combinant le colorant MtPhagy avec la fluozine-3-AM, un indicateur de Zn²⁺ qui sélectionne les cellules β, et la tétraméthylrhodamine, ester éthylique (TMRE) pour évaluer le potentiel de la membrane mitochondriale, le flux de mitophagie peut être quantifié spécifiquement dans les cellules β par cytométrie en flux. Ces deux approches sont très complémentaires, ce qui permet une flexibilité et une précision dans l’évaluation du contrôle de la qualité mitochondriale dans de nombreux modèles β cellules.

Introduction

Les cellules β pancréatiques produisent et sécrètent de l’insuline pour répondre aux demandes métaboliques, et le dysfonctionnement des cellules β est responsable de l’hyperglycémie et de l’apparition du diabète dans les diabètes de type 1 et de type 2. Les β-cellules couplent le métabolisme du glucose avec la sécrétion d’insuline via l’énergétique mitochondriale et la production métabolique, qui dépendent d’une réserve de masse mitochondriale fonctionnelle ^1,2,3. Pour maintenir une fonction optimale des β cellules, les cellules β s’appuient sur des mécanismes de contrôle de ....