Article de méthode

Expression et purification à haut débit de vecteurs de solutés humains pour des études structurales et biochimiques

DOI :

10.3791/65878

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29 septembre 2023

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1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les études structurales et biochimiques des transporteurs membranaires humains nécessitent des quantités de quelques milligrammes de protéines stables, intactes et homogènes. Nous décrivons ici des méthodes évolutives pour cribler, exprimer et purifier les transporteurs de solutés humains à l’aide de gènes optimisés pour les codons.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les transporteurs de solutés (SLC) sont des transporteurs membranaires qui importent et exportent une gamme de substrats endogènes et exogènes, notamment des ions, des nutriments, des métabolites, des neurotransmetteurs et des produits pharmaceutiques. Bien qu’il soit apparu comme des cibles thérapeutiques et des marqueurs de maladie attrayants, ce groupe de protéines est encore relativement sous-médicamenté par les produits pharmaceutiques actuels. Les projets de découverte de médicaments pour ces transporteurs sont entravés par des connaissances structurelles, fonctionnelles et physiologiques limitées, en raison des difficultés d’expression et de purification de cette classe de protéines membranaires. Ici, nous démontrons des méthodes permettant d’obtenir des quantités de l’ordre du milligramme de protéines transporteuses SLC humaines de haute pureté à l’aide de séquences de gènes optimisées pour les codons. En conjonction avec une exploration systématique de la conception de la construction et de l’expression à haut débit, ces protocoles assurent la préservation de l’intégrité structurelle et de l’activité biochimique des protéines cibles. Nous mettons également en évidence les étapes critiques de l’expression des cellules eucaryotes, de la purification par affinité et de la chromatographie d’exclusion de taille de ces protéines. En fin de compte, ce flux de travail produit des préparations protéiques pures, fonctionnellement actives et stables, adaptées à la détermination de la structure à haute résolution, aux études de transport, aux tests d’engagement de petites molécules et au criblage in vitro à haut débit.

Introduction

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Les protéines membranaires sont depuis longtemps des cibles pour les chercheurs et les industries pharmaceutiques. Parmi ceux-ci, les porteurs de solutés (SLC) sont une famille de plus de 400 gènes transporteurs secondaires codés dans le génome humain1. Ces transporteurs sont impliqués dans l’importation et l’exportation de nombreuses molécules, notamment les ions2, les neurotransmetteurs3, les lipides 4,5,6,7, les acides aminés8, les nutriments 9,10,11 et les produits pharmaceutiques 12. Avec une telle diversité de substrats, ces protéines sont également impliquées dans une gamme de physiopathologies par le transport de toxines 13, le transport et l’inhibition par des drogues d’abus14,15 ou des mutations délétères16. Les homologues bactériens ont servi de prototypes pour le mécanisme de transport fondamental de plusieurs familles de SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Contrairement aux protéines humaines, les orthologues procaryotes sont souvent mieux exprimés dans le système d’expression bien compris d’Escherichia coli 26,27 et sont plus stables dans les détergents plus petits qui produisent des cristaux bien ordonnés pour la cristallographie aux rayons X28. Cependant, les différences de séquence et de fonction compliquent l’utilisation de ces protéines éloignées pour la découverte de médicaments29,30. Par conséquent, l’étude directe de la protéine humaine est souvent nécessaire pour déchiffrer le mécanisme d’action des médicaments ciblant les SLCs 31,32,33,34,35. Bien que les progrès récents de la cryo-microscopie électronique (Cryo-EM) aient permis la caractérisation structurale des SLC dans des conditions plus proches de celles des natifs36,37, la difficulté d’exprimer et de purifier ces protéines reste un défi pour le développement de thérapies et de diagnostics ciblés.

Pour relever ce défi, le consortium RESOLUTE (re-solute.eu) a mis au point des ressources et des protocoles pour l’expression et la purification à grande échelle de protéines humaines de la famille des SLC38. En commençant par les gènes optimisés pour les codons, nous avons développé des méthodes pour le clonage et le criblage à haut débit des constructions SLC. Ces méthodes ont été systématiquement appliquées à l’ensemble de la famille des SLCs, les gènes ont été clonés dans le système d’expression virale BacMam et l’expression de la protéine a été testée dans des lignées cellulaires humaines39 sur la base des méthodes précédemment décrites pour le clonage à haut débit et les tests d’expression40. En résumé, le gène SLC est cloné à partir du plasmide pDONR221 en un vecteur pHTBV1.1. Cette construction est ensuite utilisée pour transposer le gène d’intérêt en un vecteur bacmide pour la transfection de cellules d’insectes, qui comprend un promoteur de cytomégalovirus et des éléments activateurs pour l’expression dans les cellules de mammifères. Le baculovirus qui en résulte peut être utilisé pour transduire des cellules de mammifères en vue de l’expression de la protéine SLC cible.

Nous avons ensuite développé des méthodes standardisées pour l’expression à grande échelle et la purification stable de SLC sélectionnées (Figure 1). Ce protocole comprend plusieurs points de contrôle pour faciliter un dépannage efficace et minimiser la variabilité entre les expériences. Notamment, la surveillance de routine de l’expression et de la localisation des protéines, ainsi que l’optimisation à petite échelle des conditions de purification pour les cibles individuelles, ont été facilitées par les marqueurs de streptocoque et de protéine fluorescente verte (GFP)41,42.

En fin de compte, ces échantillons de protéines chimiquement purs et structurellement homogènes peuvent être utilisés pour la détermination structurale par cristallographie aux rayons X ou cryo-microscopie électronique (Cryo-EM), les tests biochimiques d’engagement de cible, l’immunisation pour la génération de liant et les études fonctionnelles acellulaires via reconstitution en liposomes chimiquement définis.

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Protocole

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REMARQUE : Tous les gènes RESOLUTE SLC optimisés pour les codons ont été déposés dans AddGene43, dont les liens sont disponibles dans la liste des réactifs publics RESOLUTE44. Ces gènes ont été clonés dans le plasmide pDONR221 et permettent le clonage direct des gènes dans le vecteur de destination par clonage par recombinaison45. Pour maximiser le parallélisme, des cellules bactériennes, d’insectes et de mammifères sont cultivées sous forme de blocs pour la production de bacmides (section 3), l’amplification du baculovirus (section 5) et les tests d’expression (section 6), respectivement. Pour ces étapes, un agitateur de micro-expression est nécessaire pour assurer un mélange et une aération suffisants.

1. Clonage (à haut débit) de SLC en pHTBV1.1 bacmid

REMARQUE : L’étape de clonage utilise un protocole de clonage par recombinaison pour un clonage efficace et une transformation en Escherichia coli (E. coli) à l’aide de la méthode de choc thermique46. Le protocole est conçu pour le clonage parallèle et à haut débit de plusieurs cibles ou constructions, mais peut être facilement adapté à des échelles plus petites.

  1. Dans une plaque à 96 puits, ajoutez 150 ng du clone pDONR221 SLC et 100 ng du vecteur pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. Porter le volume de réaction à 8 μL avec 10 mM Tris pH 8,0, puis ajouter 2 μL du mélange d’enzymes de recombinaison.
  2. Incuber à température ambiante pendant 1 h, ajouter 1 μL de protéinase K et incuber pendant 30 min à 37 °C.
  3. Utiliser 4 μL du mélange réactionnel pour transformer 50 μL de cellules E. coli MACH-1 chimiquement compétentes en utilisant la méthode de choc thermique46 et le milieu SOC pour la récupération. Déposer sur une gélose LB contenant 5 % de saccharose, ou gélose SOC, complétée par 100 μg/mL d’ampicilline.
  4. Identifier les colonies hébergeant le vecteur pHTBV1.1 à l’aide de l’insert du gène SLC à l’aide d’amorces appropriées (voir le tableau 1) et de protocoles standard pour la PCR47 des colonies.
  5. Purifiez le plasmide recombinant à partir de colonies individuelles avec le gène d’intérêt à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmide.

2. Transposition

REMARQUE : Les étapes suivantes sont utilisées pour transposer les gènes SLC du vecteur pHTBV1.1 dans un bacmide pour la génération de baculovirus BacMam dans les cellules Sf9. En utilisant la méthode de choc thermique46, le vecteur pHTBV1.1 est transformé en cellules E. coli compétentes en DH10Bac, qui contiennent un bacmide parent avec une fusion lacZ-mini-attTn7. La transposition se produit entre les éléments du vecteur pHTBV1.1 et le bacmide parent en présence des protéines de transposition fournies par un plasmide auxiliaire48. Voir le tableau 2 pour la composition des solutions utilisées dans ce protocole.

  1. À l’aide de 3 μL d’ADN vectoriel pHTBV1.1 purifié à 100-200 ng/μL, transformer le DH10Bac en utilisant la méthode du choc thermique dans une plaque PCR à 96 puits. Récupérer les cellules en les incubant dans un milieu de récupération pendant 4-5 h à 37 °C en agitant à 700 tr/min dans un agitateur de micro-expression.
  2. Étalez 50 μL de cellules transformées sur des plaques de sélection DH10Bac. Incuber les plaques à 37 °C pendant 48 h recouvertes d’une feuille d’aluminium.
  3. Choisissez une seule colonie blanche (contenant l’ADN recombinant) et striez-la jusqu’à dilution. Incuber à 37 °C pendant la nuit.

3. Production de bacmid à haut débit

REMARQUE : Le protocole décrit les étapes d’extraction des bacmides à l’aide d’un kit de purification des bacmides à 96 puits.

  1. Inoculer des colonies blanches individuelles (isolées des plaques striées à dilution) dans les puits d’un bloc de 96 puits de profondeur, contenant 1 mL de milieu 2x LB (tableau 2).
  2. Couvrir d’un joint poreux et incuber à 37 °C pendant une nuit à 700 tr/min dans un agitateur à micro-expression.
  3. Préparer un stock de glycérol des cellules en mélangeant 120 μL de la culture avec 30 μL de glycérol à 60 % dans une plaque de microtitration et conserver à -80 °C.
  4. Centrifuger le bloc de puits profond à 2 600 × g pendant 30 min. Décanter le surnageant dans un récipient approprié pour la décontamination. Retournez le bloc et tapotez doucement sur une serviette en papier. Ajouter 250 μL de solution 1 dans chaque puits du bloc à l’aide d’une pipette multicanaux.
  5. Remettre les granulés en suspension ; Si nécessaire, utilisez une pipette multicanaux.
  6. Ajouter 250 μL de solution 2 dans chaque puits et sceller avec un tapis en silicone. Retourner doucement 5x et incuber à température ambiante pendant 10 min. Tournez très brièvement.
  7. Ajouter 300 μL de solution 3 et sceller avec un tapis en silicone. Mélangez doucement mais soigneusement en inversant 5x.
  8. Placez l’échantillon sur de la glace pendant 20 minutes, puis centrifugez à 2 600 × g pendant 30 minutes à 4 °C.
  9. Transférez le surnageant clair dans un bloc frais de 96 puits. Centrifuger à nouveau à 2 600 × g pendant 30 min à 4 °C.
  10. Dans un bloc frais de 96 puits de profondeur, distribuer 0,8 mL d’isopropanol à 100 % par puits. Ajouter 0,8 mL de surnageants provenant des puits correspondants.
  11. Pipeter doucement de haut en bas à l’aide d’une pipette, puis incuber sur de la glace pendant 30 minutes ou toute la nuit à 4 °C pour obtenir plus de bacmide.
  12. Centrifuger à 2 600 × g pendant 30 min à 4 °C.
  13. À l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique, vaporisez l’extérieur du bloc avec 70 % d’éthanol, ouvrez le bloc et jetez le surnageant.
  14. Ajoutez 500 μL d’éthanol à 70 % (v/v) dans chaque puits et tapotez doucement le bloc pour laver la pastille. Couvrir d’un joint plastique adhésif et centrifuger à 2 600 × g pendant 30 min à 4 °C.
  15. À l’intérieur d’une enceinte de sécurité biologique, ouvrez le bloc et jetez le surnageant. Tapotez très doucement le bloc sur une serviette en papier pour retirer l’éthanol. Laissez sécher le bloc à l’intérieur de la hotte pendant 1 à 2 h ou dans un four à 50 °C.
  16. Ajouter 50 μL de tampon TE stérile pour remettre en suspension l’ADN bacmide et sceller à l’aide d’un joint adhésif en plastique. Transférez le contenu sur une plaque de microtitration à fond en V. Conservez l’ADN bacmide à 4 °C jusqu’à ce que la purification du test soit terminée, puis stockez-le à -20 °C.
    REMARQUE : Bien qu’il ne soit pas mesuré en routine, on peut généralement s’attendre à un rendement de 500 à 2 000 ng/μL d’ADN bacmide.
  17. Utiliser les méthodes standard de PCR des colonies47 et les amorces vectorielles suivantes pour dépister les bacmides incorporant avec succès le gène cible :
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    REMARQUE : L’amplicon sera environ 700 pb plus grand que le gène cible.

4. Transfection

REMARQUE : Ces étapes sont utilisées pour transfecter les cellules d’insecte Sf9 avec le bacmide produit, ce qui amène les cellules d’insectes à générer des particules de baculovirus (P0).

  1. Cultiver des cellules Sf9 dans un milieu d’insectes sans sérum jusqu’à une densité de 2,0-2,4 × 106 cellules/mL. Diluer les cellules à 2 × 105 cellules/mL dans un milieu insectifuge sans sérum et distribuer 1 mL des cellules diluées dans un puits de plaque de culture tissulaire à 24 puits. Incluez un réactif de transfection uniquement ainsi qu’un contrôle de cellules uniquement . Incuber la plaque dans un incubateur humidifié à 27 °C pendant 1 h pour permettre la fixation des cellules.
  2. Mélanger 38 μL par puits de milieu insecte sans sérum avec 2 μL par puits de réactif de transfection. Verser 40 μL du mélange dans une plaque de microtitration stérile à fond plat à 96 puits. Ajouter 2 μL d’ADN bacmide recombinant à une dose de 0,5 à 2,0 μg/μL, couvrir la plaque et incuber à l’intérieur de l’enceinte de sécurité microbiologique pendant 15 min.
  3. Ajouter 160 μL de milieu insecte sans sérum dans chaque puits de la plaque de microtitration contenant le mélange de réactifs de transfection d’ADN.
  4. Aspirer le milieu des cellules à l’étape 4.1. Délicatement, ajouter les 200 μL de mélange réactif-milieu de transfection bacmide sur les cellules, couvrir la plaque et incuber pendant 4 h dans un incubateur humidifié à 27 °C.
  5. Ajouter 400 μL de milieu anti-insectes sans sérum complété par 2 % de FBS dans chaque puits. Pour réduire l’évaporation, transférez la plaque dans un sac en plastique propre, mais ne le scellez pas. Incuber la plaque à 27 °C pendant 72 h dans un incubateur humidifié.
  6. Après 3 jours, transférez le milieu de la plaque dans un bloc stérile de 96 puits de profondeur et centrifugez à 1 500 × g pendant 20 minutes à température ambiante. Transférer le surnageant clarifié contenant le baculovirus P0 dans un bloc stérile de 96 puits profonds et le conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.

5. Amplification du baculovirus BacMam

NOTA : Les étapes suivantes sont utilisées pour amplifier le baculovirus P0 initial en stocks viraux à titre plus élevé ; à savoir P1, P2 et P3. Le titre final de P3 est approprié pour la transduction et l’expression des protéines. Pour des raisons d’efficacité et de parallélisme, ce protocole utilise des rapports volumétriques fixes pour l’amplification virale, qui ont été optimisés empiriquement. Cependant, si les cellules transduites par la suite ne présentent pas de fluorescence GFP et d’augmentation du diamètre cellulaire par microscopie ou si l’expression de la protéine échoue (voir rubriques 6 et 8), l’amplification du baculovirus doit être ré-optimisée pour une faible multiplicité d’infection à chaque étape après quantification du titre de baculovirus 49,50,51,52, et l’infection surveillée par microscopie à fluorescence GFP et augmentation du diamètre cellulaire 53.

  1. Préparer le stock de virus P1 en cultivant des cellules Sf9 dans un milieu d’insectes sans sérum jusqu’à une densité de 2 × 106 cellules/mL, ajouter 2 % de FBS et ensemencer les cellules dans un bloc de 24 puits profonds dans un volume final de 3 mL par puits. Ajouter 120 μL de souche de virus P0 aux cellules.
  2. Incuber le bloc à 27 °C en agitant à 450 tr/min dans un agitateur à micro-expression pendant 66-72 h. Centrifuger le bloc à 1 500 × g pendant 20 min à température ambiante et récolter le surnageant en blocs de 96 puits profonds. Conserver sous forme de stock de virus P1 à 4 °C à l’abri de la lumière.
  3. Préparer le stock de virus P2 en infectant 50 mL de cellules Sf9 (densité cellulaire de 2 × 106 cellules/mL), cultivées dans un milieu d’insectes sans sérum supplémenté à 2 % de FBS, avec 250 μL de stock de virus P1. Incuber les cellules à 27 °C en agitant à 110 tr/min.
  4. Récolter le bouillon de virus P2 après 66-72 h par centrifugation à 1 500 × g pendant 20 min et conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.
  5. Préparer le stock de virus P3 en infectant le volume souhaité de cellules Sf9 (densité cellulaire de 2 × 106 cellules/mL) avec un stock viral P2 de 1 :200 (v/v). Incuber les cellules à 27 °C en agitant à 110 tr/min.
  6. Après 66-72 h, centrifuger à 1 500 × g pendant 20 min et récolter le virus P3 en recueillant le surnageant et stocker à 4 °C, à l’abri de la lumière.

6. Transduction pour les tests d’expression

REMARQUE : La section suivante décrit les tests d’expression à petite échelle et peut être modifiée pour les tests parallèles de plusieurs constructions à l’aide de blocs de puits profonds.

  1. Préparer une solution de polyéthylène glycol à 20 % (p/v) en dissolvant 200 g de PEG 10 000 et 12 g de NaCl dans 600 mL de H2O doublement distillé. Remuer et porter à un volume final de 1 000 mL. Autoclaver la solution.
  2. Ajouter 300 μL de virus P1 récolté dans les puits d’un bloc de 24 puits profonds et 75 μL de solution de PEG dans chaque puits. Incuber le bloc dans un agitateur de micro-expression à 18 °C en agitant à 300 tr/min pendant 5 min et conserver le bloc à 4 °C pendant la nuit.
  3. Agiter à nouveau le bloc à 300 tr/min pendant 30 min à 18 °C et centrifuger le bloc à 3 000 × g pendant 45 min. Jeter le surnageant à l’aide d’une pipette dans une enceinte de sécurité microbiologique.
  4. Préparer des cellules HEK293 adaptées à la suspension dans un milieu HEK293 à une densité de 2 × 106 cellules/mL, et semer 3 mL dans chaque puits contenant la pastille virale, en complétant avec 5 mM de butyrate de sodium.
  5. Incuber le bloc à 30 °C avec 8 % de CO2 en agitant à 200-250 tr/min pendant 72 h.
    REMARQUE : Les concentrations de CO2 recommandées par le fournisseur pendant la culture cellulaire sont différentes pour les lignées cellulaires HEK293 adaptées à la suspension et les lignées cellulaires ancestrales, à 8 % et 5 %, respectivement.
  6. Récoltez les cellules par centrifugation à 900 × g pendant 20 min et lavez chaque puits avec 1 mL de PBS.
    REMARQUE : Aspirer 10 μL de cellules remises en suspension et les observer au microscope à fluorescence avec un cube filtrant compatible GFP pour évaluer l’expression et la localisation des protéines. Aspirer 10 à 15 μL de cellules remises en suspension et appliquer un gel SDS-PAGE à cellules entières pour la détection de la fluorescence GFP dans le gel54.
  7. Centrifuger à nouveau à 900 × g pendant 20 min. Congelez les granulés à -80 °C.

7. Purification d’essai à petite échelle à haut débit

REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent un flux de travail de purification de test rapide dans un format de bloc de 24 puits pour le criblage des niveaux d’expression des SLC individuels. Voir le tableau 2 pour la composition des solutions utilisées dans ce protocole.

  1. Ajouter 1 mL de tampon de lyse HT à chaque puits de cellules récoltées et procéder à la sonification sur glace pendant une durée totale de 4 min (cycle à 3 s marche/15 s d’arrêt) dans des blocs de 24 puits à l’aide d’une sonde à 24 têtes.
  2. Transférez le contenu dans un bloc de puits de 96 profondeurs, ajoutez 125 μL de détergent et scellez avec un joint en silicone. Faites tourner doucement le bloc à 4 °C pendant 1 h. Vous pouvez également ajouter le dodécylmaltoside (DDM) et l’hémisuccinate de cholestérol (CHS) directement dans les blocs à 24 puits et les placer sur un agitateur à bascule à 4 °C.
  3. Centrifuger le bloc à 2600 × g pendant 20 min à 4 °C et transférer le surnageant dans un nouveau bloc de 96 puits de profondeur.
  4. Préparer un stock de 50 % de résine Strep-Tactin de grande capacité prééquilibrée avec un tampon de lyse.
  5. Ajouter 100 μL de résine remise en suspension dans chaque puits.
  6. Recouvrez le bloc d’un joint en silicone et tournez-le à 4 °C pendant 2 h, puis centrifugez très brièvement (jusqu’à 200 × g) pour éliminer le liquide qui colle au couvercle.
  7. Placez une plaque filtrante à 96 puits sur un bloc vide et transférez le mélange résine/surnageant dans la plaque filtrante. Rincez les puits du bloc de puits profonds avec 800 μL de tampon de lavage HT et transférez-les dans le bloc filtrant pour recueillir le maximum de résine.
  8. Laisser le tampon s’égoutter ou centrifuger brièvement à 200 × g et recueillir l’écoulement. Placez la plaque filtrante sur un nouveau bloc de lavage et lavez la résine avec 800 μL de tampon de lavage HT, en laissant le tampon s’égoutter (ou centrifuger brièvement). Répétez l’étape de lavage deux fois de plus et centrifugez le bloc à 500 × g pendant 3 min pour éliminer le tampon de lavage HT résiduel.
  9. Placez la plaque filtrante sur une plaque de microtitration à 96 puits. Ajouter 50 μL de tampon d’élution HT et incuber en agitant à température ambiante pendant 10 min. Éluer les échantillons par centrifugation à 500 × g pendant 3 min.
  10. Appliquer 15 μL de l’échantillon élué sur un gel SDS-PAGE coloré à Coomassie pour vérifier l’expression de la protéine. Charger les échantillons restants d’éluant dans un système de chromatographie d’exclusion de taille (SEC) ou de chromatographie d’exclusion de taille (FSEC) à détection de fluorescence pour évaluer la monodispersité des protéines dans le DDM/CHS.

8. Transduction pour l’expression à grande échelle

REMARQUE : Les étapes suivantes constituent le protocole RESOLUTE standard pour l’expression SLC. Les cibles individuelles nécessiteront une optimisation supplémentaire du temps d’expression, de la température d’incubation et de la concentration de butyrate de sodium. De plus, nous optimisons régulièrement la multiplicité de l’infection par le baculovirus en testant divers rapports volumétriques du virus P3 utilisé pour infecter les cellules HEK293 adaptées à la suspension dans des expériences à petite échelle. Cela permet de gagner du temps, d’utiliser des techniques et des équipements déjà disponibles et d’évaluer directement le résultat expérimental souhaité. Cependant, cette méthode empirique nécessite une ré-optimisation à chaque amplification du virus P3, et d’autres méthodes sont disponibles pour quantifier les particules de baculovirus 49,50,51,52.

  1. Augmenter le volume requis de cellules HEK293 adaptées à la suspension dans un milieu HEK293.
  2. Diluer les cellules HEK293 adaptées à la suspension à 1 × 106 cellules/mL et laisser croître pendant 24 h (à 170 tr/min pour les flacons à rouleaux de 2 L et à 105 tr/min pour les flacons à rouleaux de 3 L).
  3. Ajouter 30 mL de virus P3 par litre de cellules et ajouter 5 mM de butyrate de sodium. Incuber les cellules à 37 °C pendant 48 h ou à 30 °C pendant 72 h.
  4. Pendant et après la période d’incubation, une étape clé consiste à examiner les cellules à l’aide de la microscopie à fond clair pour vérifier la contamination microbienne et la viabilité cellulaire. Évaluez l’expression et la localisation des protéines à l’aide de la microscopie à fluorescence avec un cube filtrant compatible GFP.
  5. Récoltez les cellules par centrifugation à 900 × g pendant 20 min.
  6. Lavez la pastille cellulaire en la remettant en suspension dans 10-15 mL de PBS par litre de culture cellulaire et en la granule à nouveau à 900 × g pendant 20 min.
  7. Congelez les granulés cellulaires dans de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C.

9. Purification des protéines

REMARQUE : Ce qui suit est la méthode RESOLUTE standard pour la purification de la SLC pour 5 L de culture cellulaire. Pour chaque cible SLC, le détergent optimal doit être déterminé empiriquement. Préparez à l’avance le tampon de base, la solution mère de détergent, le lavage, l’élution et les tampons SEC (tableau 2). Pour obtenir la liste des détergents standard testés, voir le tableau 3. L’ATP et le MgCl2 dans le tampon de lavage réduisent la contamination par les protéines de choc thermique.

  1. Jour 1
    1. Décongelez la pastille cellulaire congelée dans un bain-marie réglé à température ambiante.
    2. Préparer le tampon de solubilisation avec 135 mL de tampon de base et trois comprimés de cocktail d’inhibiteurs de protéase. Laissez les comprimés se dissoudre.
    3. Remettre en suspension la pastille décongelée avec un tampon de solubilisation. Utilisez 27 mL de tampon de solubilisation pour 10 à 15 g de pastille cellulaire, ajoutez DNase et versez dans un homogénéisateur Dounce glacé. Homogénéisez la solution en déplaçant le piston de haut en bas d’environ 20x, en gardant l’homogénéisateur sur la glace.
      REMARQUE : Le volume de remise en suspension devra être optimisé en fonction de la protéine cible et de la masse des granules cellulaires, qui variera en fonction de la densité cellulaire au moment de la récolte. La DNase commerciale peut être ajoutée selon les instructions du fabricant. La DNase peut également être exprimée et purifiée en interne à l’aide de protocoles établis55.
    4. Ajouter la solution mère de détergent à la concentration finale de 1 %.
      REMARQUE : Une étape clé de l’optimisation de la purification des protéines consiste à identifier le détergent optimal pour la solubilisation et la purification de la SLC, qui doit être identifié empiriquement. Nous avons régulièrement utilisé divers détergents ; chacun seul et en combinaison avec de l’hémisuccinate de cholestéryle, en maintenant le rapport détergent/masse CHS à 10 :1.
    5. Transférer le mélange de solubilisation dans des tubes coniques de 50 ml. Tourner lentement pendant 1 h à 4 °C.
    6. Centrifuger la solution à 50 000 × g pendant 30 min à 4 °C. Récupérez le surnageant.
    7. Équilibrer le volume du lit de 4 à 6 ml de résine streptococcique avec le tampon de base.
    8. Ajouter la résine équilibrée au surnageant solubilisé et faire tourner pendant 2 h à 4 °C.
    9. Versez la solution dans une colonne d’écoulement par gravité et laissez la solution s’écouler.
    10. Lavez la résine avec 30 fois le volume du tampon de lavage Strep en 3 étapes de volume égal.
    11. Ajouter 3 à 5 mL de tampon d’élution, incuber pendant 15 min et recueillir l’éluat. Répétez cette étape quatre fois de plus, en collectant chaque fraction d’élution séparément.
      REMARQUE : Une étape clé est l’élution des protéines de la résine Strep-Tactine, où il est important d’incuber pendant 15 minutes après chaque ajout de tampon d’élution. En règle générale, la première fraction d’éluat contient une concentration plus faible de protéines en raison de la dilution du tampon d’élution par le tampon de lavage résiduel. Par conséquent, la première fraction éluée peut être éliminée si l’on souhaite obtenir une concentration finale en protéines plus élevée. Alternativement, la concentration en protéines dans toutes les élutions en série peut également être analysée à l’aide de SDS-PAGE pour optimiser le protocole.
    12. Mesurez la concentration en protéines par spectroscopie d’absorbance UV, combinez les fractions d’élution souhaitées et ajoutez de la protéase 3C dans un rapport de 1 :5 (p/p) à 1 :10 (p/p).
    13. Tourner lentement pendant la nuit à 4 °C.
      REMARQUE : Les étapes 9.1.12 et 9.1.13 ne sont nécessaires que si la balise GFP doit être supprimée. Si la suppression de la balise n’est pas nécessaire, passez directement à l’étape 9.2.4. Alternativement, la protéine peut être conservée à 4 °C pendant la nuit pour continuer le lendemain. De plus, pour les SLC dont la stabilité est diminuée, la concentration en protéase, la période d’incubation et la température peuvent nécessiter une optimisation. La protéase 3C est active sur une large gamme de températures et permet une optimisation mieux adaptée à divers SLC.
  2. Jour 2
    1. Équilibrer 2 à 4 mL de volume de lit de résine d’affinité métallique au cobalt avec un tampon SEC.
    2. Ajouter la résine d’affinité du cobalt équilibré au mélange de réaction 3C pendant la nuit et faire tourner pendant 1 h à 4 °C.
    3. Versez la solution dans une colonne d’écoulement par gravité et collectez l’écoulement.
    4. Concentrer l’écoulement dans un filtre centrifuge de coupure de 100 kDa en faisant tourner à 3 000 × g à 4 °C et mélanger doucement l’échantillon toutes les 5 minutes jusqu’à ce que le volume d’injection SEC souhaité soit atteint.
    5. Équilibrer une colonne de chromatographie d’exclusion de taille à base de dextran-agarose à l’aide d’un tampon SEC. La procédure SEC doit être effectuée à 4 °C (chambre réfrigérée ou chambre froide).
      REMARQUE : Étape clé : En fonction de l’état oligomérique de la SLC, une colonne différente, telle qu’une colonne de chromatographie d’exclusion de taille à base d’agarose, peut être utilisée pour effectuer la SEC.
    6. Injectez l’échantillon dans la boucle d’échantillonnage et exécutez le programme SEC, avec un débit tel que la pression de la colonne est inférieure aux spécifications du fabricant de la colonne. À l’aide d’un collecteur de fractions, collectez automatiquement des fractions de 0,3 mL sur l’ensemble du cycle SEC.
    7. Regroupez les fractions de pointe, mesurez l’absorbance UV et concentrez-les dans un concentrateur centrifuge de coupure de 100 kDa jusqu’au volume/concentration requis en essorant à 3 000 × g à 4 °C.

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Résultats

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Les gènes SLC peuvent être clonés à partir de plasmides pDONR RESOLUTE dans des vecteurs BacMam pour l’expression chez les mammifères
Les protocoles décrits pour le clonage, l’expression et la purification se sont avérés efficaces pour de nombreux transporteurs de SLC à travers plusieurs repliements protéiques. Néanmoins, les procédures comprennent plusieurs points de contrôle pour surveiller les progrès, ce qui permet d’optimiser les différences d’expression, de repliement des protéines, de stabilité...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement de thérapies ciblant les SLC est resté entravé en raison de l’absence de caractérisation systématique de la fonction des transporteurs. Cela a conduit à une diminution disproportionnée des médicaments ciblant cette classe de protéines par rapport aux RCPG et aux canaux ioniques63, malgré leurs nombreux rôles dans les processus normaux et physiopathologiques. RESOLUTE est un consortium international qui vise à mettre au point des techniques et des outils de recherche de pointe afin...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été réalisés dans le cadre du projet RESOLUTE. RESOLUTE a reçu un financement de l’entreprise conjointe de l’Initiative sur les médicaments novateurs 2 dans le cadre de l’accord de subvention no 777372. Cette entreprise commune bénéficie du soutien du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne et de l’EFPIA. Cet article ne reflète que les opinions des auteurs et ni l’IMI, ni l’Union européenne et l’EFPIA ne sont responsables de l’utilisation qui pourrait être faite des informations qu’il contient. Le plasmide pHTBV a été aimablement fourni par le professeur Frederick Boyce (Harvard).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Protéase 3CProduit en interne
Concentrateurs centrifuges de coupure de 50 ou 100 kDaSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-&beta ;-D-MaltosideAnatraceC325CYMAL-5
96 puits bacmid Kit de purificationMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
Bloc 96 puits (2 mL)Greiner Bio-One780271
Joints adhésifs en plastiqueQiagen19570Tampons
Colonne de chromatographie d’exclusion stérique d’agaroseCytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAseProduit en interne
BisTrisSigma AldrichB9754
Hémisuccinate de cholestéryle Sel de TrisAnatraceCH210CHS
Résine d’affinité métallique au cobaltTakara Bio635653TALON Résine d’affinité métallique
D(+)-BiotineSigma Aldrich851209
Colonne de chromatographie d’exclusion stérique Dextran-agaroseCytiva28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce tissue broyeur (40 mL)DWK Life Sciences357546
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTASigma Aldrich4693132001cOmplete, sans EDTA Cocktail
Sérum de bovin fœtalThermo Fisher10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlycérolSigma AldrichG5516
Glyco-diosgénineAnatraceGDN101GDN
Colonnes d’écoulement par gravitéCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 moyenThermo Fisher12338018FreeStyle 293 moyen
HEPESApollo ScientificBI8181
Colonne UHPLC en silice hydrophile et neutreSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4,6 x 150
ImidazoleSigma Aldrich56750
Réactif de transfectiond’insectes Sigma Aldrich71259Réactif
Lauryl Maltose Neopentyl GlycolAnatraceNG310LMNG
Chlorure de magnésium HexahydratéSigma AldrichM2670
Agitateur de micro-expressionGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-&beta ;-D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-OxideAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-&beta ;-D-GlucopyranosideAnatraceN324S
NG n-Octyl-d17-&beta ;- D-glucopyranosideAnatraceO311DOGNG
Octaéthylène glycol Monododécyl
Éther		AnatraceO330C12E8
Octyl Glucose Neopentyl GlycolAnatraceNG311OGNG
Phosphate Tamponné SalineSigma AldrichD8537DPBS
Polyoxyéthylène(10)dodécylétherAnatraceAP1210C12E10
Polyoxyéthylène(9)dodécylétherAnatraceAPO129C12E9
Joint poreux pour plaques de culture tissulaireVWR60941-084Films de rayonne pour cultures biologiques
Protéinase KNew England BiolabsP8107S Mélange d’enzymes
de recombinaisonThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Milieu anti-insectes sans sérumGibco10902088Sf-900 II Média sans sérum
Butyrate de sodiumSigma Aldrich303410
Sonde à 24 têtesSonics630-0579
Unité de puissance du sonicateurSonicsVCX 750
Résine streptococcique,IBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow, résine haute capacité
SaccharoseSigma AldrichS7903
Monododécanoate de saccharoseAnatraceS350DDS
Cellules HEK293 adaptées à la suspensionThermo FisherA14527Expi293F
Réactif de transfectionSigma Aldrich70967GeneJuice Réactif de transfection
adhésifs

Références

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