Article de méthode

Mesure des changements dans l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale à l’aide de deux biocapteurs basés sur l’impédance en réponse aux cellules cancéreuses et aux cytokines

DOI :

10.3791/65959

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22 septembre 2023

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1Department of Molecular Medicine and Pathology, School of Medical Sciences, University of Auckland, 2Centre for Brain Research, University of Auckland, 3School of Biological Sciences, University of Auckland

Dans cet article

Résumé

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Nous démontrons ici la technique d’utilisation de biocapteurs basés sur l’impédance : ECIS et cellZscope, pour mesurer la force de la barrière endothéliale cérébrale. Nous détaillons la préparation et la technique d’ajout de divers stimuli à un modèle in vitro de l’endothélium cérébral. Nous mesurons, enregistrons et donnons une analyse représentative des résultats.

Résumé

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La barrière hémato-encéphalique (BHE) protège le parenchyme cérébral contre les agents pathogènes nocifs dans le sang. La BHE se compose de l’unité neurovasculaire, comprenant les péricytes, les processus astrocytaires du pied et les cellules endothéliales étroitement adhérentes. Ici, les cellules endothéliales cérébrales forment la première ligne de barrière contre les agents pathogènes transmissibles par le sang. Dans des conditions telles que le cancer et la neuroinflammation, les facteurs circulants dans le sang peuvent perturber cette barrière. La progression de la maladie s’aggrave considérablement après la rupture de la barrière, ce qui permet l’accès ou l’altération de certaines régions du cerveau. Cela aggrave considérablement les pronostics, notamment en raison des options de traitement limitées disponibles au niveau du cerveau. Par conséquent, des études émergentes visent à étudier des thérapies potentielles qui peuvent empêcher ces facteurs néfastes dans le sang d’interagir avec les cellules endothéliales du cerveau.

Les instruments ECIS (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing) et cellZscope, disponibles dans le commerce, mesurent l’impédance à travers les monocouches cellulaires, telles que l’endothélium BHE, afin de déterminer la résistance de leur barrière. Nous détaillons ici l’utilisation des deux biocapteurs dans l’évaluation de l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale lors de l’ajout de divers stimuli. De manière cruciale, nous soulignons l’importance de leur capacité à haut débit pour l’investigation simultanée de plusieurs variables et traitements biologiques.

Introduction

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Cet article traite des tendances actuelles en matière d’évaluation des cellules microvasculaires. Nous détaillons plus particulièrement l’utilisation de deux plateformes disponibles dans le commerce pour mesurer les propriétés de barrière des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales. Les cellules endothéliales sont des cellules faisant face au sang, qui tapissent la paroi du vaisseau. Cependant, les microvaisseaux cérébraux sont uniques car ils aident à former la barrière hémato-encéphalique protectrice (BHE)1,2,3. La BHE a pour fonction de réguler le transport des molécules du sang vers le cerveau. Les maladies périphériques qui affectent le système nerveux central (SNC) sont généralement liées à une défaillance fonctionnelle de la BHE 4,5. Les structures anatomiques qui forment la BHE ne sont pas présentes à l’interface entre le sang et le tissu ailleurs dans le corps6. Ces structures anatomiques comprennent des péricytes, qui sont situés à proximité des cellules endothéliales cérébrales, et régulent leur prolifération et leur perméabilité ; les processus astrocytaires du pied, qui sont impliqués dans le brassage des nutriments et le soutien anatomique 7,8 ; La microglie, qui sont les macrophages résidents dans le cerveau, souvent impliqués dans la neuroinflammation et l’ischémie 9,10,11,12, et l’endothélium cérébral, qui forme une monocouche de cellules étroitement adhérées sans fenestrations13,14. L’endothélium cérébral est généralement connu sous le nom de « barrière endothéliale cérébrale » et forme une barrière structurelle et fonctionnelle de cinq manières distinctes. Tout d’abord, le composant de la barrière paracellulaire est formé par l’adhésion aux jonctions latérales cellule-cellule. Deuxièmement, le composant de la barrière transcellulaire est soutenu par la régulation de l’endocytose. Troisièmement, une membrane basale spécialisée ancre et soutient l’endothélium via une riche matrice extracellulaire composée en grande partie de collagène15,16. Les deux derniers mécanismes sont par le biais d’enzymes et de transporteurs qui aident à réguler le métabolisme des médicaments et l’absorption de grosses molécules, respectivement17.

Les interactions paracellulaires forment le composant majeur de la barrière endothéliale cérébrale, facilitée par des jonctions serrées (TJ), comprenant des protéines membranaires claudines, de l’occludine et des molécules d’adhésion jonctionnelle (JAMs)18. Une forte liaison homotypique des protéines membranaires forme la première barrière structurelle, bien que les JAM se lient également aux protéines accessoires zonula occludens, liant ainsi les TJ au cytosquelette d’actine19,20. Les liaisons d’actine placent les TJs dans la région apicale de l’endothélium21, qui polarise fonctionnellement les cellules endothéliales pour former la barrière structurelle de ce côté apical ou « face au sang ». Dans la région basolatérale de l’endothélium, des jonctions adhérentes (AJ) hautement spécialisées jouent un rôle régulateur dans le maintien de la morphologie cellulaire. Les AJ comprennent des cadhérines dépendantes du calcium, qui lient le cytosquelette des cellules endothéliales voisines par le biais du complexe de la famille des caténines20,22. La cadhérine endothéliale vasculaire (VE-Cadhérine) est l’une de ces cadhérines, qui régule l’expression des protéines TJ et la fonction globale de la barrière endothéliale pour maintenir l’intégrité de la monocouche endothéliale 23,24,25,26,27. Les modulateurs inflammatoires, tels que le facteur de nécrose tumorale-alfa (TNFα), signalent l’internalisation de la VE-cadhérine loin des jonctions cellulaires, entraînant une déstabilisation de la barrière endothéliale 28,29,30. La molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires (PECAM)31 est une autre cadhérine AJ qui stabilise et remodèle les jonctions endothéliales32,33. La densité de ces protéines jonctionnelles restreint le flux d’électrons dans l’espace paracellulaire entre les cellules endothéliales. Cet attribut est utilisé pour mesurer la force de la barrière endothéliale ou la résistance électrique trans-endothéliale (TER) à travers des monocouches cellulaires confluentes comme l’endothélium cérébral.

Les études thérapeutiques se concentrent sur l’endothélium cérébral en raison de son rôle vital à l’interface hémato-encéphalique. Plusieurs maladies affectent négativement l’endothélium cérébral, notamment les affections neuro-inflammatoires comme la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux, les maladies neurodégénératives et le cancer 34,35,36,37. Une fois que la barrière endothéliale cérébrale est perturbée, la progression de la maladie s’aggrave considérablement car le cerveau est efficacement exposé aux stimuli nocifs dans le sang38. Nous avons précédemment montré que les médiateurs inflammatoires et les cellules de mélanome métastatiques perturbent la barrière endothéliale cérébrale en utilisant deux technologies qui mesurent la force de la barrière endothéliale 39,40,41.

La détection d’impédance électrocellulaire-substrat (ECIS) est un biocapteur basé sur l’impédance qui permet une évaluation en temps réel et sans marquage de l’intégrité de la barrière cellulaire endothéliale. Ici, les puits d’analyse sont revêtus d’électrodes plaquées or, ce qui introduit du courant alternatif (CA) dans le système d’essai. Les cellules endothéliales du cerveau sont ensemencées dans ces puits, ce qui signifie que le courant alternatif peut être appliqué à travers les cellules. (Figure 1A-puits ; vue latérale). Cela établit le circuit électrique, qui est utilisé pour calculer l’impédance (Figure 1A-schéma du circuit). L’impédance augmente lorsque les cellules endothéliales du cerveau adhèrent à la plaque et commencent à former leurs jonctions paracellulaires. L’impédance plafonne lorsque les cellules endothéliales deviennent confluentes, formant une monocouche et limitant le flux de courant. L’application de courant alternatif à différentes fréquences influence la voie de circulation du courant à travers les cellules endothéliales. Le courant circule à travers le corps de la cellule endothéliale lorsqu’il est appliqué à une fréquence plus élevée (>104 Hz). Cela fournit des informations sur la capacité de la monocouche cellulaire, utilisées pour évaluer la fixation et la propagation des cellules. Aux basses fréquences (102-10 4 Hz), l’impédance de la membrane est élevée, limitant le flux de courant à travers les cellules. Dans ce cas, la majorité du courant navigue entre les cellules. À environ 4 000 Hz, la résistance au flux de courant est attribuée principalement aux jonctions endothéliales cellule-cellule, via l’espace intercellulaire . Par conséquent, tout changement de résistance à cette fréquence fournit des informations sur l’intégrité de la barrière endothéliale.

Alors que les mesures d’impédance brutes peuvent fournir des informations sur les propriétés de la barrière, le logiciel ECIS peut ensuite modéliser mathématiquement la résistance totale mesurée sur plusieurs fréquences AC et, plus précisément, la séparer en deux paramètres clés de l’intégrité de la barrière. Ces paramètres sont la résistance paracellulaire entre les membranes latérales des cellules voisines (résistance bêta-Rb ; barrière paracellulaire ; Figure 1A - flèches vertes), et la résistance basolatérale entre la couche de cellules basales et l’électrode (résistance alpha-Alpha ; barrière basolatérale ; Figure 1A - flèches bleues). Un troisième paramètre modélisé est également mesuré : la capacité de la membrane cellulaire (Cm ; Figure 1A - flèches rouges). Le Cm affiche le flux capacitif du courant à travers les cellules, ce qui indique la composition de la membrane cellulaire. Dans ce cas, les modifications de la barrière Rb ou paracellulaire indiquent des altérations des TJ et des AJ, cruciales pour le maintien de l’intégrité de la barrière endothéliale. Pour interpréter de manière fiable le Rb, quatre hypothèses clés sont formulées, telles que développées par Giaever et Keese42 et discutées de manière critique par Stolwijk et al.43. Bien que ces hypothèses soient importantes pour garantir la validité de la modélisation ECIS, elles sont facilement satisfaites par une monocouche endothéliale confluente.

Comme ECIS, le cellZscope permet de mesurer les changements de résistance de la barrière endothéliale ; Cependant, les cellules sont cultivées sur un insert de membrane poreuse. Dans ce système, le circuit électrique se fait entre deux électrodes de part et d’autre d’un insert à membrane. La monocouche endothéliale est cultivée sur le dessus de cet insert membranaire, ce qui permet de mesurer la résistance électrique trans-endothéliale (TER) (Figure 1B-puits ; vue latérale). Comme avec ECIS, dans ce système, l’impédance totale peut être attribuée à plusieurs composants de barrière, en fonction de la fréquence du courant appliqué44. Aux basses fréquences, la capacité de l’électrode (CEl) domine l’impédance totale du système. Alternativement, aux hautes fréquences, la résistance du média (milieu R) domine l’impédance totale. Par conséquent, les mesures les plus utiles se situent dans la gamme des fréquences moyennes (102-10 4 Hz), qui fournit des informations sur deux composants clés de la barrière endothéliale (Figure 1B - schéma de circuit). Tout d’abord, à 103-10 4 Hz, la capacité de la couche cellulaire (CCl) domine l’impédance globale car la résistance de la membrane (membrane R) est suffisamment élevée pour être négligée et le courant circule principalement à travers le condensateur. Par conséquent, le CCl indique des changements de résistance à travers la membrane cellulaire. Alternativement, le TER transmet principalement l’impédance globale à 102-10 3 Hz, où le flux de courant est canalisé à travers des espaces jonctionnels entre cellules voisines, maintenus ensemble par des protéines jonctionnelles. Par conséquent, cela fournit des informations sur la composante paracellulaire de la barrière endothéliale, comme on l’a vu précédemment avec Rb sur ECIS.

La figure 1C détaille comment des régions spécifiques de l’endothélium cérébral sont perturbées par le traitement avec des cellules de mélanome. Cette perturbation est détectée par les biocapteurs par une modification du flux de courant dans l’espace paracellulaire (mesurée en Rb ou TER) ; l’espace basolatéral (mesuré en Alpha) ; et la membrane cellulaire (mesurée en Cm ou CCl). Nous avons utilisé les deux biocapteurs détaillés dans cette introduction pour mesurer la modification de la barrière endothéliale cérébrale après un traitement avec divers stimuli tels que des cytokines ou des cellules de mélanome invasives. La résistance mesurée diminue si un stimulus donné perturbe la barrière endothéliale, créant un chemin de moindre résistance pour permettre la circulation du courant. Par conséquent, une diminution de la « résistance de la barrière » suggère une perte d’intégrité de la barrière ou une perturbation de la barrière endothéliale cérébrale. Dans ces essais, nous avons étudié cette perturbation en interprétant la résistance et les paramètres modélisés en temps réel. L’application d’ECIS et de cellZscope pour répondre à de telles questions de recherche est détaillée ailleurs 39,41,45,46.

La recherche in vitro permet de découvrir des mécanismes cruciaux de la maladie en révélant des molécules et des voies fonctionnelles qui font progresser la maladie. Cependant, cela nécessite une réplication fiable de la maladie in vitro, ce qui diffère considérablement d’un corps fonctionnel. Dans un scénario idéal, la recherche in vitro devrait être reproductible, non invasive, sans marquage, quantitative et imiter les influences structurelles trouvées in vivo. Dans cet article, nous détaillons la méthodologie d’utilisation de ces deux technologies concurrentes pour mesurer les changements induits par le traitement de l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale. Nous discutons des avantages de combiner leurs résultats pour fournir une image plus complète de la perturbation des barrières et partageons les limites qui doivent encore être surmontées.

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Protocole

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1. Utilisation d’ECIS pour surveiller les changements dans l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale en réponse à divers traitements

  1. Configuration du logiciel, de la station de réseau et de la machine
    1. Connectez la station réseau à 96 puits à la machine. Placez la station de réseau dans un sac en plastique et placez-la dans l’incubateur au moins 1 h avant le test pour lui permettre de se réchauffer. Retirez le sac en plastique immédiatement avant l’expérience.
    2. Une fois prêt, allumez la machine et ouvrez le logiciel correspondant sur l’ordinateur. Appuyez sur le bouton Configuration sous l’onglet Collecter les données . Le logiciel effectuera une vérification de connexion, qui détectera le type d’adaptateur connecté (par exemple, une station de réseau de 96 puits) et affichera les puits rouges sur la carte de plaque illustrée. Cela signifie que le logiciel détecte l’adaptateur mais ne peut pas détecter une plaque attachée. Le système est maintenant prêt pour la plaque de 96 puits.
  2. Préparation de la plaque du biocapteur à 96 puits
    REMARQUE : La disposition des plaques à 96 puits est utilisée. La base de chaque puits est ornée de doigts d’électrodes plaquées or qui s’entrecroisent. Les plaques sont livrées dans des emballages stériles qui ne doivent être ouverts que dans une hotte stérile ou une enceinte de sécurité biologique. Les électrodes d’or doivent d’abord être stabilisées chimiquement en ajoutant 10 mM de cystéine pour maintenir la capacité de l’électrode.
    1. Préparez les 10 mM de cystéine dans une auge stérile et, à l’aide d’un multicanal, pipetez soigneusement 100 μL dans chaque puits. Incuber la cystéine pendant 15 minutes à température ambiante puis aspirer soigneusement, en pipetant uniquement sur les bords du puits, pour éviter de rayer l’électrode. Lavez la cystéine au moins 2 fois avec de l’eau désionisée stérile (pas de PBS) en utilisant la même technique de pipetage.
      REMARQUE : Les électrodes à plaque peuvent également être stabilisées électriquement à l’aide d’un média chaud sur l’appareil ECIS, au lieu d’utiliser un revêtement à base de cystéine, comme détaillé dans le protocole du fabricant.
    2. Préparez le substrat ECM pour qu’il agisse comme une membrane basale au fond du puits.
      REMARQUE : Les substrats ECM comme le collagène ou la laminine peuvent être choisis en fonction des besoins de la lignée cellulaire endothéliale du cerveau. Ici, nous utilisons du collagène pour une lignée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales humaines (hCMVEC).
    3. Préparez 1 μg/cm2 de collagène en queue de rat I dissous dans 0,02 M d’acide acétique dans une auge fraîche et stérile (100 μL par puits). Laissez le collagène pendant 1 h à faible luminosité dans le capot stérile, puis lavez-le soigneusement 2x avec de l’eau déminéralisée et un pipetage soigneux.
      REMARQUE : Assurez-vous que la plus grande partie de l’eau déminéralisée est éliminée aussi soigneusement que possible après le dernier lavage et laissez sécher la plaque dans la hotte. Il est recommandé d’utiliser la plaque peu de temps après le revêtement ; cependant, il peut être stocké temporairement dans l’eau à 4 °C (moins d’une semaine). La plaque est maintenant prête à l’emploi.
  3. Préparation des cellules endothéliales cérébrales pour l’ensemencement sur la plaque du biocapteur à 96 puits
    REMARQUE : Il est recommandé d’optimiser d’abord la phase de croissance et la densité d’ensemencement de la lignée cellulaire endothéliale à utiliser. La ligne hCMVEC a été utilisée dans ce protocole, qui prend 48 h pour atteindre la confluence après l’ensemencement à 20 000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits.
    1. Récoltez les cellules endothéliales du cerveau dans un capuchon stérile à l’aide d’un réactif de dissociation doux et effectuez un comptage précis des cellules. Utilisez 20 000 hCMVEC dans 100 μL de milieu par puits pour une phase de croissance régulière pendant 48 h. Préparez les cellules endothéliales cérébrales en excès pour assurer un pipetage optimal des 96 puits.
      REMARQUE : Par conséquent, pour une plaque à 96 puits, environ 2 000 000 de cellules dans 10 mL de milieu préchauffé sont nécessaires.
    2. Transférez les cellules endothéliales cérébrales dans une auge stérile fraîche et, à l’aide d’une pipette multicanaux, ajoutez soigneusement 100 μL (20 000 cellules) de la suspension cellulaire par puits. Remettez les cellules en suspension doucement dans l’auge régulièrement pour éviter que les cellules endothéliales ne se stabilisent avec le temps. Assurez-vous qu'1 puits n’a que du milieu et aucune cellule pour permettre la modélisation mathématique (puits sans cellule) et que la plaque entière est ensemencée en 30 s.
  4. Démarrage de l’expérience
    1. Fixez soigneusement la plaque à l’adaptateur dans l’incubateur en déplaçant les clips rouges de chaque côté de l’adaptateur de plaque vers l’extérieur. Alignez le puits A1 de la plaque avec la région A1 de l’adaptateur. Maintenez doucement la plaque en place avec une main sur le dessus et remettez les clips rouges en place avec l’autre main.
      REMARQUE : Assurez-vous que la plaque est stable dans l’adaptateur.
    2. Fermez l’incubateur et appuyez à nouveau sur Configuration . Recherchez les puits verts sur la carte des plaques indiquant les puits correctement détectés. Tous les puits rouges ont une erreur de connexion. Pour résoudre ce problème, rattachez rapidement la plaque,
      REMARQUE : Un temps excessif passé à essayer de réparer des puits avec de mauvaises connexions peut compromettre la santé des cellules.
    3. Appuyez sur Vérifier pour revérifier les pièces jointes en tant que lectures d’impédance absolue. Cela prendra plusieurs minutes.
    4. Appuyez sur la flèche sous la carte des plaques pour vous assurer que le bon catalogue de plaques est sélectionné. Dans ce cas, il s’agit de 96w20idf.
    5. Appuyez sur le bouton multifréquence pour vous assurer que l’impédance est mesurée à plusieurs fréquences AC afin de permettre une modélisation mathématique future.
    6. Appuyez sur Démarrer pour commencer l’expérience. Laisser les cellules proliférer pendant ~48 h et former leur monocouche typique de haute résistance, mesurée par une augmentation des ohms.
  5. Traiter les cellules endothéliales cérébrales avec des cellules cancéreuses ou des cytokines sur la plaque à 96 puits
    REMARQUE : Comme la plaque à 96 puits permet de tester simultanément plusieurs stimuli, préparez une carte de plaque claire avec les options de traitement souhaitées (Figure supplémentaire S1-bottom). Chaque traitement peut et doit être effectué Au moins en trois exemplaires (trois puits répliqués) pour permettre des analyses statistiques ; cependant, quatre répétitions sont montrées dans Figure supplémentaire S1.
    1. À 48 h, vérifiez la croissance des cellules endothéliales du cerveau. Assurez-vous d’atteindre un plateau avant de préparer des solutions de traitement.
      REMARQUE : Différentes lignées cellulaires endothéliales peuvent prendre des durées différentes pour atteindre un plateau. Par conséquent, leur phase de croissance et leur densité de semis doivent être optimisées avant de réaliser cette expérience. Les puits devraient généralement plafonner dans la même heure. Si ce n’est pas le cas, ils peuvent être compromis ou pipetés de manière inexacte et ne doivent pas être inclus.
    2. Pour le traitement par cytokines, préparez des concentrations appropriées de cytokines dans des milieux complets préchauffés avec leur véhicule et leurs milieux de contrôle pertinents.
      1. Préparez les cytokines à 2 fois la concentration finale souhaitée car elles seront diluées 1:1 lorsqu’elles seront ajoutées à chaque puits contenant des cellules endothéliales cérébrales.
      2. Pour permettre à chaque traitement d’être effectué en trois exemplaires, préparer toutes les cytokines dans plus de 300 μL de volume total (c’est-à-dire au moins 350 μL au total), pour l’ajout de 100 μL par puits.
    3. Pour le traitement avec des cellules, prélevez les cellules (trois lignées cellulaires de mélanome dérivées de patients différentes utilisées dans ce protocole) avec un réactif de dissociation doux et effectuez un comptage précis des cellules. Effectuer des traitements cellulaires à des ratios effecteur :cible supérieurs (rapports E :T) de 1:1 où les cellules de traitement sont les cellules effectrices (par exemple, les cellules de mélanome) et les cellules endothéliales cérébrales sont les cellules cibles, c’est-à-dire ajouter 20 000 cellules de mélanome à 20 000 cellules endothéliales cérébrales par puits.
      1. Dilué en série pour des rapports E :T plus petits de 1:10 ou 1:100 si nécessaire. Pour permettre le traitement dans des puits en trois exemplaires, comptez les cellules et préparez-les dans plus de 300 μL de volume total (c’est-à-dire au moins 350 μL au total) pour l’ajout de 100 μL par puits.
    4. Étiquetez les tubes en grappes de polypropylène de 1,1 mL, qui se présentent sous forme de bandes de 8 tubes (c.-à-d. des tubes de bandes de 1 mL), conformément à la carte des plaques à 96 puits (figure supplémentaire S1-Haut). Insérez les tubes à bandelettes dans les plaques de tubes à bandelettes et autoclavez-les avant l’expérience. Ajoutez le volume total de cytokines ou de cellules de traitement (c.-à-d. 350 μL de traitement) dans les tubes de bandelettes stériles et laissez-les dans l’incubateur pour les garder au chaud.
    5. Sur le logiciel, appuyez sur Pause pour mettre l’expérience en pause. Cette opération peut prendre quelques secondes. Une fois en pause, ouvrez l’incubateur et déclipsez soigneusement les deux clips rouges d’une main tout en stabilisant la plaque de l’autre main. Gardez l’expérience en pause et amenez la plaque vers le capot stérile.
    6. Retirez les tubes de la bande de traitement de l’incubateur. À l’aide d’une pipette multicanaux, remettre soigneusement en suspension le contenu des tubes de bandelettes de traitement, puis ajouter 100 μL de traitement des tubes de bandelettes aux puits appropriés sur la plaque de 96 puits sans toucher le fond du puits. Ajoutez soigneusement le traitement à tous les puits et milieux uniquement au puits acellulaire et complétez cette étape en moins de 5 minutes pour une plaque complète de 96 puits, car un refroidissement excessif affectera la résistance de la monocouche endothéliale.
    7. Remettez la plaque traitée dans la machine, fixez-la comme vous l’avez fait précédemment, puis vérifiez à nouveau les connexions des électrodes à l’adaptateur en appuyant sur Configuration | Vérifier.
    8. Assurez-vous que les paramètres corrects de catalogue de plaques et d’acquisition multifréquence sont sélectionnés, puis appuyez sur Reprendre pour reprendre l’expérience. Laissez l’expérience progresser et exécutez-la jusqu’au point final souhaité.
    9. Appuyez sur Terminer pour terminer l’expérience, qui enregistre automatiquement le fichier abp. enregistré. Accédez à Fichier | Exporter les données pour récupérer ce fichier au format xls. ou csv. pour des analyses plus approfondies.

2. Utilisation de cellZscope pour surveiller les modifications de l’intégrité de la barrière endothéliale cérébrale en réponse à divers traitements

  1. Préparation des composants métalliques, de l’adaptateur et de l’insert de membrane poreuse de l’appareil
    1. Nettoyez les composants métalliques séquentiellement avec de l’eau déminéralisée, puis de l’éthanol à 70 %, puis de l’eau désionisée à nouveau.
    2. Autoclavez l’électrode inférieure ou les « pots » et les électrodes de trempage supérieure et stérilisez tous les autres composants du module de cellule avec de l’éthanol à 70%.
    3. Dans une hotte stérile, installez les 24 électrodes/"pots » inférieurs en les vissant dans le module de cellule, en prenant soin de maintenir la stérilité partout.
    4. Ajouter 900 μL de milieu de base dans les puits.
      REMARQUE : Le milieu de base est ajouté au puits inférieur, qui agit comme le compartiment basal de l’endothélium. Il est recommandé de ne pas utiliser de sérum dans ce compartiment pour reproduire de manière plus fiable l’environnement basal de l’endothélium cérébral.
    5. Connectez magnétiquement les électrodes de trempage au couvercle du module de cellule et fermez le couvercle au-dessus des puits afin que les électrodes de trempage s’insèrent dans les pots d’électrodes inférieurs.
    6. Fixez le module cellulaire à l’adaptateur dans un incubateur et laissez-le pendant au moins 1 h pour équilibrer. À ce stade, ouvrez le logiciel pour charger la carte de plaque expérimentale sous l’onglet Mise en page , intégrant ainsi la carte de plaque de traitement dans les fichiers, qui contiendront finalement les données.
    7. Lorsqu’un revêtement est nécessaire, enrobez les inserts de membrane dans un capuchon stérile en utilisant une plaque de culture stérile à 24 puits pour maintenir les inserts et en ajoutant le substrat ECM (p. ex., collagène) à la section interne du puits, comme indiqué à la section 1.2.3 Utilisez une pipette monocanal pour charger soigneusement le substrat ECM dans chaque puits.
  2. Préparation des cellules endothéliales cérébrales pour l’ensemencement sur l’insert membranaire et le démarrage de l’expérience
    1. Récoltez et comptez les cellules endothéliales cérébrales conformément à la section 1.3, mais préparez le titrage final requis dans un tube à centrifuger de 50 ml. Assurez-vous que les cellules récoltées sont dans un milieu chaud complet, y compris tous les facteurs de croissance requis et le sérum.
    2. À l’aide d’une pipette monocanal, ensemencez soigneusement les cellules endothéliales cérébrales (80 000 dans ce protocole) dans la chambre apicale d’un puits inséré dans 350 μL de milieu complet.
    3. Inclure un puits sans cellule en pipetant le milieu complet uniquement dans l’un des inserts.
    4. Retirez le module cellulaire de l’incubateur et placez-le dans le capot stérile. Transférez les inserts préparés dans les pots d’électrodes inférieurs à l’aide d’une pince à épiler pour ne manipuler que les supports supérieurs de l’insert. Évitez la formation de bulles sous la membrane.
    5. Replacez le module cellulaire dans l’incubateur sur l’adaptateur.
    6. Dans le logiciel, dans l’onglet expérience , sous la section Spectre , sélectionnez Démarrer à 1 Hz et Arrêter à 100 kHz pour acquérir des données sur toute la gamme de fréquences ; Sélectionnez Étapes fines .
    7. Sous Temps d’attente, sélectionnez 15 min pour autoriser les mesures continues à la vitesse la plus rapide effectuée par le logiciel.
    8. Appuyez sur Start pour commencer l’expérience et permettre aux cellules endothéliales cérébrales de proliférer et de former une monocouche à haute résistance. Cette étape dure environ 48 h.
  3. Traiter les cellules endothéliales cérébrales avec des cellules cancéreuses et des cytokines sur les inserts membranaires
    1. À 48 h, préparer les cytokines ou les cellules de traitement (p. ex. cellules de mélanome) conformément à la section 1.5, y compris la numération des cellules le cas échéant, et prélever dans des tubes de 1 mL ou l’équivalent.
    2. Préparer le traitement à des concentrations correctes pour ajouter 70 μL dans chaque puits (encer). Placez les soins dans l’incubateur pour les garder au chaud.
    3. Comme l’instrument effectue des mesures toutes les 15 minutes, choisissez une durée de traitement qui commence immédiatement après la fin d’une mesure. À ce moment, retirez le module cellulaire de l’incubateur et essuyez-le doucement avec de l’éthanol à 70 % à l’aide de lingettes non pelucheuses.
    4. Dans une hotte stérile, ouvrez le module cellulaire et pipetez soigneusement 70 μL du traitement dans la chambre apicale de l’insert respectif. Faites-le à l’aide d’une pipette monocanal et ajoutez un mouvement circulaire, en évitant les bulles. Effectuez cette étape en moins de 10 minutes pour remettre le module de cellule dans l’adaptateur avant le début de la mesure suivante.
    5. Appuyez sur Stop pour mettre fin à l’expérience. Exportez les données directement au format xls. sous le fichier Fichier | Nommez et enregistrez ce fichier de manière appropriée après l’avoir ouvert.

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Résultats

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Interprétation des données d’impédance ECIS

Comprendre les conditions expérimentales optimales
Les données peuvent y être visualisées directement à l’aide du logiciel (figure 2A) ou exportées à des fins d’analyse et de traçage graphique (figure 2B). La figure 2A montre un exemple de données affichées sur l’interface logicielle réelle. Le graphique de gauche mont...

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Discussion

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Les études thérapeutiques sur les maladies qui affectent la BHE doivent tenir compte de l’importance de l’intégrité et de la régulation de la barrière endothéliale cérébrale. Par exemple, la rupture de la barrière endothéliale cérébrale est étudiée de manière critique dans les métastases du cancer au cerveau à partir d’autres sites anatomiques. En effet, l’endothélium cérébral forme la première barrière contre les cellules tumorales circulantes. Comme mentionné précédemment dans l’introduction, les études in vitro

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

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Akshata Anchan a été financée par la Fondation neurologique de Nouvelle-Zélande pour la bourse Gillespie (référence de la subvention : 1628-GS) et la première bourse (référence de la subvention : 2021 FFE). Le coût de la recherche a également été partiellement financé par la bourse de la Fondation neurologique-2021 FFE et le Fonds de développement de la recherche de la faculté de l’Université d’Auckland. James Hucklesby a été financé par une bourse de la Fondation de recherche médicale d’Auckland. Merci à l’équipe de Baguley et au centre de recherche de l’Auckland Cancer Society pour les lignées cellulaires de mélanome néo-zélandais NZM dérivées de patients.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
aMEMGibco12561072Mélanome cellule de base cellulaire Cellule multimédia
Zscope arraynanoAnalyticscellZscope2 ; logiciel v4.3.1Réseau de biocapteurs de mesure TER
Collagen I&mdash ; queue de ratGibcoA1048301substrat ECM pour l’enrobage
dibutyryl-cAMPSigma-AldrichD0627Supplément de milieu endothélial cérébral
ECIS array  ; Biophysique appliquéeECIS Z&Theta ;; logiciel v1.2.163.0Réseau de biocapteurs de mesure Rb/Alpha
Plaque ECIS  ; Biophysique appliquée96W20idf  ;Plaque de biocapteur à 96 puits
FBSSigma-Aldrich12203C-500ML
GlutaMAXGibco305050-061Supplément de média endothélial cérébral
hCMVECApplied Biological MaterialsT0259Lignée cellulaire endothéliale cérébrale
hEGFPeproTechPTAF10015100Supplément de média endothélial cérébral
HéparineSigma-AldrichH-3393Cerveau Supplément de milieux endothéliales
hFGFPeproTechPTAF10018B50Supplément de milieux endothéliales cérébraux
HydrocortisonSigma-AldrichH0888Supplément de milieux endothéliales cérébraux
IL-1&beta ;PeproTech200-01BCytokine
Insuline-Transferrine-Sélénite sodiqueSigma-Aldrich11074547001Supplément de milieu cellulaire de mélanome
M199Gibco11150-067Milieu de base de cellules endothéliales cérébrales
Eau MilliQ Eaudéminéralisée
PBS 1xGibco10010-023
TNF&alpha ;PeproTech300-01ACytokine
Insert TranswellCorningCLS3464Insert à membrane poreuse
TrypLE Express EnzymeGibco12604021Réactif de dissociation
du

Références

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Blood Brain BarrierBrain Endothelial CellsImpedance Based BiosensorsBarrier IntegrityCancer Cell InteractionCytokine TreatmentElectric Cell Substrate ImpedanceCellZscope InstrumentTransendothelial Electrical ResistanceEndothelial Monolayer

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