Article de méthode

Expression et purification à haut débit de vecteurs de solutés humains pour des études structurales et biochimiques

DOI :

10.3791/65878

⸱

29 septembre 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les études structurales et biochimiques des transporteurs membranaires humains nécessitent des quantités de quelques milligrammes de protéines stables, intactes et homogènes. Nous décrivons ici des méthodes évolutives pour cribler, exprimer et purifier les transporteurs de solutés humains à l’aide de gènes optimisés pour les codons.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les transporteurs de solutés (SLC) sont des transporteurs membranaires qui importent et exportent une gamme de substrats endogènes et exogènes, notamment des ions, des nutriments, des métabolites, des neurotransmetteurs et des produits pharmaceutiques. Bien qu’il soit apparu comme des cibles thérapeutiques et des marqueurs de maladie attrayants, ce groupe de protéines est encore relativement sous-médicamenté par les produits pharmaceutiques actuels. Les projets de découverte de médicaments pour ces transporteurs sont entravés par des connaissances structurelles, fonctionnelles et physiologiques limitées, en raison des difficultés d’expression et de purification de cette classe de protéines membranaires. Ici, nous démontrons des méthodes permettant d’obtenir des quantités de l’ordre du milligramme de protéines transporteuses SLC humaines de haute pureté à l’aide de séquences de gènes optimisées pour les codons. En conjonction avec une exploration systématique de la conception de la construction et de l’expression à haut débit, ces protocoles assurent la préservation de l’intégrité structurelle et de l’activité biochimique des protéines cibles. Nous mettons également en évidence les étapes critiques de l’expression des cellules eucaryotes, de la purification par affinité et de la chromatographie d’exclusion de taille de ces protéines. En fin de compte, ce flux de travail produit des préparations protéiques pures, fonctionnellement actives et stables, adaptées à la détermination de la structure à haute résolution, aux études de transport, aux tests d’engagement de petites molécules et au criblage in vitro à haut débit.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protéines membranaires sont depuis longtemps des cibles pour les chercheurs et les industries pharmaceutiques. Parmi ceux-ci, les porteurs de solutés (SLC) sont une famille de plus de 400 gènes transporteurs secondaires codés dans le génome humain1. Ces transporteurs sont impliqués dans l’importation et l’exportation de nombreuses molécules, notamment les ions2, les neurotransmetteurs3, les lipides 4,5,6,7, les acides aminés8, les nutriments 9,10,11 et les produits pharmaceu....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

REMARQUE : Tous les gènes RESOLUTE SLC optimisés pour les codons ont été déposés dans AddGene43, dont les liens sont disponibles dans la liste des réactifs publics RESOLUTE44. Ces gènes ont été clonés dans le plasmide pDONR221 et permettent le clonage direct des gènes dans le vecteur de destination par clonage par recombinaison45. Pour maximiser le parallélisme, des cellules bactériennes, d’insectes et de mammifères sont cultivées sous forme de blocs pour la production de bacmides (section 3), l’amplification du baculovirus (section 5) et les tests d’expression (section 6), respectivement. Pour ce....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les gènes SLC peuvent être clonés à partir de plasmides pDONR RESOLUTE dans des vecteurs BacMam pour l’expression chez les mammifères
Les protocoles décrits pour le clonage, l’expression et la purification se sont avérés efficaces pour de nombreux transporteurs de SLC à travers plusieurs repliements protéiques. Néanmoins, les procédures comprennent plusieurs points de contrôle pour surveiller les progrès, ce qui permet d’optimiser les différences d’expression, de repliement des protéines, de stabilité.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement de thérapies ciblant les SLC est resté entravé en raison de l’absence de caractérisation systématique de la fonction des transporteurs. Cela a conduit à une diminution disproportionnée des médicaments ciblant cette classe de protéines par rapport aux RCPG et aux canaux ioniques63, malgré leurs nombreux rôles dans les processus normaux et physiopathologiques. RESOLUTE est un consortium international qui vise à mettre au point des techniques et des outils de recherche de pointe afin.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été réalisés dans le cadre du projet RESOLUTE. RESOLUTE a reçu un financement de l’entreprise conjointe de l’Initiative sur les médicaments novateurs 2 dans le cadre de l’accord de subvention no 777372. Cette entreprise commune bénéficie du soutien du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne et de l’EFPIA. Cet article ne reflète que les opinions des auteurs et ni l’IMI, ni l’Union européenne et l’EFPIA ne sont responsables de l’utilisation qui pourrait être faite des informations qu’il contient. Le plasmide pHTBV a été aimablement fourni par le professeur Frederick Boyce (Harvard).

....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Protéase 3CProduit en interne
Concentrateurs centrifuges de coupure de 50 ou 100 kDaSartoriusVS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-&beta ;-D-MaltosideAnatraceC325CYMAL-5
96 puits bacmid Kit de purificationMilliporeLSKP09604Montage Plasmid Miniprep
Bloc 96 puits (2 mL)Greiner Bio-One780271
Joints adhésifs en plastiqueQiagen19570Tampons
Colonne de chromatographie d’exclusion stérique d’agaroseCytiva29091596Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAseProduit en interne
BisTrisSigma AldrichB9754
Hémisuccinate de cholestéryle Sel de TrisAnatraceCH210CHS
Résine d’affinité métallique au cobaltTakara Bio635653TALON Résine d’affinité métallique
D(+)-BiotineSigma Aldrich851209
Colonne de chromatographie d’exclusion stérique Dextran-agaroseCytiva28990944Superdex 200 Increase 10/300 GL
DigitoninApollo ScientificBID3301
Dounce tissue broyeur (40 mL)DWK Life Sciences357546
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTASigma Aldrich4693132001cOmplete, sans EDTA Cocktail
Sérum de bovin fœtalThermo Fisher10500064
Fos-Choline-12AnatraceF308SFS-12
GlycérolSigma AldrichG5516
Glyco-diosgénineAnatraceGDN101GDN
Colonnes d’écoulement par gravitéCole-ParmerWZ-06479-25
HEK293 moyenThermo Fisher12338018FreeStyle 293 moyen
HEPESApollo ScientificBI8181
Colonne UHPLC en silice hydrophile et neutreSepax231300-4615Unix-C SEC-300 4,6 x 150
ImidazoleSigma Aldrich56750
Réactif de transfectiond’insectes Sigma Aldrich71259Réactif
Lauryl Maltose Neopentyl GlycolAnatraceNG310LMNG
Chlorure de magnésium HexahydratéSigma AldrichM2670
Agitateur de micro-expressionGlas-Col107A DPMINC24CE
NaClSigma AldrichS9888
n-Decyl-&beta ;-D-MaltosideAnatraceD322DM
n-Dodecyl-b-D-MaltopyranosideAnatraceD310DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-OxideAnatraceD360LDAO
n-Nonyl-&beta ;-D-GlucopyranosideAnatraceN324S
NG n-Octyl-d17-&beta ;- D-glucopyranosideAnatraceO311DOGNG
Octaéthylène glycol Monododécyl
Éther		AnatraceO330C12E8
Octyl Glucose Neopentyl GlycolAnatraceNG311OGNG
Phosphate Tamponné SalineSigma AldrichD8537DPBS
Polyoxyéthylène(10)dodécylétherAnatraceAP1210C12E10
Polyoxyéthylène(9)dodécylétherAnatraceAPO129C12E9
Joint poreux pour plaques de culture tissulaireVWR60941-084Films de rayonne pour cultures biologiques
Protéinase KNew England BiolabsP8107S Mélange d’enzymes
de recombinaisonThermo Fisher11791020Gateway LR Clonase II
Milieu anti-insectes sans sérumGibco10902088Sf-900 II Média sans sérum
Butyrate de sodiumSigma Aldrich303410
Sonde à 24 têtesSonics630-0579
Unité de puissance du sonicateurSonicsVCX 750
Résine streptococcique,IBA Life Sciences2-5030-025Strep-TactinXT 4Flow, résine haute capacité
SaccharoseSigma AldrichS7903
Monododécanoate de saccharoseAnatraceS350DDS
Cellules HEK293 adaptées à la suspensionThermo FisherA14527Expi293F
Réactif de transfectionSigma Aldrich70967GeneJuice Réactif de transfection
adhésifs

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Solute CarriersMembrane TransportersProtein ExpressionProtein PurificationHigh Throughput ScreeningAffinity PurificationSize Exclusion ChromatographySDS PAGE ElectrophoresisFluorescence MicroscopyDrug Discovery

Articles connexes