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Transplantation trachéale intrapulmonaire murine : un modèle pour étudier la maladie oblitérante des voies respiratoires après une transplantation pulmonaire

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DOI :

10.3791/65953

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10 novembre 2023

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1Latner Thoracic Research Laboratories, Toronto General Hospital Research Institute, University Health Network, 2Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto

Dans cet article

Résumé

Le modèle de transplantation trachéale intrapulmonaire (IPTT) murine est précieux pour l’étude de la maladie oblitérante des voies respiratoires (OAD) après une transplantation pulmonaire. Il offre un aperçu du comportement immunologique et angiogénique spécifique du poumon dans l’oblitération des voies respiratoires après allotransplantation avec une reproductibilité élevée. Nous décrivons ici la procédure IPTT et ses résultats attendus.

Résumé

La transplantation trachéale intrapulmonaire (IPTT) murine est utilisée comme modèle de maladie oblitérante des voies respiratoires (OAD) après une transplantation pulmonaire. Initialement rapporté par notre équipe, ce modèle a été utilisé dans l’étude de l’OAD en raison de sa haute reproductibilité technique et de son aptitude à étudier les comportements immunologiques et les interventions thérapeutiques.

Dans le modèle IPTT, un greffon trachéal de rongeur est directement inséré dans le poumon du receveur par la plèvre. Ce modèle est distinct du modèle de greffe trachéale hétérotopique (HTT), dans lequel les greffons sont transplantés dans des sites sous-cutanés ou omentaux, et du modèle de greffe trachéale orthotopique (OTT) dans lequel la trachée du donneur remplace la trachée du receveur.

La mise en œuvre réussie du modèle IPTT nécessite des compétences avancées en anesthésie et en chirurgie. Les compétences en anesthésie comprennent l’intubation endotrachéale du receveur, l’établissement des paramètres ventilatoires appropriés et l’extubation au moment opportun après la récupération de l’anesthésie. Les compétences chirurgicales sont essentielles pour une mise en place précise du greffon dans le poumon et pour assurer une étanchéité efficace de la plèvre viscérale afin d’éviter les fuites d’air et les saignements. En général, le processus d’apprentissage dure environ 2 mois.

Contrairement aux modèles HTT et OTT, dans le modèle IPTT, les voies respiratoires allogreffées développent une oblitération des voies respiratoires dans le microenvironnement pulmonaire concerné. Cela permet aux chercheurs d’étudier les processus immunologiques et angiogéniques spécifiques aux poumons impliqués dans l’oblitération des voies respiratoires après une transplantation pulmonaire. De plus, ce modèle est également unique en ce sens qu’il présente des organes lymphoïdes tertiaires (TLO), qui sont également observés dans les allogreffes pulmonaires humaines. Les TLO sont composés de populations de lymphocytes T et B et caractérisés par la présence de veinules endothéliales élevées qui dirigent le recrutement des cellules immunitaires ; Par conséquent, ils sont susceptibles de jouer un rôle crucial dans l’acceptation et le rejet des greffons. Nous concluons que le modèle IPTT est un outil utile pour étudier les voies immunitaires et profibrotiques intrapulmonaires impliquées dans le développement de l’oblitération des voies respiratoires dans l’allogreffe de transplantation pulmonaire.

Introduction

La transplantation pulmonaire s’est avérée être un traitement efficace pour les patients atteints de maladies respiratoires en phase terminale. Cependant, le taux de survie médian des receveurs de transplantation pulmonaire humaine n’est que d’environ 6 ans, le développement d’une bronchiolite oblitérante (OB), un type de maladie obstructive des voies respiratoires (OAD), étant une cause majeure de décès après la première année suivant la transplantation1.

Plusieurs modèles animaux ont été utilisés pour étudier le mécanisme sous-jacent à l’OAD. L’un de ces modèles est le modèle2 de transplantation trachéale hétérotopique (HTT). Dans ce modèle, les greffons trachéaux sont implantés dans le tissu sous-cutané ou l’épiploon du receveur. Une perte induite par l’ischémie des cellules épithéliales du greffon trachéal se produit, suivie d’une infiltration lymphocytaire alloréactive et d’une apoptose des cellules épithéliales du donneur. Les fibroblastes et les myofibroblastes migrent autour de la trachée, produisant une matrice extracellulaire. Enfin, une oblitération fibreuse complète de la lumière des voies respiratoires se produit. Le modèle HTT est techniquement simple, offre un environnement in vivo et offre une grande reproductibilité.

Un autre modèle d’étude de l’OAD est le modèle de transplantation trachéale orthotopique (OTT) chez le rat, où des greffons trachéaux sont interposés dans la trachée du receveur pour maintenir la ventilation physiologique3. Dans ce modèle, l’épuisement des cellules épithéliales du donneur induit par l’ischémie entraîne leur remplacement par des cellules épithéliales receveuses dans la trachée, formant des voies respiratoires non obstruées accompagnées d’une fibrose modérée. Bien que ces modèles aient contribué à la compréhension de l’oblitération des voies respiratoires après transplantation pulmonaire, ils présentent des limites en termes de récapitulation du microenvironnement parenchymateux pulmonaire.

Notre groupe de recherche a introduit le modèle de transplantation trachéale intrapulmonaire (IPTT) chez le rat, où les greffons trachéaux sont implantés dans le poumon receveur4 (Figure 1). Le modèle IPTT présente une oblitération fibreuse de la lumière des voies respiratoires se produisant dans le microenvironnement pulmonaire. De plus, il a été appliqué avec succès à des souris qui sont techniquement plus difficiles que le rat IPTT 5,6,7,8,9,10. Cette adaptation du modèle IPTT murin nous a permis d’approfondir les détails complexes de l’environnement immunologique pulmonaire de l’OAD après une transplantation pulmonaire à l’aide de souris transgéniques.

Le modèle IPTT possède des caractéristiques uniques. L’une est la néoangiogenèse, qui est facilitée par la circulation pulmonaire et joue un rôle crucial dans l’oblitération des voiesrespiratoires 4,10. De plus, le modèle IPTT présente des agrégats lymphoïdes, dont certains ont des veinules endothéliales élevées exprimant l’adresse des ganglions périphériques, ce qui indique qu’il s’agit d’organes lymphoïdes tertiaires (TLO)7,8. Les TLO ressemblent à des ganglions lymphatiques et sont constitués de lymphocytes T, de lymphocytes B et, fréquemment, d’un centre germinatif accompagné de cellules dendritiques folliculaires11,12. Des TLO ont été rapportés dans diverses maladies inflammatoires chroniques, y compris l’oblitération des voies respiratoires, ce qui rend le modèle IPTT adapté à l’étude du rôle des TLO dans l’oblitération des voies respiratoires 7,8,11,12,13. Cet article présente la méthodologie du modèle IPTT murin, dans le but de familiariser les chercheurs avec ce modèle et de faciliter d’autres recherches sur l’oblitération des voies respiratoires après une transplantation pulmonaire.

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Protocole

Tous les animaux ont été traités conformément aux lignes directrices établies par le Conseil canadien de protection des animaux dans le Guide sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité de protection des animaux de l’Institut de recherche de l’Hôpital général de Toronto, Réseau universitaire de santé.

1. Chirurgie du donneur

REMARQUE : Les souris BALB/c sont utilisées comme exemple de donneurs pour l’expérience. Toutes les procédures doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile.

  1. Avant l’intervention, notez le poids de chaque souris.
  2. Euthanasier la souris à l’aide d’une chambre à CO2 .
  3. Une fois la mort confirmée, placez la souris en décubitus dorsal et fixez les membres avec du ruban adhésif.
  4. Préparez la zone chirurgicale en la stérilisant avec de l’alcool isopropylique à 70 %.
    REMARQUE : Si nécessaire et selon les recommandations du comité local d’éthique animale, coupez la fourrure du site d’incision.
  5. Faites une incision médiane sur la peau, en partant du milieu de l’abdomen et en s’étendant jusqu’à la région cervicale antérieure.
  6. Accédez à la trachée en rétractant soigneusement les coussinets adipeux, en déplaçant latéralement les muscles de la sangle et en séparant la trachée du tissu conjonctif environnant. Utilisez des pinces pour créer de l’espace entre la trachée et l’œsophage.
  7. Soulevez le xiphoïde et coupez le diaphragme.
  8. Soulevez le sternum, en assurant un chemin dégagé du sternum à la région du cou en insérant un hémostatique. Serrez la cage thoracique des deux côtés et coupez à travers le sternum, en vous étendant jusqu’aux muscles du cou.
  9. Retirez le thymus et toute graisse ou muscle obstruant la trachée pour exposer la bifurcation trachéale.
  10. Coupez les deux bronches principales et séparez soigneusement les voies respiratoires de l’œsophage.
  11. Coupez le larynx et retirez-le.
  12. Vaporisez la trachée disséquée avec une solution saline stérile ou une solution de conservation avec de la gaze stérile imbibée de solution saline stérile ou de solution de conservation et placez-la sur de la glace pour préserver sa viabilité.

2. Chirurgie du receveur

REMARQUE : Les souris C57BL/6 sont utilisées comme exemple de receveurs pour l’expérience.

  1. Administrer de la buprénorphine à libération prolongée par voie sous-cutanée à la dose de 1 mg/kg le matin du jour de la chirurgie.
  2. Induire l’anesthésie dans une chambre d’induction à l’aide d’isoflurane à 5 %.
  3. Une fois que la souris est légèrement anesthésiée, injecter par voie intrapéritonéale un cocktail composé de (0,1 mg/g) de xylazine et de (0,01 mg/g) de kétamine.
  4. Remettez la souris dans la chambre d’induction avec 2 à 3 % d’isoflurane maintenu.
  5. Rasez la fourrure au site chirurgical. De plus, administrez la bupivacaïne sous forme de bloc de ligne par voie sous-cutanée le long du site d’insicion prévu à une dose de 7 mg / kg.
  6. Confirmer l’absence de réponse réflexe à un pincement de l’orteil avant l’intubation orotrachéale. Intubez la souris par voie orotrachéale à l’aide d’un cathéter intraveineux de 20 G et connectez-la à un ventilateur d’un volume courant de 500 μL, d’une fréquence respiratoire de 120 bpm, d’oxygène à 100 % et d’isoflurane à 2 %. Utilisez un support avec une pince appliquée sur la langue, en maintenant l’animal en position verticale avec le cou tendu, pour faciliter cette procédure.
  7. Activez un coussin chauffant et positionnez la souris en position latérale droite sur le dessus du coussinet, la tête éloignée du chirurgien et la queue tournée vers le chirurgien (Figure 2). Fixez les membres avec du ruban adhésif. Mettez une pommade vétérinaire sur les yeux pour éviter la sécheresse sous anesthésie.
  8. Frottez la zone chirurgicale avec de la povidone iodée à 7,5 %, stérilisez-la avec de l’alcool isopropylique à 70 % et frottez-la à nouveau avec de la povidone iodée à 10 %. Appliquez des champs chirurgicaux stériles pour couvrir la zone chirurgicale.
  9. Charger la trachée du donneur dans un cathéter intraveineux de 16 G pendant ce temps (Figure 3C,D).
  10. Utilisez un scalpel pour faire une incision dans la peau du receveur et cautériser le muscle et le tissu conjonctif.
  11. Ouvrez le cinquième ou sixième espace intercostal et maintenez la cage thoracique ouverte à l’aide de deux écarteurs.
  12. Disséquez le ligament pulmonaire inférieur à l’aide de cotons-tiges et de ciseaux.
  13. Simulez la création de la voie de la trachée donneuse (Figure 3G,H).
  14. Fixez le tube de sortie du ventilateur en l’occlusant partiellement avec un robinet d’arrêt à trois voies pour faciliter le gonflage du poumon gauche.
  15. Créez une voie en ponctionnant le poumon gauche avec une aiguille de 20 G. S’assurer que la profondeur de ponction est à peu près équivalente à la longueur de l’allogreffe trachéale. Sélectionnez le site de ponction au bord du poumon (comme indiqué à la figure 3I), en veillant à ce que le chemin soit parallèle au plateau de la table (comme indiqué par un cercle bleu à la figure 3J).
    REMARQUE : Un angle d’insertion vers le haut entraînera la pénétration de la couche pleurale, tandis qu’un angle plus profond peut entraîner un saignement des principaux vaisseaux (comme indiqué par des croix rouges sur la figure 3J).
  16. Insérez le cathéter intraveineux de 16 G dans le poumon gauche et extrudez la trachée du donneur dans le poumon gauche. Après l’insertion de l’allogreffe trachéale, relâchez le robinet d’arrêt à trois voies pour permettre un écoulement expiratoire non obstrué à travers le tube de sortie.
  17. Fermez le site d’injection pleurale à l’aide d’une pince (Figure 3K,L). Positionnez le clip avec précision sur le site de ponction, avec son bord aligné pour correspondre au contour du bord du poumon (indiqué par le cercle bleu de la figure 3L).
    REMARQUE : Un emplacement incorrect pour le site de coupe peut entraîner une étanchéité inefficace et une fuite d’air, tandis qu’une profondeur insuffisante du clip peut entraîner le détachement du clip après la chirurgie (comme le montrent les croix rouges de la figure 3L).
  18. Remplissez la cavité thoracique avec une solution saline et absorbez la solution saline avec une gaze.
  19. Regonflez le poumon gauche et fermez les côtes à l’aide d’une technique de suture courante.
  20. Fermez le muscle et la peau avec des sutures interrompues.
  21. Administrer l’analgésique méloxicam par voie sous-cutanée à une dose de 5 mg/kg à la fin de la chirurgie.
  22. Observez la souris réceptrice jusqu’à ce qu’elle soit réveillée. Ensuite, retirez la sonde trachéale et placez la souris receveuse dans une cage.
    REMARQUE : Les souris receveuses doivent être logées individuellement.
  23. Administrer le méloxicam (5 mg/kg) une fois par jour par injection sous-cutanée, en commençant 24 h après la chirurgie et en continuant pendant 3 jours après l’opération.

3. Prélèvement d’échantillons sur des souris receveuses

  1. Induire l’anesthésie dans une chambre d’induction à l’aide d’isoflurane à 5 %.
  2. Confirmer l’absence de réponse réflexe au pincement de l’orteil avant l’intubation orotrachéale. La méthode d’intubation et le réglage du respirateur sont les mêmes que dans le cas de la chirurgie receveuse.
  3. Placez la souris en décubitus dorsal et sécurisez les membres.
  4. Préparez la zone chirurgicale en la stérilisant avec de l’alcool isopropylique à 70 %.
  5. Faites une incision médiane sur la peau, en partant du milieu de l’abdomen et en s’étendant jusqu’à la région cervicale antérieure.
  6. Exsanguiner la souris par la veine cave inférieure à l’aide d’une seringue de 1 ml reliée à une aiguille de 25 G, ce qui entraîne l’euthanasie.
  7. Ouvrez le coffre et accédez à la trachée de la même manière qu’une souris donneuse. Attachez la trachée autour du tube d’intubation avec de la soie 7-0.
  8. Retirez le thymus, la graisse et les muscles pour exposer le cœur.
  9. Coupez l’oreillette gauche, l’oreillette droite et la veine cave inférieure. Perfuser les poumons avec 3 mL de solution saline stérile par le ventricule droit.
  10. Pour l’analyse histologique, gonflez les poumons avec 10 % de formol à l’aide d’un tube d’intubation.
  11. Extubez le tube de ventilation et attachez la trachée avec de la soie 7-0.
  12. Divisez le larynx et l’œsophage. Tirez-les dans une direction inférieure, puis extrayez le bloc cardiaque et pulmonaire, en le plaçant dans 10% de formol.

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Résultats

D’après notre expérience, la maîtrise de ce modèle nécessite généralement environ 2 mois de formation. Une fois que la compétence est atteinte, les procédures du donneur nécessitent généralement 15 minutes, tandis que les procédures du receveur nécessitent environ 30 minutes. Le taux de mortalité attendu pour un opérateur formé est de 0 %.

Sur la figure 4A, une allogreffe trachéale présente une obstruction complète du tissu fibroblastique et les cellules épithélia...

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Discussion

La procédure IPTT murine comprend des étapes critiques. En ce qui concerne l’anesthésie, la première étape cruciale est l’intubation endotrachéale. Il est essentiel de tenir la souris à une hauteur appropriée avec ses pattes sur la table pour visualiser les cordes vocales et faciliter l’intubation immédiate. De plus, un réglage minutieux du volume respiratoire et de la pression expiratoire positive (PEEP) est nécessaire. En règle générale, un volume respiratoire de 500 μL et une PEEP de 2 cmH2O sont suffisants...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs de ce manuscrit n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier Jerome Valero pour l’édition de ce manuscrit. La figure 1 et la figure 3I,J,L ont été créées avec BioRender.com.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BALB/cJThe Jackson Laboratory8-10 semaines 25-30 gMâle, Donneur
BD 1 mL SeringueBecton Dickinson309659
BD PrecisionGlide Needle Aiguile BD
PrecisionGlide		Becton Dickinson305122
Bovie Change-A-Tip Deluxe High-TempertureBovieDEL1
C57BL/6JThe Jackson Laboratory8-10 semaines 25-30 gMâle, Receveur
Dumont #5/45 ForcepsF· ; S· ; T11251-35
Ethicon Ligaclip Appliers à clipsmultiples-EthiconLX107
Pince Graefe extra fineF· ; S· ; T11150-10
Glover Bulldog ClampIntegra320-127
Halsted-Mosquito HemostatsF· ; S· ; T13009-12
Horizon Titanium Ligating ClipsTeleflex001201
Leica M651 Microscope chirurgical manuel pour les procédures microchirurgicalesLeica
Magnetix Fixator avec verrouillage à ressortCD+ LABSACD-001
Ciseaux microchirurgicauxJarit277-051
Ventilateur pour souris et rat périnatal Modèle 687Harvard55-0001
Perfadex PlusXVIVO19850
Embout Écarteur Blunt - 2.5 mmCD+ LABSACD-011
table pour petits animauxCD+ LABSACD-003
Surgipro Blue 24" CV-1 Taper, Double ArmedCovidienVP702X
Systane onguentAlconn1444062
Système ElastomerCD+ LABSACD-007
Cathéter Terumo Surflo IV, 20 G x 1 poTerumo Medical CorporationSR-OX2025CA
VMT Table Topbenson91803300

Références

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Mots-clés

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