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Reconstruction de la barrière hémato-encéphalique in vitro pour modéliser et cibler thérapeutiquement les maladies neurologiques

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DOI :

10.3791/65921

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20 octobre 2023

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1Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Black Family Stem Cell Institute at Mount Sinai, 3Ronald M. Loeb Center for Alzheimer’s Disease at Mount Sinai, 4Friedman Brain Institute at Mount Sinai, 5Nash Family Department of Neuroscience at Mount Sinai

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La barrière hémato-encéphalique joue un rôle crucial dans le maintien d’un environnement cérébral stable et sain. Le dysfonctionnement de la BHE est associé à de nombreuses maladies neurologiques. Nous avons développé un modèle 3D dérivé de cellules souches de la BHE pour étudier la pathologie cérébrovasculaire, l’intégrité de la BHE et la façon dont la BHE est modifiée par la génétique et la maladie.

Résumé

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un élément physiologique clé du système nerveux central (SNC), qui maintient les nutriments, élimine les déchets et protège le cerveau des agents pathogènes. Les propriétés barrières inhérentes à la BHE posent un défi pour l’administration de médicaments thérapeutiques dans le SNC pour traiter les maladies neurologiques. L’altération de la fonction BHE a été associée à une maladie neurologique. L’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), le dépôt d’amyloïde dans le système vasculaire cérébral conduisant à une BHE compromise, est une comorbidité dans la plupart des cas de maladie d’Alzheimer (MA), ce qui suggère que le dysfonctionnement ou la dégradation de la BHE peut être impliqué dans la neurodégénérescence. En raison de l’accès limité aux tissus de la BHE humaine, les mécanismes qui contribuent au bon fonctionnement de la BHE et à la dégénérescence de la BHE demeurent inconnus. Pour remédier à ces limitations, nous avons mis au point une BHE dérivée de cellules souches pluripotentes humaines (iBBB) en incorporant des cellules endothéliales, des péricytes et des astrocytes dans une matrice 3D. L’iBBB s’auto-assemble pour récapituler l’anatomie et les interactions cellulaires présentes dans la BHE. L’ensemencement des iBBB avec de l’amyloïde capture les aspects clés de l’ACA. De plus, l’iBBB offre une plate-forme flexible pour moduler les facteurs génétiques et environnementaux impliqués dans les maladies cérébrovasculaires et la neurodégénérescence, afin d’étudier comment la génétique et le mode de vie affectent le risque de maladie. Enfin, l’iBBB peut être utilisé pour le criblage de médicaments et les études de chimie médicinale afin d’optimiser l’administration thérapeutique au SNC. Dans ce protocole, nous décrivons la différenciation des trois types de cellules (cellules endothéliales, péricytes et astrocytes) issues de cellules souches pluripotentes humaines, comment assembler les cellules différenciées dans l’iBBB, et comment modéliser l’AAC in vitro à l’aide de l’amyloïde exogène. Ce modèle permet de relever le défi d’étudier les tissus cérébraux humains vivants avec un système qui a à la fois une fidélité biologique et une flexibilité expérimentale, et permet d’interroger la BHE humaine et son rôle dans la neurodégénérescence.

Introduction

La barrière hémato-encéphalique (BHE) est un réseau microvasculaire clé qui sépare le système nerveux central (SNC) de la périphérie afin de maintenir un environnement idéal pour le bon fonctionnement neuronal. Il joue un rôle essentiel dans la régulation de l’afflux et de l’efflux de substances dans le SNCen maintenant l’homéostasie métabolique 1,2,3,4, en éliminant les déchets 4,5,6 et en protégeant le cerveau des agents pathogènes et des toxines 7,8.

Le principal type de cellule de la BHE est la cellule endothéliale (CE). Les cellules endothéliales, issues de la lignée du mésoderme, forment les parois du système vasculaire 1,9. Les CE microvasculaires forment des jonctions serrées les unes avec les autres pour réduire considérablement la perméabilité de leur membrane 10,11,12,13,14 tout en exprimant des transporteurs pour faciliter le mouvement des nutriments dans et hors du SNC 1,4,12,14 . Les CE microvasculaires sont entourées de cellules péricytaires (PC) murales qui régulent la fonction microvasculaire et l’homéostasie et sont essentielles à la régulation de la perméabilité de la BHE aux molécules et aux cellules immunitaires 15,16,17. L’astrocyte, un type majeur de cellules gliales, est le dernier type de cellule composant la BHE. Les extrémités des astrocytes s’enroulent autour des tubes vasculaires EC-PC tandis que les corps cellulaires s’étendent dans le parenchyme cérébral, formant une connexion entre les neurones et le système vasculaire1. Des transporteurs distincts de solutés et de substrats sont localisés sur les extrémités des astrocytes (p. ex., l’aquaporine 4 [AQP-4]) qui jouent un rôle essentiel dans la fonction de la BHE 18,19,20,21.

La BHE est essentielle au maintien d’une bonne santé cérébrale, et un dysfonctionnement de la BHE a été signalé dans de nombreuses maladies neurologiques, notamment la maladie d’Alzheimer (MA)22,23,24,25, la sclérose en plaques 7,26,27,28, l’épilepsie 29,30 et les accidents vasculaires cérébraux31,32. Il est de plus en plus reconnu que les anomalies cérébrovasculaires jouent un rôle central dans la neurodégénérescence, contribuant à une susceptibilité accrue aux événements ischémiques et hémorragiques. Par exemple, plus de 90 % des patients atteints de la maladie d’Alzheimer souffrent d’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC), une affection caractérisée par le dépôt de β amyloïde (Aβ) le long du système vasculaire cérébral. L’ACA augmente la perméabilité à la BHE et diminue la fonction de la BHE, ce qui rend le SNC vulnérable à l’ischémie, aux événements hémorragiques et au déclin cognitif accéléré33.

Nous avons récemment développé un modèle in vitro de la BHE humaine, dérivé de cellules souches pluripotentes induites par le patient, qui intègre des CE, des PC et des astrocytes encapsulés dans une matrice 3D (Figure 1A). L’iBBB récapitule les interactions physiologiquement pertinentes, y compris la formation du tube vasculaire et la localisation des extrémités des astrocytes avec le système vasculaire24. Nous avons appliqué l’iBBB pour modéliser la susceptibilité à l’ACA médiée par l’APOE4 (Figure 1B). Cela nous a permis d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires causaux par lesquels l’APOE4 favorise l’AAC, et de tirer parti de ces connaissances pour développer des stratégies thérapeutiques qui réduisent la pathologie de l’AAC et améliorent l’apprentissage et la mémoire in vivo chez les souris APOE424. Ici, nous fournissons un protocole détaillé et un tutoriel vidéo pour reconstruire la BHE à partir de cellules iPS humaines et modéliser l’ACA in vitro.

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Protocole

1. Différenciation des cellules iPS en cellules iBBB

NOTE : Ces protocoles de différenciation ont déjà été décrits dans Mesentier-Louro et al.34.

  1. Enrobage de plaques de culture cellulaire
    1. Décongeler la matrice membranaire à facteur de croissance réduit (GF) pendant la nuit à 4 °C. Diluer 500 μL de matrice membranaire basale dans 49,5 mL de DMEM. Conservez cette solution au froid pour éviter une polymérisation prématurée de la solution de revêtement.
    2. Ajouter 1 à 2 mL par puits d’une plaque traitée pour la culture tissulaire à 6 puits. Laissez agir la solution d’enrobage pendant au moins 20 minutes à 37 °C avant de la remplacer par le milieu de culture réchauffé approprié.
  2. Différenciation des cellules iPS humaines en cellules endothéliales inductibles par l’ETV2
    Durée : 8 jours
    NOTE : Ce protocole est adapté de Blanchard et al.24 et Qian et al.35. Nous utilisons l’expression inductible par la doxycycline du facteur de transcription ETV2, telle que décrite par Wang et al.36 pour améliorer le rendement. ETV2 a été introduit via le plasmide PiggyBac et les cellules ont ensuite été transfectées.
    1. Cultivez des cellules iPS sur des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale à base de GF réduite dans un milieu de cellules souches pluripotentes sans nourrice jusqu’à ce que les cellules atteignent ~70 % de confluence.
      REMARQUE : Nous recommandons que les cellules iPS inductibles soient maintenues avec sélection pour le plasmide PiggyBac (c.-à-d. puromycine)
    2. Jour 0 : Dissociez les cellules avec un mélange protéase-collagénase pendant 5 min. Transférez les cellules dissociées dans un tube conique avec un rapport de 1 :3 du mélange protéase-collagénase au milieu de cellules souches. Essorer les cellules à 300 × g pendant 3 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu de cellules souches et plaquer les cellules à 20 800 cellules/cm2 sur des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale GF réduite dans un milieu de cellules souches complétées par 10 μM Y27632.
    3. Jour 1 : Remplacez le milieu par du DeSR1 [DMEM/F12 + supplément de glutamine, 1x Minimum Essential Medium Non-Essential Amino Acides (MEM-NEAA), 1 % de pénicilline-streptomycine (P/S)], complété par 10 ng/mL de BMP4, 6 μM CHIR99021 et 5 μg/mL de doxycycline.
    4. Jour 3 : Remplacer le milieu par du DeSR2 [DMEM/F12 + supplément de glutamine, 1x MEM-NEAA, 1x N-2, 1x B-27, 1% P/S] complété par 5 μg/mL de doxycycline.
    5. Jour 5 : Remplacer le milieu par de l’hECSR [milieu sans sérum endothélial humain, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S] complété par 50 ng/mL VEGF-A, 2 μM de forskoline et 5 μg/mL de doxycycline.
    6. Jour 7 : Remplacer le milieu par de l’hECSR complété par 50 ng/mL de VEGF-A, 2 μM de forskoline et 5 μg/mL de doxycycline.
    7. Jour 8 : Diviser les EC 1 :3 avec un mélange protéase-collagénase et réensemencer sur des plaques fraîches recouvertes d’une matrice de membrane basale à GF réduit dans de l’hECSR complétées par 50 ng/mL de VEGF-A et 5 μg/mL de doxycycline.
      REMARQUE : C’est le meilleur moment pour encapsuler les EC dans les iBBB pour une formation vasculaire uniforme.
    8. Jour 10+ : Nourrissez les cellules tous les 2 à 3 jours avec de l’hECSR complété par 50 ng/mL de VEGF-A et 5 μg/mL de doxycycline. Continuez à diviser les cellules 1 :3 avec un mélange protéase-collagénase lorsque les plaques sont confluentes.
      REMARQUE : Les CE dérivés de CSPi peuvent être gelés à tout moment à partir du jour 8. Soulevez les cellules, comme pour passer. Remettre la pastille en suspension dans un milieu de congélation EC [60 % de remplacement sérique knock-out (KSR), 30 % hECSR, 10 % de DMSO, 50 ng/mL VEGF-A et 10 μM Y27632], en divisant les cellules 1 :3, et congeler à l’aide d’un récipient de congélation à -80 °C. Décongeler sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale à GF réduit dans de l’hECSR complétées par 50 ng/mL de VEGF-A, 5 μg/mL de doxycycline.
    9. Confirmer la différenciation des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales par immunocytochimie à l’aide d’anticorps dirigés contre CD31/PECAM1 ou VE-cadhérine (Figure 2A).
  3. Différenciation des cellules iPS humaines en péricytes
    Durée : 6 jours
    NOTE : Ce protocole a été adapté de Patsch et al.36.
    1. Cultivez des cellules iPS sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale à base de GF réduite dans des conditions sans nourrice dans un milieu de cellules souches jusqu’à ce que les cellules atteignent ~70 % de confluence.
    2. Jour 0 : Dissociez les cellules avec un mélange protéase-collagénase pendant 5 min. Transférez les cellules dissociées dans un tube conique avec un rapport de 1 :3 du mélange protéase-collagénase au milieu de cellules souches. Essorer les cellules à 300 × g pendant 3 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu de cellules souches et plaquer les cellules à 37 000-40 000 cellules/cm2 (selon la lignée cellulaire) sur des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale GF réduite dans un milieu de cellules souches complétées par 10 μM Y27632.
    3. Jour 1 : Remplacer le milieu par du N2B27 [50 % DMEM/F12 + supplément de glutamine, 50 % de Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, supplément de glutamine, 1x N-2, 1x-B-27, 1% P/S] complété par 25 ng/mL de BMP4 et 8 uM CHIR99021.
    4. Jours 3-4 : Remplacer le milieu par du N2B27 complété par 2 ng/mL d’activine A et 10 ng/mL de PDGF-BB, et nourrir quotidiennement.
    5. Jour 5 : Diviser les PC avec un mélange protéase-collagénase et les semer sur des plaques enrobées de gélatine à 0,1 % à raison de 35 000 cellules/cm2 dans le N2B27 complété par 10 ng/mL DE PDGF-BB.
      REMARQUE : Ne divisez les cellules qu’une fois confluentes. Certaines lignes peuvent nécessiter quelques jours de plus avant d’être prêtes à se diviser ; Continuez à changer le milieu tous les jours jusqu’à ce que les cellules soient confluentes.
    6. Développez les PC en N2B27 complété par 10 ng/mL DE PDGF-BB, en changeant de support tous les 2-3 jours. Retirez PDGF-BB du milieu une fois que les cellules ont atteint à nouveau la confluence et subissent un deuxième passage.
      REMARQUE : Les péricytes sont prêts à être utilisés dans les iBBB après le deuxième passage. Une fois étendus, les PC peuvent être gelés. Soulevez les cellules comme pour les faire passer, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de congélation [90 % KSR et 10 % DMSO] et congelez à l’aide d’un récipient de congélation à -80 °C. Décongeler sur des plaques enrobées de gélatine à 0,1 % à 35 000 cellules/cm2 en N2B27.
    7. Confirmer la différenciation des péricytes par immunocytochimie à l’aide d’anticorps dirigés contre le PDGFRB et le NG2 (Figure 2B).
  4. Différenciation des cellules iPS humaines en cellules progénitrices neurales (NPC) et en astrocytes
    Durée : 45 jours au total (15 jours pour les PNJ suivis de 30 jours pour les astrocytes)
    NOTE : Le protocole de différenciation NPC a été adapté de Chambers et al.38, et la différenciation des astrocytes est telle que décrite dans TCW et al.39.
    1. Cultivez des cellules iPS sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale à base de GF réduite dans des conditions sans nourrice dans un milieu de cellules souches jusqu’à ce que les cellules atteignent ~70 % de confluence.
    2. Dissociez les cellules avec un mélange protéase-collagénase pendant 5 min. Transférez les cellules dissociées dans un tube conique avec un rapport de 1 :3 du mélange protéase-collagénase au milieu de cellules souches. Essorer les cellules à 300 × g pendant 3 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec un milieu de cellules souches et plaquer les cellules à 100 000 cellules/cm2 sur des plaques recouvertes d’une matrice de membrane basale GF réduite dans un milieu de cellules souches complétées par 10 μM Y27632.
    3. Remplacez le milieu de cellules souches le lendemain. Continuez à nourrir les cellules tous les deux jours jusqu’à ce qu’elles atteignent >95% de confluence (3-4 jours selon la lignée cellulaire).
    4. PNJ Jour 0 : Remplacez le milieu par du N2B27 [50 % DMEM/F12 + supplément de glutamine, 50 % de Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x, supplément de glutamine, 1x N-2, 1X-B-27, 1% P/S] complété par 10 μM SB43152 et 100 nM LDN193189.
    5. PNJ Jours 1 à 9 : Nourrissez quotidiennement les cellules avec du N2B27 complété par 10 μM SB43152 et 100 nM LDN193189.
    6. PNJ Jour 10 : Diviser les NPC 1 :3 avec le mélange protéase-collagénase et semer sur des plaques fraîches recouvertes d’une matrice de membrane basale GF réduite dans du N2B27 complété par 20 ng/mL de FGF-basique et 10 μM Y27632.
    7. PNJ Jours 11 à 13 : Nourrir les PNJ tous les jours avec du N2B27 complété par 20 ng/mL de FGF-basique.
    8. PNJ Jour 14 : Diviser les NPC 1 :3 avec le mélange protéase-collagénase et les réensemencer sur des plaques fraîches recouvertes d’une matrice de membrane basale à base réduite en N2B27 complétées par 20 ng/mL de FGF-basique et 10 μM Y27632.
    9. PNJ Jour 15/Astrocyte Jour 0 : C’est le jour 0 de la différenciation des astrocytes. Nourrissez les cellules avec un milieu astrocytaire complet (AM).
      NOTA : Les NPC peuvent être maintenus dans le N2B27 complété par 20 ng/mL de FGF-basique et évacués lorsqu’ils sont confluents. Pour congeler les PNJ, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de congélation [90 % KSR et 10 % DMSO], diviser les cellules 1 :3 et congeler à l’aide d’un récipient de congélation à -80 °C. Décongeler sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale à base de GF réduite en N2B27 complétées par 20 ng/mL de bFGF et 10 μM Y27632.
    10. Jours 1 à 30 : Nourrissez les cellules tous les 2-3 jours avec le matin. Lorsque les cellules sont confluentes à >90 %, passage à l’aide du mélange protéase-collagénase et plaque à 15 000 cellules/cm2 sur des plaques fraîches recouvertes d’une matrice de membrane basale à base réduite en AM.
      REMARQUE : Les astrocytes doivent être complètement différenciés en 30 jours. Les astrocytes peuvent être congelés dans des milieux de congélation [90 % KSR et 10 % DMSO] dans un récipient de congélation à -80 °C. Décongeler sur des plaques revêtues d’une matrice de membrane basale à base de GF réduite en AM à 25 000-35 000 cellules/cm2.
    11. Confirmer la différenciation des NPC par immunocytochimie à l’aide d’anticorps dirigés contre Nestin et SOX2. Confirmer la différenciation des astrocytes par immunocytochimie à l’aide d’anticorps dirigés contre S100B et CD44 (Figure 2C).

2. Assemblage de l’iBBB

  1. Décongeler la matrice de la membrane basale à facteur de croissance réduit (GF) pendant la nuit à 4 °C. Ne diluez pas cette matrice dans le DMEM car les iBBB sont encapsulés dans une matrice de membrane basale GF réduite à 100 %. Chaque iBBB nécessite 50 μL de matrice.
  2. Dissocier les CE différenciées avec un mélange protéase-collagénase à 37 °C pendant 5 min. Transférez les cellules dissociées dans un tube conique avec un rapport de 1 :3 du mélange protéase-collagénase à l’hECSR (Human Endothelial Serum-Free Medium, 1x MEM-NEAA, 1x B-27, 1% P/S). Essorer les cellules à 300 × g pendant 3 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans hECSR.
    REMARQUE : Utilisez un tube conique, de 15 ml ou de 50 ml, suffisamment grand pour accueillir le volume de cellules dissociées et de milieux. Les cellules peuvent également être divisées en plusieurs tubes, puis recombinées lors de la remise en suspension.
  3. Dissocier les PC différenciés avec le mélange protéase-collagénase à 37 °C pendant 5 min. Transférez les cellules dissociées dans un tube conique avec un rapport de 1 :3 du mélange protéase-collagénase à N2B27 (50 % DMEM/F12 + supplément de glutamine, 50 % de Neurobasal, 1x MEM-NEAA, 0,5x supplément de glutamine, 1x N-2, 1x B-27, 1% pénicilline-streptomycine [P/S]). Essorer les cellules à 300 × g pendant 3 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans N2B27.
  4. Dissocier les astrocytes différenciés avec le mélange protéase-collagénase à 37 °C pendant 5 min. Transférez les cellules dissociées dans un tube conique avec un rapport de 1 :3 du mélange protéase-collagénase pour compléter le milieu astrocytaire (AM). Essorer les cellules à 300 × g pendant 3 min. Remettre en suspension la pastille cellulaire en AM.
  5. À l’aide d’un hémocytomètre, comptez chaque type de cellule. Diluer chaque type de suspension cellulaire à une concentration finale de 1 × 106 cellules/mL dans le milieu approprié.
  6. Combinez le nombre calculé de cellules pour chaque type de cellule dans un tube conique : 50 μL d’iBBB nécessitent 2,5 × 105 EC, 5 × 104 PC et 5 × 104 astrocytes. Incluez 10 % de cellules de plus que le nombre calculé pour tenir compte des erreurs de pipetage. Essorez le mélange cellulaire à 300 × g pendant 3 min.
    REMARQUE : Il est fortement recommandé de plaquer des cellules restantes de chaque type de cellule dans les monocultures 2D pour les fixer et les colorer pour le contrôle de la qualité des cellules d’entrée. Plaquer chaque type de cellule à 35 000 cellules/cm2 sur des plaques préalablement préparées et recouvertes d’une matrice de membrane basale GF réduite et fixer après 3-4 jours. Voir le tableau 1 pour les anticorps spécifiques au type de cellule.
  7. Aspirer le milieu de la pastille cellulaire en laissant environ 50 μL de surnageant au-dessus de la pastille cellulaire. À l’aide d’un P200, remettre doucement la pastille cellulaire en suspension dans un milieu résiduel pour créer une boue unicellulaire.
  8. Mélanger la boue cellulaire dans une matrice membranaire basale GF réduite suffisante complétée par 10 ng/mL de VEGF-A pour obtenir le nombre souhaité de BBE à 50 μL de matrice membranaire basale GF réduite par bBB, en prenant soin de mélanger les cellules de manière homogène sans introduire de bulles d’air.
    REMARQUE : Il est essentiel de garder les cellules et la matrice de la membrane basale GF réduite sur la glace à ce stade pour éviter une polymérisation prématurée.
  9. Pipeter 50 μL de mélange de matrice membranaire basale GF réduite dans le puits d’une boîte de culture à fond de verre à 48 puits. Répartissez le volume uniformément dans tout le fond du plat (Figure 1C).
  10. Incuber les iBBB à 37 °C pendant 30 à 40 min pour permettre à la matrice de la membrane basale GF réduite de polymériser, encapsulant les cellules dans la matrice.
  11. Ajouter 500 μL d’AM complété par 10 ng/mL de VEGF-A, 5 μg/mL de doxycycline et 10 μM Y27632.
  12. Le lendemain, changez de milieu pour AM complété par 10 ng/mL de VEGF-A. Continuez à changer le support tous les 2-3 jours. Après 2 semaines, arrêtez de prendre des suppléments de VEGF-A ; Les iBBB sont prêts pour les essais en aval après 2 semaines.

3. Induction de l’angiopathie amyloïde cérébrale (AAC) avec fibrilles Aβ

  1. Préparer des solutions mères de β amyloïde1-40 et deβ-amyloïde 1-42 à 200 μM dans du PBS.
  2. Ajouter Aβ au milieu iBBB sur des iBBB de 2 semaines jusqu’à une concentration finale de 20 nM. Incuber les cellules dans un milieu supplémenté en Aβ pendant 96 h (4 jours).
  3. Après 96 h, retirez le fluide et poursuivez la fixation (section 4).

4. Fixation et coloration de l’iBBB

  1. Pour fixer l’iBBB, retirez le milieu, lavez dans 1 mL de PBS et incubez dans 500 μL de paraformaldéhyde à 4 % pendant une nuit à 4 °C.
  2. Retirez la solution de paraformaldéhyde à 4 % et rincez pendant 4 x (au moins) 15 min dans 1 mL de PBS.
  3. Perméabiliser les échantillons dans du PBST à 0,3 % (PBS avec 0,3 % de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante en agitant doucement.
  4. Incuber les cultures dans un tampon bloquant (5 % de sérum normal dans 0,3 % de PBST) à température ambiante pendant au moins 1 h en agitant doucement.
    REMARQUE : Le type de sérum utilisé dépend de l’espèce hôte pour les anticorps secondaires utilisés. Par exemple, si l’espèce hôte des anticorps secondaires est la chèvre, utilisez du sérum de chèvre normal ; Si l’espèce hôte est l’âne, utilisez du sérum d’âne normal. Cela peut également être fait pendant la nuit à 4 °C en agitant doucement.
  5. Diluer les anticorps primaires à la concentration recommandée ou déterminée dans le tampon bloquant.
  6. Remplacez la solution bloquante par la dilution primaire de l’anticorps. Assurez-vous que les iBBB sont complètement immergés dans la solution d’anticorps pour une incubation uniforme ; 100 à 150 μL suffisent pour couvrir une BHE de 50 μL dans une boîte de culture à fond de verre à 48 puits. Incuber toute la nuit à 4 °C en agitant doucement.
  7. Retirez l’anticorps primaire. Laver les iBBB pendant 3 x 10-20 min dans du PBS à 0,3 %.
  8. Diluer l’anticorps secondaire à la concentration recommandée ou déterminée dans le tampon bloquant. De plus, ajoutez une coloration nucléaire, telle que Hoechst, à la solution d’anticorps secondaire à la concentration recommandée ou déterminée.
  9. Remplacez le dernier lavage PBS par la dilution secondaire d’anticorps. Assurez-vous que les iBBB sont complètement immergés dans la solution d’anticorps pour une incubation uniforme ; 100 à 150 μL suffisent pour couvrir une BHE de 50 μL dans une boîte de culture à fond de verre à 48 puits. Incuber à température ambiante pendant 2 h en agitant doucement.
    REMARQUE : Cela peut également être fait toute la nuit à 4 °C en agitant doucement.
  10. Lavez les iBBB 4 à 5 fois pendant au moins 1 h par lavage dans du PBS. Conserver dans un PBS ou un support de montage anti-décoloration à 4 °C jusqu’à ce que les échantillons soient imagés.
  11. Pour obtenir une image sur un microscope inversé, conservez les iBBB dans des assiettes ou des plats à fond de verre. Placez une lamelle de verre sur le puits de verre pour maintenir les iBBB en place (Figure 1D).

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Résultats

Une iBBB correctement formée se solidifie en un seul disque translucide (Figure 3A). Il est normal que l’iBBB se détache de la surface sur laquelle il a été pipeté pour la première fois après quelques jours. Cela ne peut être évité, mais n’est pas une préoccupation majeure pour la bonne formation de l’iBBB si l’on prend soin de ne pas aspirer accidentellement l’iBBB lors du changement de support. Au bout de 24 h, des cellules individuelles uniformément réparties peuvent être identifiées au m...

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Discussion

Le dysfonctionnement de la BHE est une comorbidité et, potentiellement, une cause ou un facteur aggravant dans de nombreuses maladies neurologiques 7,40,41. Cependant, il est presque impossible d’étudier la biologie moléculaire et cellulaire sous-jacente au dysfonctionnement et à la dégradation de la BHE chez les humains atteints de maladies neurovasculaires. La BHE inductible (iBBB) présentée dans ce protocole fournit un systèm...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne font état d’aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le NIH 3-UG3-NS115064-01, le R01NS14239, le Cure Alzheimer’s Fund, le NASA 80ARCO22CA004, l’Initiative Chan-Zuckerberg, la Fondation MJFF/ASAP et la Brain Injury Association of America. C.G. est soutenu par le NIH F31NS130909. La figure 1A a été créée avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
6E10 amyloïde-&bêta ; anticorpsBiolegendSIG-39320Utilisé à 1:1000
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Activin APeprotech20-14E
Alexa Fluor 488, 555, 647 anticorps secondairesInvitrogenDiversUtilisé à 1:1000
Amyloide-bêta 40 fibrilleAnaSpecAS-24235
Amyloïde-bêta 42 fibrilleAnaSpecAS-20276
Aquaporine-4anticorps InvitrogenPA5-53234Utilisé à 1:300
Astrocyte milieux basaux et supplémentsScienCell1801
B-27 supplément sans sérumGibco17504044
BMP4Peprotech120-05ET
CHIR99021Cyamn Chemical13112
DMEM/F12 avec GlutaMAX moyenGibco10565018
DoxycyclineMillipore-SigmaD3072-1ML
FGF-basicPeprotech100-18B
Fluoromount-G support de montage de glissièreVWR100502-406
ForskolinR& D Systems1099/10
GeltrexTM LDEV-Free hESC Facteur de croissance réduit Basement  ;GibcoA1413302
Fond en verre Plats de culture à 48 puitsMattek CorporationP48G-1.5-6-F
Supplément GlutaMAXGibco35050061
Hoechst 33342  ;InvitrogenH3570
Endothélial humain Milieu sans sérumGibco11111044
LDN193189Tocris6053
Minimum Essential Essential Solution d’acides aminés non essentiels (MEM-NEAA)  ;Gibco11140050
N-2 supplémentGibco17502048
Neurobasal mediumGibco21103049
Normal Donkey SerumMillipore-SigmaS30-100mLUtiliser le sérum pour correspondre à l’anticorps secondaire de l’hôte
Paraformaldéhyde (PFA)  ;ThermoFisher28908
PDGF-BBPeprotech100-14B
PDGFRB (récepteur bêta du facteur de croissance dérivé des plaquettes) anticorpsR& D SystemsAF385Utilisé à 1:500
Saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4Gibco10010031
Pecam1 (molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires 1)anticorps R& D SystemsAF806Utilisé à 1:500
Pénicilline-StreptomycineGibco15140122
PiggyBac plasmide (PB_iETV2_P2A_GFP_Puro)AddGene  ; Catalogue #168805
S100B AnticorpsSigma-AldrichS2532-100uLUtilisé à 1:500
SB43152Reprocell04-0010
Thioflavin TChem Impex22870Utilisé à 25uM
Triton X-100  ;Sigma-AldrichT8787-250mL
VE-cadhérine (CD144) anticorpsR& D systemsAF938Utilisé à 1:500
VEGF-APeprotech100-20
Y27632R& D Systems1254/10
ZO-1InvitrogenMA3-39100-A488Dilution = 1:500

Références

  1. Daneman, R., Prat, A. The blood-brain barrier. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), a020412(2015).
  2. Segarra, M., Aburto, M. R., Acker-Palmer, A. Blood-brain barrier dynamics to maintain brain homeostasis. Trends in Neurosciences. 44 (5), 393-405 (2021).
  3. Campos-Bedolla, P., Walter, F. R., Veszelka, S., Deli, M. A. Role of the blood-brain barrier in the nutrition of the central nervous system. Archives of Medical Research. 45 (8), 610-638 (2014).
  4. Hladky, S. B., Barrand, M. A. Fluid and ion transfer across the blood-brain and blood-cerebrospinal fluid barriers; a comparative account of mechanisms and roles. Fluids and Barriers of the CNS. 13 (1), 19(2016).
  5. Kaur, J., et al. Waste clearance in the brain. Frontiers in Neuroanatomy. 15, 665803(2021).
  6. Verheggen, I. C. M., Van Boxtel, M. P. J., Verhey, F. R. J., Jansen, J. F. A., Backes, W. H. Interaction between blood-brain barrier and glymphatic system in solute clearance. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 90, 26-33 (2018).
  7. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochimica et Biophysica Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  8. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the cns in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  9. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  10. Liu, W. Y., Wang, Z. B., Zhang, L. C., Wei, X., Li, L. Tight junction in blood-brain barrier: An overview of structure, regulation, and regulator substances. CNS Neuroscience & Therapeutics. 18 (8), 609-615 (2012).
  11. Siegenthaler, J. A., Sohet, F., Daneman, R. Sealing off the cns': Cellular and molecular regulation of blood-brain barriergenesis. Current Opinion in Neurobiology. 23 (6), 1057-1064 (2013).
  12. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40 (3), 648-677 (1969).
  13. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34 (1), 207-217 (1967).
  14. Mahringer, A., Fricker, G. Abc transporters at the blood-brain barrier. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 12 (5), 499-508 (2016).
  15. Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: Developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Developmental Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
  16. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  17. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  18. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  19. Heithoff, B. P., et al. Astrocytes are necessary for blood-brain barrier maintenance in the adult mouse brain. Glia. 69 (2), 436-472 (2021).
  20. Verkman, A. S. Aquaporin water channels and endothelial cell function. Journal of Anatomy. 200 (6), 617-627 (2002).
  21. Wolburg, H., Lippoldt, A. Tight junctions of the blood-brain barrier: Development, composition and regulation. Vascular Pharmacology. 38 (6), 323-337 (2002).
  22. Sagare, A. P., Bell, R. D., Zlokovic, B. V. Neurovascular dysfunction and faulty amyloid beta-peptide clearance in alzheimer disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (10), a011452(2012).
  23. Kapasi, A., Schneider, J. A. Vascular contributions to cognitive impairment, clinical alzheimer's disease, and dementia in older persons. Biochimica et Biophysica Acta. 1862 (5), 878-886 (2016).
  24. Blanchard, J. W., et al. Reconstruction of the human blood-brain barrier in vitro reveals a pathogenic mechanism of apoe4 in pericytes. Nature Medicine. 26 (6), 952-963 (2020).
  25. Huang, Z., et al. Blood-brain barrier integrity in the pathogenesis of alzheimer's disease. Frontiers in Neuroendocrinology. 59, 100857(2020).
  26. Morgan, L., et al. Inflammation and dephosphorylation of the tight junction protein occludin in an experimental model of multiple sclerosis. Neuroscience. 147 (3), 664-673 (2007).
  27. Kirk, J., Plumb, J., Mirakhur, M., Mcquaid, S. Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage and active demyelination. Journal of Pathology. 201 (2), 319-327 (2003).
  28. Balasa, R., Barcutean, L., Mosora, O., Manu, D. Reviewing the significance of blood-brain barrier disruption in multiple sclerosis pathology and treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8370(2021).
  29. Marchi, N., Granata, T., Ghosh, C., Janigro, D. Blood-brain barrier dysfunction and epilepsy: Pathophysiologic role and therapeutic approaches. Epilepsia. 53 (11), 1877-1886 (2012).
  30. Kiani, L. Blood-brain barrier disruption following seizures. Nature Reviews. Neurology. 19 (4), 2023(2023).
  31. Knowland, D., et al. Stepwise recruitment of transcellular and paracellular pathways underlies blood-brain barrier breakdown in stroke. Neuron. 82 (3), 603-617 (2014).
  32. Okada, T., Suzuki, H., Travis, Z. D., Zhang, J. H. The stroke-induced blood-brain barrier disruption: Current progress of inspection technique, mechanism, and therapeutic target. Current Neuropharmacology. 18 (12), 1187-1212 (2020).
  33. Gireud-Goss, M., Mack, A. F., Mccullough, L. D., Urayama, A. Cerebral amyloid angiopathy and blood-brain barrier dysfunction. Neuroscientist. 27 (6), 668-684 (2021).
  34. Mesentier-Louro, L. A., Suhy, N., Broekaart, D., Bula, M., Pereira, A. C., Blanchard, J. W. Modeling the blood-brain barrier using human-induced pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2683, 135-151 (2023).
  35. Qian, T., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells. Science Advances. 3 (11), e1701679(2017).
  36. Wang, K., et al. Robust differentiation of human pluripotent stem cells into endothelial cells via temporal modulation of etv2 with modified mrna. Science Advances. 6 (30), eaba7606(2020).
  37. Patsch, C., et al. Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells. Nature Cell Biology. 17 (8), 994-1003 (2015).
  38. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and ips cells by dual inhibition of smad signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  39. Tcw, J., et al. An efficient platform for astrocyte differentiation from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 9 (2), 600-614 (2017).
  40. Zlokovic, B. V. The blood-brain barrier in health and chronic neurodegenerative disorders. Neuron. 57 (2), 178-201 (2008).
  41. Daneman, R. The blood-brain barrier in health and disease. Annals of Neurology. 72 (5), 648-672 (2012).
  42. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nature Reviews. Drug Discovery. 6 (8), 650-661 (2007).
  43. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
  44. Erickson, M. A., Wilson, M. L., Banks, W. A. In vitro modeling of blood-brain barrier and interface functions in neuroimmune communication. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 26(2020).
  45. Musafargani, S., et al. Blood brain barrier: A tissue engineered microfluidic chip. Journal of Neuroscience Methods. 331, 108525(2020).
  46. Hajal, C., et al. Engineered human blood-brain barrier microfluidic model for vascular permeability analyses. Nature Protocols. 17 (1), 95-128 (2022).
  47. Oddo, A., et al. Advances in microfluidic blood-brain barrier (bbb) models. Trends in Biotechnology. 37 (12), 1295-1314 (2019).

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