Optimisation de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides fraîches et congelées pour le séquençage multiome

Résumé

Le protocole fournit une approche fiable et optimisée de l’isolement des noyaux à partir d’échantillons de tumeurs solides pour le séquençage multiome à l’aide de la plate-forme 10x Genomics, y compris des recommandations pour les conditions de dissociation des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires et l’évaluation des noyaux isolés.

Résumé

Le séquençage multiome, qui fournit des données de séquençage (séquençage ATAC), qui fournit des données de séquençage de l’ARN unicellulaire identique ou apparié et le test de la chromatine accessible par transposase (séquençage ATAC), représente une percée dans notre capacité à discerner l’hétérogénéité des cellules tumorales, un objectif principal de la recherche translationnelle sur le cancer à l’heure actuelle. Cependant, la qualité des données de séquençage acquises à l’aide de cette modalité avancée dépend fortement de la qualité du matériau d’entrée.

Les conditions de digestion doivent être optimisées pour maximiser le rendement cellulaire sans sacrifier la qualité. Ceci est particulièrement difficile dans le contexte des tumeurs solides avec des matrices desmoplastiques denses qui doivent être décomposées doucement pour la libération cellulaire. Les cellules fraîchement isolées du tissu tumoral solide sont plus fragiles que celles isolées des lignées cellulaires. De plus, comme les types de cellules isolées sont hétérogènes, les conditions doivent être sélectionnées pour soutenir la population cellulaire totale.

Enfin, les conditions d’isolement nucléaire doivent être optimisées en fonction de ces qualités en termes de temps de lyse et de types/ratios de réactifs. Dans cet article, nous décrivons notre expérience de l’isolement nucléaire pour la plate-forme de séquençage multiome 10x Genomics à partir d’échantillons de tumeurs solides. Nous fournissons des recommandations pour la digestion des tissus, le stockage des suspensions unicellulaires (si désiré), ainsi que l’isolement et l’évaluation nucléaires.

Introduction

Au fur et à mesure que nos connaissances sur la biologie des tumeurs augmentent, l’importance de l’analyse des cellules hétérogènes dans le microenvironnement tumoral a également augmenté ^1,2. La possibilité d’acquérir de l’ARN unicellulaire et le dosage de la chromatine accessible par transposase avec des données de séquençage (séquençage ATAC) à partir de la même cellule à la manière d’une cellule appariée (séquençage multiome) constitue une avancée significative vers cette fin ^3,4. Cependant, ces expériences sont coûteuses et prennent beaucoup de temps, et la qualité et l’impact des données acquises dépendent fortement de la qualité des conditions expérimentales et des matériaux. Des protocoles normalisés pour l’isolement des noyaux ont été publiés ^5,6. Les tissus frais et hétérogènes nécessitent une optimisation du protocole, car les cellules fraîchement isolées à partir d’échantillons de tumeurs solides sont plus fragiles que celles isolées à partir de lignées cellulaires.

Une autre considération est que pour les tumeurs solides, les échantillons chirurgicaux ne sont souvent pas disponibles de la salle d’opération avant la fin de la journée. Ainsi, il n’est généralement pas possible de passer directement de l’acquisition de l’échantillon à la capture des noyaux sans une étape de cryoconservation. D’après notre expérience, la congélation d’une suspension unicellulaire permet d’obtenir des noyaux de la plus haute qualité (plutôt que des tissus entiers surgelés ou d’autres modalités de conservation). Cela est particulièrement vrai pour les types de tissus enzymatiques à forte teneur en RNase tels que le pancréas.

Les conditions de digestion des tissus doivent également être conçues pour maximiser le rendement cellulaire sans sacrifier la qualité⁷. Dans le contexte des types de tumeurs solides avec des matrices desmoplastiques denses⁸, la matrice extracellulaire doit être décomposée en douceur pour la libération cellulaire. De plus, étant donné que les types de cellules isolées sont hétérogènes, les conditions doivent être ajustées pour soutenir la population cellulaire totale. Des échantillons de cancer du pancréas humain (adénocarcinome canalaire pancréatique) sont utilisés dans le protocole décrit. Le cancer du pancréas représente un type de tumeur hautement desmoplastique, ce qui laisse présager des tissus et des cellules relativement collants. De plus, comme les échantillons de tumeurs pancréatiques disponibles pour la recherche ont également tendance à être relativement petits, des efforts sont faits pour maximiser la quantité de cellules capturées.

L’isolement des noyaux nécessite le plus d’optimisation en termes de conditions et de temps de lyse cellulaire, ainsi que de types et de ratios de réactifs. La manipulation des noyaux au cours de l’isolement nécessite également une grande prudence. Dans cet article, nous décrivons notre expérience dans l’optimisation de l’isolement nucléaire pour la plateforme de séquençage multiome 10x Genomics à partir de tissus tumoraux solides (Figure 1). Nous fournissons des recommandations pour la digestion des tissus, la cryoconservation des suspensions unicellulaires (si vous le souhaitez) et l’isolement nucléaire.

Protocole

Des échantillons de cancer du pancréas humain (adénocarcinome canalaire pancréatique) ont été prélevés dans notre laboratoire selon un protocole approuvé par l’IRB. Le consentement éclairé des patients a été obtenu pour le prélèvement de tissus. Les tissus ont été transportés de la salle d’opération au laboratoire, puis traités comme suit.

1. Dissociation tissulaire (digestion)

1. Préparez le tampon de synthèse (voir le tableau des matériaux).
2. Obtenir le tissu d’intérêt dès que possible après l’exérèse de la tumeur et transporter l’échantillon dans un tampon de trempe (DMEM F-12 avec ~5% de sérum de veau fœtal) ou 1x PBS sur glace.
3. Hacher le tissu à l’aide d’une pince propre et de ciseaux dans 3 à 5 mL de tampon de digestion dans une boîte de Pétri de 90 mm (Figure 2A).
4. Transférez le tissu haché dans un tube conique de 50 mL et dissociez-le dans ~10 mL de tampon digéré pendant 30 min à 37 °C à l’aide d’un bain-marie avec fonction d’agitation ou d’un agitateur sec.
5. Retirer de l’agitateur et tremper avec ~20 mL de milieu de trempe. Filtrez la solution à travers une crépine cellulaire de 100 μm dans un tube conique propre.
6. Récupérez les tissus solides restants de la passoire (émincez à nouveau les morceaux de tissu restants si nécessaire) et placez-les dans ~10 mL de tampon Digest frais pendant encore 30 minutes à 37 °C en agitant. Répétez l’opération jusqu’à ce que tout le tissu tumoral ait été dissocié.
7. Aliquotes de suspension de cellules de piscine et filtre à travers une crépine de 70 μm suivie d’une crépine de cellules de 40 μm dans un tube conique propre sur de la glace.
8. Centrifuger dans des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter le surnageant.

2. Cryoconservation

1. Rincez les cellules en remettant la pastille en suspension dans 1 mL de PBS 1x.
2. Transférez la suspension cellulaire (~1 à 10 millions de cellules/tube pour une congélation optimale) dans un flacon cryogénique de 1,5 ml sur glace.
3. Centrifuger dans des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter le surnageant.
4. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de solution de Bambanker, les transférer dans un flacon cryogénique de 1,5 ou 2 mL (figure 2B) et les congeler à l’aide d’un récipient de congélation à vitesse de refroidissement de -1 °C/min (contenant de l’alcool isopropylique à 100 %) à -80 °C, ou les transférer à l’azote liquide si l’on prévoit un stockage à plus long terme de l’échantillon.

3. Isolement des noyaux

1. Décongelez rapidement le cryofiole de suspension cellulaire et placez-le sur de la glace humide.
2. Transférez la suspension cellulaire décongelée dans un tube de microcentrifugation de 2 mL et complétez le flacon dans une solution de 2 mL avec 1x PBS pour rincer les cellules.
3. Obtenir une numération cellulaire manuelle à l’aide d’un hémocytomètre pour évaluer à la fois la quantité et la qualité des cellules (figure 2C).
4. Centrifuger sur des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, puis décanter doucement le surnageant à l’aide d’embouts de pipette de plus en plus petits pour laisser une pastille sèche et la maintenir sur de la glace.
   1. Utilisez un rotor à godets oscillants pour toutes les étapes de centrifugation. Pour un rendement maximal des cellules, placez les tubes dans la centrifugeuse avec la charnière tournée vers l’extérieur, puis décantez avec l’embout de pipette dirigé vers le côté opposé du tube (Figure 2D).
      REMARQUE : Pour décanter le surnageant, utilisez des pointes de pipette de plus en plus petites pour éliminer le liquide afin de limiter la perturbation de la pastille tout en maximisant le volume de fluide décanté. Cette stratégie est particulièrement utile plus tard dans le protocole suivant l’extraction des noyaux, car la pastille des noyaux n’est généralement pas visible.
5. Préparez 1x tampon de lyse cellulaire, tampon de dilution de lyse cellulaire et tampon de lavage (Figure 3A) selon le protocole publié avec les modifications suivantes (voir Tableau 1, Tableau des matériaux) :
   REMARQUE : Placez la digitonine sur un bloc chauffant à 65 °C avant utilisation pour dissoudre le précipité (Figure 3B). Cela prend généralement environ 10 minutes.
6. Préparez le tampon de lyse cellulaire 0,1x en combinant 100 μL de tampon de lyse cellulaire 1x et 900 μL de tampon de dilution de lyse cellulaire, pipetez doucement pour mélanger et placez-le sur de la glace.
7. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de tampon de lyse cellulaire 0,1x refroidi et pipeter doucement pour mélanger 5x.
8. Incuber sur de la glace pendant 3 minutes (figure 3C).
9. Ajouter 1 mL de tampon de lavage réfrigéré et pipeter de haut en bas pour mélanger délicatement 5 fois.
10. Centrifuger pour granuler les noyaux à 500 × g pendant 5 min à 4 °C, décanter doucement le surnageant en pastille sèche et maintenir sur glace.
    REMARQUE : Si le nombre de cellules de départ est faible (100 000 à 200 000 cellules), effectuez les étapes de lyse et de lavage des cellules dans un tube PCR de 200 μL au lieu d’un tube de microcentrifugation de 2 mL pour réduire la surface du tube et minimiser les pertes. Dans ce cas, ajustez le volume du tampon de lavage vers le bas pour s’adapter au plus petit volume du tube.
11. Répétez les étapes 3.9-3.10 2x pour un total de trois lavages.
12. Comptez manuellement les noyaux à l’aide d’une lame d’hémocytomètre sous le microscope. Utilisez un colorant bleu trypan si vous le souhaitez pour fournir un contraste permettant de visualiser les noyaux et d’aider à distinguer les noyaux des cellules non lysées.
13. Préparez le tampon 1x noyaux selon le protocole publié : 20x stock tampon de noyaux, 1 mM DTT, 1 inhibiteur U/μL de la RNase dans de l’eau sans nucléase et conservez-le sur glace (voir le tableau des matériaux).
14. Remettre en suspension la pastille de noyaux dans 1x Nuclei Buffer en fonction de la récupération des noyaux ciblés sur l’objectif.
    NOTA : Si la concentration est suffisamment élevée, viser une récupération ciblée de 10 000 ou légèrement plus à cette étape (3 230 à 8 060 noyaux/μL) lors de la détermination du volume de remise en suspension de départ, compte tenu de la perte de volume prévue de 25 μL et de la diminution de 20 % de la concentration avec filtration (étape 3.15).
15. Passez doucement le volume des noyaux remis en suspension à travers une crépine cellulaire à pointe de pipette de 40 μm et placez les noyaux sur de la glace (Figure 3D).
16. Comptez les noyaux (Figure 4A-C). Diluez davantage la solution finale avec Nuclei Buffer si nécessaire.
17. Transportez les noyaux sur de la glace et procédez immédiatement à la capture des noyaux selon les protocoles publiés.

Résultats

Pour isoler des noyaux de haute qualité à partir d’échantillons de tumeurs solides de patients pour le séquençage multiome (Figure 1), le tissu tumoral a été dissocié et une suspension unicellulaire a été cryopréservée (Figure 2A-D). La suspension cellulaire a ensuite été décongelée au moment de la capture planifiée du multiome. La capture des noyaux a été effectuée à l’aide de réactifs tampons de lyse et d’un timing optimisés a...

Discussion

Démêler les populations cellulaires hétérogènes présentes dans le microenvironnement tumoral est un domaine d’intérêt actif en biologie du cancer. De même, des tissus complexes existent dans les pathologies bénignes telles que la cicatrisation des plaies et la fibrose. Le séquençage multiome est apparu comme un outil puissant permettant l’acquisition de données de séquençage de l’ARNsc et de l’ATAC appariés de cellules identiques. Ce protocole décrit l’isolement des noyaux, ce qui exige une optimisation dans le cadre du ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100, 70 et 40 &mu ; m Crépines à cellules Falcon  ;	; ThermoFisher
10x Genomics Nuclei Buffer (20x)	10x Genomics	2000153/2000207
Bambanker  ;	Wako, Fisher Scientitic	NC9582225  ;
BSA	Miltenyi Biotec	130-091-376
Chlorure	de calcium Sigma Aldrich	499609
Collagénase (Collagénase Type IV)	ThermoFisher	17104019
Digitonin	Thermo Fisher	BN2006
DNase I	Worthington	LS006330
DTT	Sigma Aldrich	646563
Dulbecco' s Modified Eagle Medium F-12	Thermo Fisher	11320082
Sérum de bovin fœtal	Thermo Fisher	10438026
Flowmi 40 &mu ; m  ; Passoire à cellules d’embout de pipette  ;	Sigma Aldrich	BAH136800040
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Histopaque-1119 Solution de séparation cellulaire à gradient	Sigma Aldrich	11191
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520
MgCl2	Sigma Aldrich	M1028
Miltenyi GentleMACSTM digest kit  ;
NaCl	Sigma Aldrich	59222C
Nalgene Cryo « Mr. Frosty » Conteneur de congélation	; ThermoFisher	5100-0001
Nonident P40 Substitut	Sigma Aldrich	74385
Poloxamer 188	Sigma	P5556
Inhibiteur de la RNASE  ;	Sigma Aldrich	3335399001
Tris-HCl	Sigma Aldrich	T2194
Tween-20	Thermo Fisher	85113