Dosage de l’activité du facteur tissulaire des vésicules extracellulaires

Résumé

Nous décrivons ici un test interne d’activité du facteur tissulaire des vésicules extracellulaires. Des tests basés sur l’activité et des tests basés sur l’antigène ont été utilisés pour mesurer le facteur tissulaire dans les vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de plasma humain. Les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène.

Résumé

Le facteur tissulaire (TF) est un récepteur transmembranaire du facteur (F) VII et FVIIa. Le complexe TF/FVIIa initie la cascade de coagulation en activant à la fois FIX et FX. Le TF est libéré des cellules dans la circulation sous forme de vésicules extracellulaires (VE). Le niveau de VE TF-positif (⁺) est augmenté dans diverses maladies, y compris le cancer, les infections bactériennes et virales et la cirrhose, et est associé à la thrombose, à la coagulation intravasculaire disséminée, à la gravité de la maladie et à la mortalité. Il existe deux façons de mesurer les VE TF⁺ dans le plasma : les tests basés sur l’antigène et l’activité. Les données indiquent que les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur l’antigène. Cet article décrit notre test d’activité EVTF interne basé sur un test de génération FXa en deux étapes. FVIIa, FX et calcium sont ajoutés aux échantillons contenant de l’EV TF⁺ pour générer de l’FXa en présence ou en l’absence d’anticorps anti-TF afin de distinguer la génération de FXa dépendante de la TF de la génération de FXa indépendante de la TF. Un substrat chromogène clivé par FXa est utilisé pour déterminer le niveau de FXa, tandis qu’une courbe standard générée avec un TF recombinant relipidé est utilisée pour la détermination de la concentration de TF. Ce test d’activité EVTF interne a une sensibilité et une spécificité plus élevées qu’un test d’activité TF commercial.

Introduction

La coagulation sanguine est initiée par la liaison du facteur (F) VII/VIIa au facteur tissulaire (TF)¹. Le complexe TF/FVIIa active à la fois FIX et FX pour activer la coagulation sanguine¹. Il existe deux formes de TF pleine longueur, liée à une membrane : cryptée et active. De plus, il existe une forme alternative d’épissage de TF (asTF). La sphingomyéline et la phosphatidylcholine dans le feuillet externe de la membrane cellulaire maintiennent la TF dans un état crypté ^2,3,4. Lorsque les cellules sont activées ou endommagées, la phospholipide scramblase transfère la phosphatidylsérine et d’autres phospholipides chargés négativement dans le feuillet externe¹. L’activation des cellules entraîne également la translocation de la sphingomyélinase acide vers le feuillet externe où elle dégrade la sphingomyéline en céramide⁵. Ces deux mécanismes convertissent le TF crypté en forme active. Il est également proposé que la protéine disulfure isomérase intervienne dans la formation de liaisons disulfure entre Cys186 et Cys209 dans TF crypté, ce qui entraîne le déchiffrement de TF ^6,7,8. asTF est également présent dans la circulation mais n’a pas le domaine transmembranaire et est donc soluble ^9,10. Il est important de noter que l’asTF a de très faibles niveaux d’activité procoagulante par rapport au TF^10,11 actif sur toute sa longueur.

Les vésicules extracellulaires (VE) sont libérées par les cellules hôtes au repos, activées et mourantes, ainsi que par les cellules cancéreuses¹². Les VE expriment des protéines à partir de leurs cellules parentales¹². Les VE actifs contenant du TF sont libérés par les monocytes activés, les cellules endothéliales et les cellules tumorales dans la circulation 13,14,15. Les niveaux de TF dans le plasma peuvent être mesurés par des tests basés sur l’activité et l’antigène. Les tests basés sur les antigènes comprennent l’ELISA et la cytométrie en flux¹⁶. Il existe deux tests différents basés sur l’activité : les tests d’activité TF en une et en deux étapes. Le test en une étape est basé sur un test de coagulation à base de plasma. L’échantillon contenant du TF est ajouté au plasma et le temps nécessaire à la formation d’un caillot est mesuré après recalcification. Le test en deux étapes mesure la génération FXa d’échantillons en ajoutant FVII ou FVIIa, FX et calcium. Les niveaux de FXa sont déterminés à l’aide d’un substrat clivé par FXa.

Dans les essais d’activité TF en une et deux étapes, la concentration de TF est déterminée à l’aide d’une courbe standard générée avec de la TF recombinante. Les tests en deux étapes ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests en une étape. De nombreuses études ont confirmé que les tests basés sur l’activité ont une sensibilité et une spécificité plus élevées que les tests basés sur les antigènes 17,18,19,20,21. De plus, notre test d’activité interne a une sensibilité et une spécificité plus élevées qu’un test d’activité commerciale²². Les individus en bonne santé ont des niveaux très faibles ou indétectables d’activité EVTF dans le plasma. En revanche, les personnes atteintes d’affections pathologiques, telles que le cancer, la cirrhose, la septicémie et l’infection virale, ont des niveaux détectables d’activité EVTF, ce qui est associé à une thrombose, à une coagulation intravasculaire disséminée, à la gravité de la maladie et à la mortalité 23,24,25,26,27,28. Nous décrirons ici ce test d’activité EVTF en deux étapes.

Protocole

La recherche a été approuvée par l’Institutional Review Board de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill (numéro de protocole : 14-2108).

1. Collecte de sang auprès des donneurs

1. Prélever du sang total à l’aide d’une ponction veineuse propre dans la veine antécubitale à l’aide d’une aiguille de 21 G. Jetez les 3 premiers mL de sang, car cette portion de sang peut contenir de l’acide folique provenant de cellules périvasculaires.
2. Prélever 2,7 ou 1,8 mL (selon la taille des tubes) de sang dans un vacutainer contenant 3,2 % de citrate de sodium (0,109 mol/L). Ne remplissez pas trop ou pas assez les tubes. Retournez doucement les tubes immédiatement après le prélèvement sanguin pour disperser le citrate de sodium.
3. Éviter l’agitation si les tubes sont transportés avant le traitement. Préparez le plasma dans les 2 heures suivant le prélèvement sanguin.

2. Préparation du plasma témoin négatif

REMARQUE : Les échantillons ne doivent jamais être placés sur de la glace avant la congélation finale.

1. Préparer du plasma témoin négatif en utilisant du sang total de volontaires sains. Immédiatement après le prélèvement sanguin, préparez du plasma exempt de plaquettes comme suit.
   1. Transférez les échantillons de sang des tubes vacutainer dans des tubes de 15 ml.
   2. Centrifuger des échantillons de sang à 2 500 × g pendant 15 min à température ambiante (20-24 °C) sans frein.
   3. Transférez le surnageant (plasma pauvre en plaquettes) dans un nouveau tube et répétez l’essorage dans les mêmes conditions.
   4. Transférez le surnageant (plasma appauvri en plaquettes) dans un nouveau tube.
   5. Aliquote l’échantillon en aliquotes de ≥100 μL. Laissez environ 100 μL au fond du tube.
   6. Congeler immédiatement le plasma appauvri en plaquettes à −80 °C (Figure 1).

3. Préparation du plasma de contrôle positif

REMARQUE : La réponse aux lipopolysaccharides varie d’un individu à l’autre.

1. Transférez les échantillons de sang des vacutainers dans des tubes de 15 ml.
2. Préparer du plasma témoin positif en utilisant du sang total de volontaires sains stimulés par le lipopolysaccharide (LPS) d’Escherichia coli O111 :B4 (10 μg/mL) pendant 5 h à 37 °C avec agitation.
3. Après 5 h d’incubation, suivez les étapes 2.1.2 à 2.1.6.

4. Isolement des vésicules extracellulaires du plasma

REMARQUE : Les granulés EV peuvent ne pas être visibles. Le temps de décongélation dépend du volume de l’échantillon, mais nous décongelons généralement du plasma de 100 μL pendant 30 min à 37 °C.

1. Décongeler les échantillons de plasma à 37 °C.
2. Ajouter 1 mL de tampon HBSA sans calcium [HBSA-Ca(-)] [137 mM de NaCl, 5,38 mM de KCl, 5,55 mM de glucose, 10 mM de HEPES, 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine] à chaque 100 μL d’échantillon de plasma dans un tube de 1,5 mL.
3. Centrifuger des échantillons de plasma à 20 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
4. Aspirer le surnageant jusqu’à 20 μL sans perturber la pastille EV.
5. Reconstituer la pastille EV en ajoutant 1 mL de tampon HBSA-Ca(-) dans chaque tube, pipeter de haut en bas à l’emplacement de la pastille EV et faire vortex chaque tube avant de centrifuger une deuxième fois à 20 000 × g pendant 15 min à 4 °C.
6. Aspirer le surnageant jusqu’à 20 μL sans perturber la pastille EV.
7. Reconstituer la pastille EV dans 80 μL de HBSA-Ca(-) et pipeter de haut en bas à l’emplacement de la pastille EV (Figure 2).

5. Option : Isolement de petites vésicules extracellulaires à l’aide d’une ultracentrifugeuse

1. Après l’étape 4.3, prélever le surnageant et l’ultracentrifugeuse à 100 000 × g pendant 70 min à 4 °C.
2. Aspirer le surnageant jusqu’à 20 μL sans perturber la pastille EV.
3. Reconstituer la pastille EV en ajoutant 1 mL de tampon HBSA-Ca(-) dans chaque tube et en vortex chaque tube avant d’ultracentrifuger une seconde fois à 100 000 × g pendant 70 min à 4 °C.
4. Aspirer le surnageant jusqu’à 20 μL sans perturber la pastille EV.
5. Reconstituer la pastille EV dans 80 μL de HBSA-Ca(-).

6. Mesure de l’activité du facteur tissulaire des vésicules extracellulaires

REMARQUE : Les échantillons de VE doivent être pipetés et bien mélangés avant d’être ajoutés aux puits. L’EDTA-disodique inhibera la capacité de FXa à cliver le substrat chromogène. Par conséquent, l’EDTA-disodique ne peut pas être utilisé en remplacement de l’EDTA-tétrasodique à l’étape 6.7.

1. Ajouter 40 μL d’un échantillon de VE à deux puits d’une plaque de 96 puits.
2. Ajouter 11 μL d’IgG anti-TF humaine inhibitrice chez la souris [(36,4 μg/mL, concentration finale 7,8 μg/mL)] à un puits d’un échantillon EV et 11 μL d’IgG de souris témoin [(36,4 μg/mL, concentration finale 7,8 μg/mL)] à l’autre puits.
3. Incuber la plaque à 96 puits pendant 15 min à température ambiante.
4. Pendant la période d’incubation, préparer 50 μL/puits d’étalons de TF (0, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5, 5, 10 et 20 pg/mL) en double avec du TF relipidant.
5. Préparer le mélange de facteurs en mélangeant 4 mL d’HBSA avec du calcium [HBSA-Ca(+)] [HBSA-Ca(-) + 10 mM CaCl₂, concentration finale 10 mM], 800 μL de 900 nM FX dans HBSA-Ca(+) (concentration finale : 146,4 nM) et 120 μL de 200 nM FVIIa dans HBSA-CA(+) (concentration finale : 4,8 nM).
6. Ajouter 50 μL de la solution de mélange factoriel dans chaque puits, recouvrir la plaque d’un film et incuber pendant 2 h dans un incubateur à 37 °C.
7. Après 2 h, arrêter la production de FXa en ajoutant 25 μL de tampon d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) HBSA [HBSA-Ca(-) + 25 mM EDTA-tétrasodium, concentration finale 5 mM] et incuber pendant 5 min à température ambiante.
8. Reconstituer le substrat chromogène clivé par FXa à 4 mM (ajouter 8,7 mL d’eau distillée dans un flacon de 25 mg).
9. Ajouter 25 μL de solution de substrat chromogène dans chaque puits, recouvrir la plaque d’un film puis d’une feuille d’aluminium pour la protéger de la lumière, et incuber pendant 15 min à 37 °C.
10. Après 15 min d’incubation, retirer les bulles à l’aide d’une aiguille ou par centrifugation à 1 500 × g pendant 1 min.
11. Lire la plaque à 405 nm à l’aide d’un lecteur de plaques avec un mélange avant de lire.
12. Convertissez la génération FXa de chaque puits en activité TF à l’aide de la courbe standard générée à l’aide de TF relipidant.
13. Calculer la génération de FXa dépendante de TF (activité EVTF) à l’aide de l’équation (1) :
    Génération d’effets FXa dépendants de la TF (activité de l’EVTF [pg/mL]) = Production totale d’effets de l’effet (puits d’IgG témoin) - Génération d’effets d’effets lourds indépendante de la TF (puits d’IgG anti-TF) (Figure 3) (1)

Résultats

Un résultat positif donne une valeur de contrôle positive de ≥0,5 pg/mL et une valeur de contrôle négative de <0,5 pg/mL. Il est préférable de trouver un répondeur LPS élevé avec une activité EVTF de >1,0 pg/mL pour un contrôle positif. Le résultat représentatif montre l’activité EVTF des VE isolés du plasma du sang total de 11 donneurs sains, avec et sans activation du LPS (Figure 4). Six donneurs sur onze (donneurs 2, 4, 5, 8, 10, 11) répondaient moyennement à haut au LPS, tandis que...

Discussion

Ici, le protocole de notre test d’activité EVTF interne est présenté. Il y a trois étapes critiques dans le protocole. Lors de la reconstitution de la pastille EV, il est important de pipeter de haut en bas à l’emplacement de la pastille EV, même si elle n’est pas visible. Une reconstitution incomplète de la pastille EV entraînera un faux négatif ou une sous-estimation des valeurs d’activité EVTF des échantillons. Deuxièmement, l’utilisation de HBSA-Ca(+) est essentielle à l’étape 6.5 du protocole, car la génération de F...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube de 1,5 mL pour 20 000 centrifugeuses g	n’importe quelle entreprise	N/A	Nous utilisons celle de Fisher Scientific (numéro de catalogue : 05-408-129).
Tube de 1,5 mL pour ultracentrifugeuse	n’importe quelle entreprise	N/A	Nous utilisons celui de Beckman Coulter (Numéro de catalogue : 357448)
Tube de 15 mL	n’importe quelle entreprise	N/A	Nous utilisons celui de VWR (Numéro de catalogue : 89039-666)
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Kit de prélèvement sanguin avec 12 po. tube et adaptateur Luer	BD	367281
plaque 96 puits	n’importe quelle entreprise	N/A	Nous utilisons celui de Globe Scientific (Numéro de catalogue : 120338).
Tubes de citrate BD Vacutainer BD		363083
Albumine sérique bovine	Sigma Aldrich	A9418
Chlorure de calcium	Fisher Scientific	C69-500
Centrifugeuse pour tube de 1,5 mL	n’importe quelle entreprise	N/A	Nous utilisons la centrifugeuse 5417R (Eppendorf).
Centrifugeuse pour tube de 15 mL	n’importe quelle entreprise	N/A	Nous utilisons la centrifugeuse 5810R (Eppendorf).
D-(+)-Glucose	Sigma Aldrich	G7021
Acide éthylènediaminetétraacétique sel tétrasodique dihydraté	Sigma Aldrich	E6511
Hepes	Sigma Aldrich	H4034
Laboratoire de recherche sur les enzymes	humaines FVIIa	HFVIIa	La solution doit être diluée avec HBSA-Ca(+).
Human FX	Enzyme Research Laboratory	HFX1010	La solution doit être diluée avec du HBSA-Ca(+).
Facteur tissulaire inhibiteur de souris IgG, clone HTF-1	Fisher Scientific	550252
Lipopolysaccharide d’Escherichia coli O111 :B4	Sigma Aldrich	L2630	Il existe plusieurs lipopolysaccharides de différents E. coli. Différents lipopolysaccharides ont un potentiel différent pour activer les monocytes.
Souris IgG	Sigma Aldrich	I5381
Pefachrome FXa 8595	Laboratoire de recherche enzymatique	085-27
Lecteur de plaques	n’importe quelle entreprise	N/A	Nous utilisons le SpectraMax i3x de Molecular Devices
Facteur tissulaire recombinant relipidé, Dade Innovin	Siemens	10873566
Chlorure de sodium  ;	Fisher Scientific	S271-500
Ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	Optima TLX
Rotor d’ultracentrifugeuse	Beckman Coulter	TLA-55