Des injections intrafémorales simplifiées à l’aide de souris vivantes permettent une analyse continue de la moelle osseuse

Résumé

Ce protocole décrit l’injection intrafémorale de quelques cellules souches hématopoïétiques ou leucémiques, y compris des cellules génétiquement modifiées, dans des modèles murins de xénogreffes, ce qui permettra non seulement une transplantation rapide et sûre de cellules, mais aussi des analyses en série de la moelle osseuse.

Résumé

Malgré la complexité de la greffe de cellules hématopoïétiques chez l’homme, les chercheurs effectuent couramment des injections intraveineuses ou intrafémorales (FI) chez la souris. Dans des modèles murins, cette technique a été adaptée pour améliorer l’efficacité de l’ensemencement des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) transplantées. Cet article décrit une procédure technique détaillée, étape par étape, d’injection d’IF et d’aspiration ultérieure de la moelle osseuse (BM) chez la souris qui permet une caractérisation en série des cellules présentes dans la BM. Cette méthode permet de transplanter des échantillons précieux avec un faible nombre de cellules qui sont particulièrement difficiles à greffer par injection intraveineuse. Cette procédure facilite la création de xénogreffes qui sont essentielles pour l’analyse pathologique. Bien qu’il soit plus facile d’accéder au sang périphérique (PB), la composition cellulaire de la PB ne reflète pas la BM, qui est le créneau des HSPC. Par conséquent, les procédures permettant d’accéder au compartiment BM sont essentielles pour étudier l’hématopoïèse. L’injection de FI et l’aspiration en série de BM, telles que décrites ici, permettent la récupération et la caractérisation prospectives des cellules enrichies en BM, telles que les HSPC, sans sacrifier les souris.

Introduction

Le système sanguin est maintenu tout au long de la vie par les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui résident dans la moelle osseuse (BM^)1,2. Pour étudier les changements dynamiques dans l’environnement de la BM, il est important de comprendre la biologie de l’hématopoïèse normale et maligne ^3,4. La transplantation de CSH directement dans la BM humaine permet une greffe plus élevée que la perfusion de sang périphérique (PB), mais la complexité élevée de la procédure et le risque accru d’infection empêchent cette méthode de faire partie de la pratique standard⁵. Chez la souris, les procédures qui facilitent l’accès à la BM sans sacrifier les animaux fournissent une ressource pour surveiller en série l’hématopoïèse. La procédure décrite vise à produire des souris avec une forte greffe de cellules transplantées et à permettre un échantillonnage en série de la BM de souris vivantes. Cet article se concentrera sur la production de modèles de xénogreffes à l’aide de souris immunodéficientes greffées avec des cellules humaines, qui sont plus difficiles à produire que les modèles d’allotransplantation souris-souris. Par rapport à la transplantation conventionnelle de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) à travers la queue ou la veine rétroorbitaire, les avantages de cette procédure sont une greffe cellulaire élevée avec une faible quantité de matériel de départ.

Bien que l’injection cellulaire intrafémorale (FI) dans la cavité BM de souris soit couramment utilisée pour étudier les HSPC humaines in vivo ^6,7,8, une procédure formelle étape par étape illustrant/filmant cette technique n’a pas été publiée auparavant. Ce protocole permet une greffe élevée à partir d’un faible nombre de cellules transplantées et un mécanisme d’échantillonnage en série du BM. De plus, il est possible d’utiliser cette méthode pour analyser les effets de l’injection de médicaments directement dans la cavité de la BM sur le traitement des maladies du sang. La procédure décrite ici permet d’obtenir l’accès à la BM où résident les cellules hématopoïétiques sans sacrifier les souris.

Ce protocole est similaire à la technique utilisée pour les aspirations BM⁹. La principale différence est que cet article et le protocole vidéo qui l’accompagne détaillent une procédure sûre d’injection de cellules dans la moelle, alors que les articles précédents transplantaient des cellules via la veine, puis effectuaient une aspiration en série de la BM. Ce protocole permet une greffe réussie avec un petit nombre de lignées cellulaires (Figure 1), des HSPC dérivées du sang de cordon normal (CB) (CD34⁺) (Figure 2) et des HSC (CD34⁺CD38-CD45RA-CD90⁺) (Figure 3), des HSPC normaux dérivés de BM (CD34⁺CD38^-) (Figure 4), des cellules souches leucémiques dérivées de patients (CD34⁺CD38^-) (Figure 5), des HSPC normaux dérivés de CB modifiés par le gène CRISPR/Cas9 (CD34⁺) (Figure 6) et la leucémie myéloïde aiguë (LMA)-iPSC (Figure 7). En particulier pour les CSH normales dérivées du sang de cordon, nous avons pu réaliser avec succès une greffe avec seulement 10 cellules. Cette méthode est particulièrement utile pour les expériences réalisées avec des populations cellulaires rares ou difficiles à générer, telles que la leucémie myéloïde aiguë humaine primaire non modifiée ou génétiquement modifiée, ou les cellules CB. De plus, cette procédure décrit une méthode efficace pour l’analyse en série des cellules greffées, qui peut être immédiatement utilisée dans des expériences en aval. Pour éviter de gaspiller des échantillons précieux et assurer l’injection de FI, nous avons également brièvement décrit ici les pratiques de la procédure¹⁰ basée sur Akaluc pour aider à consolider cette technique.

Protocole

NOD mâle ou femelle de six à dix semaines. Les souris Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) ont été utilisées dans ce protocole, mais il peut être appliqué à tous les types de souris. L’irradiation dépend du contenu expérimental et du type de souris, l’irradiation ou non des souris dépend des objectifs de la recherche. Toutes les procédures sur les animaux décrites ici ont été effectuées conformément aux Directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvées par le Comité administratif sur les soins aux animaux de laboratoire de l’Université Stanford (APLAC #22264). Toutes les populations normales de cellules sanguines ont été triées fraîches. Des échantillons de LMA humaine ont été obtenus chez des patients du Stanford Medical Center avec un consentement éclairé, conformément aux protocoles approuvés par le comité d’examen institutionnel (IRB) (Stanford IRB, 33818).

1. Injection intrafémorale de lignées cellulaires, de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) ou de cellules souches leucémiques (LSC)

REMARQUE : Pour analyser facilement les cellules injectées avec un appareil d’imagerie, une lignée cellulaire K562 positive à Akaluc/tdTomato a été générée, et AkaLumine-HCl/Akaluc a été utilisé comme substrat¹⁰. S’il n’y a pas d’équipement d’imagerie, les cellules peuvent être marquées avec un colorant fluorescent par lentivirus ou PiggyBac et analysées par cytométrie en flux. Quels que soient les détails de la préparation cellulaire, il est important de disposer d’un moyen de prouver que les cellules administrées dans la moelle osseuse ont pénétré de manière fiable dans la BM pour améliorer cette technique (Figure 1).

1. Préparez des suspensions cellulaires (jusqu’à 3 × 10⁶ cellules sanguines) avec 20 μL de tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) (solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) + 2 mM d’EDTA) ou de milieu de décongélation (IMDM + 20 % FBS + Pen/Strep) dans des tubes PCR ou de 1,5 mL et conservez-les sur de la glace avant l’injection.
   REMARQUE : Évitez de faire des bulles d’air pendant que vous suspendez les cellules avec l’aiguille. Les bulles doivent être éliminées autant que possible juste avant l’injection, car l’injection de bulles d’air peut provoquer une mort soudaine des souris.
2. Condition : Souris adultes âgées de 6 à 10 semaines avec 200 cGy (225 kV, 13,3 mA, total 2 Gy [mode de contrôle de la dose]) jusqu’à 48 h avant l’injection des cellules.
3. Tout d’abord, anesthésiez les souris avec une inhalation d’isoflurane dans une chambre d’induction et maintenez à 2 % d’isoflurane dans 100 % d’oxygène à un débit de 1-2 L / min via un cône nasal pour atteindre un état d’anesthésie stable. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie avec un réflexe de pincement des orteils et une respiration lente et régulière, et maintenez cet état tout au long de la procédure d’isoflurane.
   REMARQUE : Surveillez la profondeur de l’anesthésie toutes les 3 à 5 minutes tout au long de la procédure pour vous assurer qu’il n’y a pas de changement dans les fréquences cardiaque et respiratoire avec une manipulation chirurgicale et/ou un pincement de l’oreille, des orteils et de la queue. La couleur des muqueuses et de la peau peut être utilisée comme indicateur de l’oxygénation, car elles seront rosâtres si les souris sont en bon état. Soyez prudent lorsque des rideaux opaques sont placés sur la souris, car il n’est pas toujours possible de voir ce qui se passe avec la souris.
4. Avant l’intervention, administrez aux souris 10 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée pour minimiser la douleur et réchauffez 0,5 à 1,0 ml de solution saline à 0,9 % pour les soins de soutien.
5. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux de la souris pour éviter le dessèchement de la cornée.
6. Gardez la souris sur un coussin chauffant ou une autre surface thermostatique pour éviter l’hypothermie pendant la procédure.
   REMARQUE : Après la procédure, un coussin chauffant réglable en température est utilisé. La température corporelle de la souris est généralement de 37-39 °C, et le pad doit idéalement être légèrement inférieur à cela. En pratique, la température est souvent réglée à 32-36 °C.
7. Désinfectez toute la jambe contenant le fémur à injecter avec trois séries de gommages alternés (en alternance avec un gommage à la povidone iodée ou à la chlorhexidine et des éponges de gaze imbibées à 70 % d’éthanol).
   REMARQUE : 1) Si l’opérateur est gaucher, le fémur gauche de la souris peut être plus facile à injecter que le fémur droit. 2) Dans cette étude, la fourrure n’a pas été retirée pour les injections afin d’éviter des dommages cutanés inutiles, et le site d’entrée de l’aiguille peut être facilement localisé sans couper la fourrure. Cependant, chez les souris à la fourrure foncée, il peut être difficile de localiser le site de ponction, auquel cas, envisagez de couper la fourrure car il est rapide et facile de commencer l’injection.
8. Pincez doucement le fémur avec le pouce et l’index pour stabiliser la jambe. Poussez le tibia avec l’anneau ou le cinquième doigt pour maintenir le tibia plié par rapport au fémur. Le positionnement est important pour une injection réussie (figures supplémentaires S1-S5).
   REMARQUE : Utilisez des pinces pour pincer l’os afin d’éviter de vous blesser aux doigts ; Cependant, il peut être difficile de sentir la tige du fémur et ajoutera du temps à la procédure.
9. Insérez une aiguille stérile vide de 27 G (1/2 pouce) avec une seringue attachée juste sous le tendon rotulien afin que l’aiguille soit logée solidement entre les deux condyles du fémur. Utilisez le bord de l’aiguille et picorez légèrement le tendon rotulien sur le dessus du fémur à quelques reprises pour trouver le meilleur endroit pour insérer l’aiguille (figure supplémentaire S1-S5).
   REMARQUE : Une connaissance de l’anatomie de la zone du genou de la souris est nécessaire avant d’effectuer cette procédure. Les débutants doivent prendre le temps de comprendre l’anatomie de la zone et de pratiquer la procédure sur une souris euthanasiée avant de l’essayer sur une souris vivante.
10. Faites pivoter l’aiguille vers l’extérieur et vers le haut pour vous assurer qu’elle est parallèle à la tige du fémur.
    REMARQUE : Cette manœuvre fournit un chemin fiable vers la cavité de la moelle, facilite la récupération du contenu de la moelle de la tige fémorale et minimise l’inconfort de l’animal lors de la procédure.
11. Tournez l’aiguille en cercles tout en avançant lentement dans la cavité de la moelle fémorale. Insérez l’aiguille jusqu’à ce qu’il y ait une réduction notable de la résistance. Confirmez le bon positionnement de l’aiguille en déplaçant doucement la seringue latéralement. S’il est possible de toucher le bord de l’aiguille avec les doigts sortant de l’os, revenez à l’étape 1.9 et trouvez un autre angle et un autre endroit pour percer l’aiguille.
    1. Assurez-vous que l’angle d’entrée de l’aiguille est perpendiculaire à l’extrémité de l’os.
       REMARQUE : En théorie, l’aiguille doit être injectée parallèlement au fémur et doit être à un angle de 90° par rapport aux extrémités de l’os. S’il y a une résistance de la surface intérieure, l’aiguille a été correctement placée dans la cavité fémorale. Pour vous assurer que l’aiguille est parallèle à l’os, placez une lumière sur le côté de l’os et observez l’ombre de l’os parallèlement à la tige de l’aiguille. La diminution de la résistance à l’entrée dans la cavité médullaire dépend de l’âge de la souris : plus la souris est jeune, plus il est facile de reconnaître la diminution de la résistance.
12. Créez une pression négative en tirant doucement le piston de l’aiguille vers l’arrière tout en déplaçant l’aiguille d’avant en arrière dans la cavité BM. Si l’aiguille se trouve dans la cavité de la BM, du sang ou de la moelle osseuse sortira de la seringue.
    1. Si le sang ou la moelle osseuse n’est pas visible, passez à une nouvelle aiguille et essayez de trouver le même chemin.
       REMARQUE : La raison du changement pour une nouvelle aiguille est qu’une fois que l’os obstrue l’aiguille, il devient difficile de vérifier le reflux du sang / de la moelle. Il est crucial de minimiser le nombre de voies d’injection dans la cavité de la moelle osseuse, car les cellules injectées dans la moelle osseuse ont le potentiel de s’échapper du fémur par les points d’entrée précédents. Si plusieurs voies d’injection sont nécessaires, le risque de fuite peut être réduit en injectant les cellules progressivement plutôt qu’en bolus rapide.
13. Retirez lentement l’aiguille et insérez la seringue contenant la cellule par le même chemin. Essayez d’insérer l’aiguille jusqu’à ce qu’elle s’arrête (au bord de la cavité BM) et tirez un peu (1-2 mm) vers l’arrière à partir de là pour injecter les cellules facilement. Avant d’appuyer sur le piston et de libérer les cellules, aspirez légèrement et vérifiez la présence de sang ou de moelle osseuse pour vous assurer que l’aiguille est correctement placée. Vérifiez d’abord le reflux du sang/de la moelle osseuse, puis poussez lentement la seringue pour injecter les cellules.
    REMARQUES : Il est très important de se rappeler la voie et l’angle de la première injection lors du passage à une nouvelle aiguille. Si le même itinéraire ne peut pas être trouvé, réessayez avec l’aiguille d’origine utilisée pour effectuer le premier itinéraire. Une nouvelle aiguille peut être utilisée à ce moment-là, mais si l’aiguille d’origine est utilisée, l’os coincé doit être expulsé une fois avant utilisation. N’utilisez pas l’aiguille avec les cellules pour trouver une nouvelle voie d’injection ; Sinon, des morceaux d’os coincés dans l’aiguille peuvent empêcher la dispersion cellulaire. Bien que la cavité BM soit très petite, le volume d’injection doit être inférieur à 30 μL, compte tenu de la cavité morte.
    1. Assurez-vous que la vitesse d’injection est lente pour empêcher l’air de la seringue de pénétrer dans la moelle osseuse et pour empêcher les cellules de s’échapper du site de ponction. Si une résistance est ressentie en poussant la seringue, déplacez l’aiguille de haut en bas pour trouver une zone moins résistante dans la cavité.
14. Une fois que les cellules sont injectées avec succès dans le fémur, retirez l’aiguille et la seringue de la souris tout en maintenant la pression sur la seringue.
    REMARQUE : Essayez à nouveau avec l’autre fémur si l’injection ne peut pas être terminée. La procédure est très stressante pour la souris, même sous anesthésie. Surveillez toujours les signes vitaux (cœur et fréquence respiratoire) de la souris et essayez de terminer la procédure dès que possible.
15. Retirez la souris du cône nasal et placez-la sur une serviette en papier propre pour éviter l’aspiration de la litière. Pendant la récupération, gardez la souris sur un coussin chauffant ou une autre surface contrôlée par thermostat. Surveillez toutes les souris pour vérifier la récupération de l’anesthésie avant de les remettre sur le support de souris.
    REMARQUE : Il ne devrait y avoir aucune complication ou détresse après l’aspiration si elle est effectuée correctement. La procédure sera terminée lorsque les souris anesthésiées se seront rétablies et seront capables de se déplacer et d’atteindre la nourriture et l’eau.
16. Observez les souris pour détecter des signes de détresse ou d’infection après l’intervention au cours des 24 prochaines heures. Les signes de détresse ou d’infection comprennent des saignements constants, de l’anémie et de la léthargie. Si l’un de ces signes est observé après l’intervention, euthanasier l’animal par inhalation de CO₂ ou luxation cervicale conformément au protocole de manipulation de l’animal.

2. Aspiration des cellules de la moelle osseuse du fémur pour l’analyse FACS

REMARQUE : La procédure d’aspiration des cellules BM des souris est très similaire aux méthodes décrites dans la section 1 et peut être apprise de certaines publications antérieures ^9,11,12. Ce qui suit est un aperçu de certaines différences entre les protocoles d’injection et d’aspiration de BM.

1. Préparer 500 μL de PBS + 10 mM d’EDTA (milieu de suspension cellulaire : CSM) par échantillon pour suspendre l’aspiration de BM.
2. Mouillez une seringue de 0,5 mL de 27 G avec du CSM avant d’aspirer le BM. Remplissez la seringue avec 200-500 μL de CSM et expulsez-la immédiatement. Répétez cette procédure 2 à 3 fois.
3. Aspirez doucement le BM en retirant le piston de la seringue, ce qui donne 20 à 50 μL de BM de souris. Ensuite, retirer complètement l’aiguille du fémur et suspendre l’échantillon aspiré dans du CSM (500 μL dans un tube de 1,5 mL) pour l’étape de coloration suivante. Retirez la souris du cône nasal et placez-la sur une serviette en papier propre pour éviter l’aspiration de la litière pendant la récupération. Surveillez toutes les souris pour vérifier la récupération de l’anesthésie avant de les remettre sur le support de souris.
   REMARQUE : L’aspiration/prélèvement de la BM peut être répété, mais la procédure répétée le même jour doit être effectuée sur le fémur opposé pour éviter des traumatismes répétés à la même jambe. Bien qu’il y ait peu d’informations sur la fréquence de l’aspiration de la BM, nous pensons que l’aspiration fémorale de la BM est généralement répétée toutes les 4 semaines et peut être effectuée au moins 3 à 4 fois au total sans aucun problème (par exemple, infection) sur la base de notre expérience. Cependant, il faut garder à l’esprit que la moelle osseuse du côté controlatéral de la moelle osseuse transplantée a généralement une greffe cellulaire inférieure.
4. Les cellules granulaires de la moelle osseuse aspirent par une rotation de 5 minutes à 300 × g, 4 °C.
5. Aspirez le surnageant, ajoutez 0,5 à 1 mL de tampon de lyse ACK (150 mM NH₄Cl, 10 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA) dans chaque tube, et agitez le vortex pour remettre les cellules en suspension. Placer sur la glace pendant 5 à 10 min.
6. Filtrez chaque tube à travers une maille de nylon dans un nouveau tube.
7. Rincez le tube avec 1 ml de tampon FACS et ajoutez-le à travers le treillis en nylon dans un nouveau tube également.
8. Granuler les cellules par une rotation de 5 minutes à 300 × g, 4 °C.
9. Aspirez le surnageant et ajoutez la solution de coloration contenant les anticorps souhaités¹³. Placer sur la glace pendant 20 min.
10. Lavez les cellules et analysez-les selon le dispositif expérimental.
    1. Laver les cellules avec un tampon FACS (PBS, 2 % FBS, 2 mM EDTA) et les colorer avec des anticorps pendant 30 min sur de la glace dans un volume total de 50 μL. Laver et colorer les cellules avec de l’iodure de propidium (PI) à une concentration finale de 1 μg/mL immédiatement avant l’analyse ou le tri. Effectuer des analyses post-tri pour vérifier la pureté des populations cellulaires triées.
       REMARQUE : Tous les anticorps utilisés pour la cytométrie en flux sont détaillés dans le tableau des matériaux.
    2. Utilisez les stratégies de contrôle FACS suivantes (Figure 2-7) pour analyser les cellules greffées de la moelle osseuse de souris.
       1. Distinguez les populations de cellules par leurs propriétés de diffusion directe (taille) et latérale (granularité).
       2. Effectuez une discrimination doublet en traçant FSC-H et FSC-W, en suivant SSC-H et SSC-W.
       3. Excluez les cellules mortes.
       4. Distinguer les populations de cellules par CD45 humain et CD45 de souris. Ces combinaisons de coloration d’anticorps permettent de détecter les CD3, CD19 et CD33 humains ainsi que dans la fraction CD45 humaine.
          REMARQUE : Avant de colorer les échantillons, n’oubliez pas d’utiliser des blocs Fc de souris et d’homme pour empêcher la liaison d’anticorps non spécifiques. On colore généralement avec les blocs Fc (souris + humain) pendant 10 min sur de la glace puis on ajoute les anticorps sans laver les cellules. Reportez-vous aux instructions de chaque entreprise sur la façon d’utiliser les anticorps Fc block.

Résultats

Suivant ces protocoles 1,14,15,16,17,18,19,20, chaque échantillon a été transplanté et le modèle de souris xénogreffe a été établi. L’objectif des expériences était de montrer l’injection d’IF avec plusieurs types de cellules humaines et après l’aspiration/...

Discussion

Les modèles de xénogreffe murine sont importants pour l’étude de l’hématopoïèse humaine normale et pathologique. La BM est à l’origine de l’hématopoïèse³ ; par conséquent, l’étude des maladies hématologiques nécessite la greffe réussie de cellules souches humaines rares dans la BM murine. Jusqu’à présent, des méthodes de transplantation telles qu’une veine caudale, une veine rétroorbitaire et une injection IF ont été signalées, et on sait que n’importe laquelle de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue 1/2 ml, 27 g	BD	305620	https://www.bd.com/en-ca/offerings/capabilities/bd-luer-lok-syringe-with-attached-needle/305620
Tampon de lyse ACK	Qualoty Biological	118-156-101CS	https://www.qualitybiological.com/product/ack-lysing-buffer/
Irradiateur biologique	Kimtron	IC-250	https://www.kimtron.com/ic-250
Chlorhexidine	Nolvasan	NDC 54771-8701-1	https://www.zoetisus.com/products/petcare/nolvasan-skin-and-wound-cleanser
Alcool éthylique, épreuve 190	Bouclier		https://goldsd.com/line-card/
FACSCanto II  ;	(Becton Dickinson and Company (BD), Franklin Lakes, NJ, États-Unis
Sérum de veau fœtal (FBS)	Omega Scientific	FB-01	https://www.omegascientific.com/product/fetal-bovine-serum-usda-certified/
Cytomètre en flux, AriaII	Beckton Dickinson (BD)		tri cellulaire
IMDM	Gibco	12440053	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12440053
Isoflurane, USP	Dechra	NDC 17033-094-25	https://www.dechra-us.com/our-products/us/companion-animal/dog/prescription/isoflurane-usp-inhalation-anesthetic
NOD. souris Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)  ;	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, États-Unis	br/> Souche # :005557	Mâle ou femelle de six à dix semaines  ;
Pommade ophtalmique, USP	Bausch Lomb	NDC 24208-780-55	https://www.bausch.com/contentassets/2914df881e4344a 7a202cc5a0673c977/neomycin-and-polymyxin-b-sulfates-gramicidin-ophthalmic-solution.pdf
OstiFen Injection (Caprofen)	VetOne	NDC 13985-748-20	http://vetone.net/Default/CatHeaderPage?id=9534ccca-eac5-4d68-8ad8-46436067587b
PBS, pH 7,4	Fait maison
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140122	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122
Povidone-iode	Bétadine	NDC 67618-155-16	https://www.betadine.com/veterinary-surgical-scrub-and-solution/
TokeOni (aux États-Unis)	Sigma-Aldrich	808350-5MG	AkaLumine-HCl/Akaluc ; https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/aldrich/808350
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020Engraftment panel d’anticorps (in vivo, moelle osseuse de souris)
Antigène			Dilution
Antigène : Anti-humain CD45 Fluorophore : V450 Clone : HI30	BD Biosciences	560367	1:25
Antigène : Anti-souris CD45.1 Fluorophore : PE-Cy7 Clone : A20	eBioscience	25-0453-81	1:50
Antigène :Anti-souris TER-119 Fluorophore : PE-Cy5 Clone : TER-119	eBioscience	15-5921-83	1:100
:Antigène CD3 Fluorophore : APC-Cy7 Clone : SK7	BD Biosciences	341090	1:12.5
Antigène :CD19 Fluorophore : APC Clone : HIB19	BD Biosciences	555415	1:25
Antigen :Anti-human CD33 Fluorophore : PE Clone : WM53	BD Biosciences	555450	1:25
Live/Dead staining			Conc.
PI	Invitrogen		1 &mu ; g/mL
Billes de compensation
Negative control	BD Biosciences		Voir les instructions pour plus de détails
Anti-souris Ig, &kappa ;	BD Biosciences		Voir l’instruction pour plus de détails