Capture de l’agitation basée sur le cytosquelette du noyau de l’ovocyte de souris à travers les échelles spatiales

Résumé

Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter l’impact physique du cytosquelette sur la forme nucléaire et les organites internes sans membrane dans le système ovocytaire de la souris. Le cadre peut être adapté pour être utilisé dans d’autres types de cellules et contextes.

Résumé

Un défi majeur pour comprendre les causes de l’infertilité féminine est d’élucider les mécanismes régissant le développement des cellules germinales féminines, appelées ovocytes. Leur développement est marqué par la croissance cellulaire et les divisions ultérieures, deux phases critiques qui préparent l’ovocyte à la fusion avec le spermatozoïde pour initier l’embryogenèse. Au cours de la croissance, les ovocytes réorganisent leur cytoplasme pour positionner le noyau au centre de la cellule, un événement prédictif du développement réussi des ovocytes chez la souris et l’homme et, par conséquent, de leur potentiel embryogénique. Chez les ovocytes de souris, il a été démontré que cette réorganisation cytoplasmique est entraînée par le cytosquelette, dont l’activité génère des forces mécaniques qui agitent, repositionnent et pénètrent dans le noyau. Par conséquent, cette transmission de force cytoplasmique-nucléoplasmique ajuste la dynamique des organites de traitement de l’ARN nucléaire connus sous le nom de condensats biomoléculaires. Ce protocole fournit un cadre expérimental pour documenter, avec une haute résolution temporelle, l’impact du cytosquelette sur le noyau à travers les échelles spatiales dans les ovocytes de souris. Il détaille les étapes et les outils d’imagerie et d’analyse d’images nécessaires pour évaluer i) l’activité cytosquelettique dans le cytoplasme de l’ovocyte, ii) l’agitation du noyau ovocytaire par le cytosquelette, et iii) ses effets sur la dynamique biomoléculaire des condensats dans le nucléoplasme de l’ovocyte. Au-delà de la biologie des ovocytes, les méthodes élaborées ici peuvent être adaptées pour être utilisées dans les cellules somatiques afin d’aborder de la même manière l’ajustement de la dynamique nucléaire basé sur le cytosquelette à toutes les échelles.

Introduction

Le positionnement nucléaire est essentiel pour de multiples fonctions cellulaires et développementales 1,2,3,4,5. Les cellules germinales femelles de mammifères appelées ovocytes remodèlent leur cytoplasme pour positionner le noyau au centre de la cellule malgré une division asymétrique de la taille, qui repose sur un décentrage chromosomique ultérieur⁶ (Figure 1). Ce centrage du noyau prédit le développement réussi des ovocytes chez la souris et l’homme ^7,8, et donc leur potentiel embryogénique (Figure 1).

Le remodelage cytoplasmique dans les ovocytes de souris est principalement piloté par le cytosquelette d’actomyosine⁹ (Figure 2). Son activité génère des forces mécaniques qui agitent, repositionnent et pénètrent dans le noyau¹⁰ (Figure 2). Par conséquent, cette transmission de force cytoplasmique-nucléoplasmique ajuste la dynamique des organites de traitement de l’ARN messager nucléaire appelés mouchetures^{nucléaires 11}, l’un des nombreux organites sans membrane dans le noyau connus sous le nom de condensats biomoléculaires 12,13,14,15,16 (Figure 2).

L’imagerie en direct a été décisive pour déchiffrer les implications fonctionnelles de l’agitation nucléaire. Des films de migration nucléaire sur des heures, ainsi que des films à haute résolution temporelle du maillage d’actine et du cytoplasme massif, ont largement contribué à l’élaboration d’un modèle théorique de positionnement nucléaire, reliant différentes échelles de temps⁹. De plus, des films à haute résolution temporelle du cytoplasme, du contour nucléaire et des composants nucléaires tels que la chromatine et les condensats nucléaires, ont mis en évidence le rôle de l’agitation du noyau basée sur le cytosquelette sur le traitement de l’ARN et l’expression des gènes dans les ovocytes de souris, reliant différentes échelles spatio-temporelles au sein de la cellule^10,11. Dans l’ensemble, une telle approche de croisement d’échelle basée sur l’imagerie en direct a fourni la première justification reliant l’agitation cytosquelettique du noyau au succès du développement des ovocytes.

Le protocole fournit le pipeline d’imagerie et d’analyse d’images utilisé pour étudier la transmission des forces cytoplasmiques (générées principalement par l’actine F et en partie par les microtubules) au noyau et à ses composants internes dans les ovocytes de souris. Le résultat de ces expériences est de capturer le continuum des forces à travers les échelles spatiales, du cytosquelette dans le cytoplasme à l’intérieur du nucléaire via des films à haute résolution temporelle comme le montrent deux études récentes^10,11, qui ont établi le lien entre les mouvements actifs cytoplasmiques, les fluctuations du contour nucléaire, ainsi que le mouvement et les fluctuations de surface d’un seul type de condensats biomoléculaires nucléaires : mouchetures nucléaires. La même approche peut être appliquée à d’autres systèmes modèles où les forces cytoplasmiques sont censées changer, comme dans le contexte des cellules cancéreuses malignes¹⁷.

Protocole

Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives de la Communauté européenne et ont été approuvées par le ministère français de l’Agriculture (autorisation n° 75-1170) et par la Direction générale de la recherche et de l’innovation (DGRI ; Numéro d’accord OGM DUO-5291). Les souris ont été hébergées dans l’animalerie selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures, avec une température ambiante de 22 à 24 °C et une humidité de 40 % à 50 %. Les souris utilisées ici comprennent la femelle OF1 (Oncins France 1, âgée de 8 à 12 semaines) et la femelle C57BL/6 (âgée de 10 à 14 semaines).

1. Prélèvement et préparation des ovocytes

1. Prélever des ovocytes de souris âgées de 8 à 14 semaines comme décrit en¹⁸ et¹⁹.
   1. En bref, extraire d’abord les ovaires de souris comme dans¹⁸ dans un milieu préchauffé (37 °C) M2+Albumine sérique bovine (BSA) complété par 1 μM de milrinone¹⁹, qui empêche la reprise de la méiose dans les ovocytes.
   2. Perforer les follicules ovariens avec des aiguilles chirurgicales pour libérer les ovocytes en croissance des follicules antraux (fin de croissance des ovocytes²⁰).
   3. Prélever les ovocytes de la taille nécessaire aux expériences (ovocytes en croissance et/ou adultes) avec une micropipette spécialisée dans le prélèvement d’ovocytes, avant de les laver et de les mettre dans des plats avec un milieu frais sous huile minérale.
2. Dissocier mécaniquement les ovocytes des cellules folliculaires antrales en les pipetant de haut en bas et les laisser se stabiliser pendant 1 h dans l’incubateur à 37 °C avant de passer aux étapes expérimentales suivantes.
   REMARQUE : Les ovocytes sont maintenus à 37 °C pendant toutes les étapes expérimentales. Pour ce protocole, les plus gros ovocytes, qui sont les plus adultes, ont été collectés.

2. Microinjection d’ovocytes

REMARQUE : Pour capturer l’activité basée sur le cytosquelette dans le cytoplasme, l’imagerie en direct en fond clair est utilisée. La micro-injection de marqueurs fluorescents n’est donc pas nécessaire, et le protocole peut être repris à l’étape 3. Pour imager le contour nucléaire, Rango, une sonde affichant l’étiquette YFP à son extrémité N et une étiquette CFP à son extrémité C^21,22, a été utilisée. Lorsqu’il est imagé dans les ovocytes à 488 nm, il marque l’ensemble du noyau, à l’exception du nucléole²³, et présente un contour nucléaire très net. Pour visualiser les taches nucléaires, SRSF2-GFP (NM_011358), un marqueur des taches nucléaires¹¹, a été utilisé. Le même milieu est utilisé pour la collecte d’ovocytes, la microinjection, la traduction complémentaire de l’ARN et l’imagerie de cellules vivantes.

1. Linéariser le plasmide de Rango avec le plasmide SfiI ou SRSF2-GFP avec les enzymes de restriction AgeI.
2. Synthétiser les ARN complémentaires (ARNc) coiffés avec le kit de transcription in vitro approprié en fonction du promoteur (T3 pour Rango et T7 pour SRSF2-GFP) et les purifier à l’aide d’un kit de purification en colonne, comme décrit précédemment²⁴.
   REMARQUE : ARN polyadénylate SRSF2-GFP utilisant un kit de polyadénylation pour augmenter la stabilité de l’ARNc. Deux promoteurs différents sont utilisés en raison des différences dans le squelette plasmidique.
3. Mesurez les concentrations d’ARNc à l’aide d’un spectrophotomètre microvolume.
4. Diluer l’ARNc de Rango à 1000 ng/μL et l’ARNc SRSF2-GFP à 600 ng/μL dans dH₂O.
5. Centrifuger l’aliquote de l’ARNc à 4 °C pendant au moins 60 min à 25 000 x g avant la microinjection.
6. Injecter des ARNc codant pour YFP-Rango ou SRSF2-GFP comme décrit en^11,25 dans le cytoplasme d’ovocytes dans un milieu à 37 °C M2+ BSA+Milrinone à l’aide d’un micro-injecteur.
7. Incuber les ovocytes pendant au moins 2 h dans un milieu de culture à 37 °C pour la traduction de l’ARNc.
8. Déposer les ovocytes dans de petites gouttelettes de milieu de culture (5 μL) sur une boîte de culture tissulaire de 35 mm avec fond en verre recouvert d’huile minérale. Placez un ovocyte par gouttelette pour éviter le photoblanchiment des ovocytes voisins.

3. Imagerie de cellules vivantes

NOTE : Des ovocytes de souris vivantes ont été examinés à l’aide d’un microscope confocal inversé équipé d’un objectif à immersion dans l’huile Plan-APO 40x/1.25 NA, d’un plateau de balayage motorisé, d’une chambre d’incubation (37 °C), d’une caméra CCD couplée à une roue à filtres et d’un disque rotatif. Les images à haute résolution temporelle sont acquises à l’aide de Metamorph (ci-après dénommé logiciel d’imagerie) en mode d’acquisition de flux.

1. Ouvrez la fenêtre Acquérir du logiciel de création d’images.
2. Réglez le temps d’exposition sur 500 ms, la zone de la caméra sur la puce complète et le binning sur 1.
3. Dans l’onglet Acquérir , définissez l’éclairage pour le canal requis. Pour imager l’activité cytoplasmique, illuminez les ovocytes avec de la lumière transmise. Pour imager le noyau marqué avec YFP-Rango ou SRSF2-GFP, éclairer des ovocytes avec une longueur d’onde d’excitation de 491 nm.
4. Pour les expériences d’agitation cytoplasmique ou YFP-Rango, concentrez-vous sur le nucléole de l’ovocyte qui peut être facilement observé en lumière transmise (Figure 3A). Un seul avion sera acquis. Pour les expériences sur le chatoiement nucléaire, concentrez-vous sur les gouttelettes SRSF2-GFP (Figure 3C).
5. Dans l’onglet Spécial , définissez les paramètres afin d’optimiser la vitesse d’acquisition comme ci-dessous.
   Obturateur de l’appareil photo : ouvert pour l’exposition
   Mode clair : CLEAR PRESEQUENCE
6. Ouvrez la fenêtre Acquisition de flux du logiciel d’imagerie. Définissez les paramètres de streaming en fonction de l’expérience. Pour les deux études^10,11, utilisez les paramètres décrits ci-dessous.
   1. Dans l’onglet Acquérir , définissez les paramètres suivants.
      Mode d’acquisition : Diffuser vers la RAM
      Nombre d’images : 480 (peut être réduit à 240 images pour réduire le temps d’imagerie)
      Paramètres de la caméra : Acquisition d’images à une fréquence d’images
      Nombre (Nb) d’images à sauter : 0
   2. Dans l’onglet Paramètres du contrôleur de l’appareil photo numérique , définissez les paramètres suivants.
      État de la caméra : HALT
      Mode d’obturation : OUVERT JAMAIS
      Mode clair : CLEAR PRESEQUENCE
      Nb d’images en moyenne : 1
      REMARQUE 1 : En mode Stream, une fois le temps d’exposition réglé, la durée de la vidéo est déterminée par le nombre d’images. Par exemple, un temps d’exposition de 500 ms et 480 images génèrent une vidéo de 4 min. Un aperçu peut être affiché lors de l’acquisition de l’image.
7. Ajustez une zone d’intérêt autour de l’objet. Minimiser la zone du ROI réduit le temps d’acquisition.
8. Cliquez sur Acquérir dans la fenêtre Acquisition de flux pour lancer le film.
9. Enregistrez le film en tant que fichier .tif à la fin de l’acquisition.
   REMARQUE : Pour suivre les structures nucléaires pendant les films à haute résolution temporelle, les sondes nucléaires (YFP-Rango et SRSF2-GFP) doivent avoir un rapport signal/bruit élevé pour faciliter la segmentation des objets lors des étapes ultérieures de l’analyse de l’image. Les profils d’expression exogènes de SRSF2-GFP devraient être comparables à ceux des immunomarquages endogènes de chatoiement nucléaire (figure 3C-D). Les changements dans les profils d’expression de SRSF2-GFP par rapport à la coloration endogène peuvent refléter de fortes doses d’injection et de traduction d’ARNc²⁶ (Figure 3C-D).

4. Analyse d’images : agitation cytoplasmique

NOTE : L’agitation cytoplasmique qui reflète l’intensité de l’activité cytosquelettique à base d’actine dans les ovocytes est déterminée par des analyses de corrélation d’images à l’aide d’un logiciel issu d’une publication précédente du laboratoire⁹ et disponible le²⁷. Le logiciel mesure la quantité d’intensités de pixels conservées entre des images consécutives. Le résultat est la perte de corrélation entre les images dans le temps, commençant à 1 et diminuant exponentiellement avec le temps, comme dans⁹.

1. Alignez des images time-lapse brutes (Δt=0,5 s) à l’aide du plugin Fiji StackReg (Plugins>StackReg). Pour installer le plugin StackReg²⁸, activez le site de mise à jour^{BIG-EPFL 29} pour accéder au plugin.
2. Calculez les corrélations d’images en fond clair dans 3 à 4 régions cytoplasmiques de ~300 μm² en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Recadrez les régions et enregistrez-les en tant que fichiers vidéo séparés. Ouvrez la fenêtre Terminal.
   2. Tapez ovocyte, appuyez sur la barre d’espace , puis appuyez sur Entrée. Une fenêtre appelée Signal et emplacement s’affiche. Choisissez les fichiers vidéo recadrés qui seront analysés.
      REMARQUE : Plusieurs films peuvent être sélectionnés en même temps.
3. L’application renvoie les fichiers dans le même dossier que les films. Trois fichiers différents avec des extensions .csv, .eps et .xls sont générés. Le fichier .xls contient les données permettant de dessiner les tracés de corrélation pour une région. Valeurs moyennes de corrélation de différentes régions d’une cellule.
4. Pour des raisons de clarté visuelle, transformez les valeurs de corrélation finales en soustrayant la valeur de chaque point temporel de 1 pour obtenir une courbe exponentielle inversée comme dans ¹¹.

5. Analyse d’images : cartes vectorielles cytoplasmiques

REMARQUE : Les cartes vectorielles cytoplasmiques d’ovocytes de souris ont été générées par le plugin Spatiotemporal Image Correlation Spectroscopy (STICS)³⁰ précédemment implémenté pour détecter les flux cytoplasmiques dans les ovocytes^{de souris 31} sur Fiji ³² et disponible sur ³³. Les cartes montrent l’amplitude et la direction de la vitesse du flux cytoplasmique, comme dans⁹ et¹¹.

1. Convertissez des images en fond clair (Δt=0,5 s) au format 32 bits.
2. Réalignez les images avec le plug-in Fiji StackReg dans Plugins > StackReg et choisissez Transformation de corps rigide .
3. Avec la pile de plugins soustraire la moyenne mobile jru v2 (dans les outils Detrend de la suite de plugins STICS), débarrassez-vous des structures stationnaires dans le film en soustrayant l’image moyennée dans le temps du film. Cochez les cases Soustraire la moyenne statique et la sous-pile de sortie, sélectionnez Conserver la moyenne spatiale et définissez la période sur 5.
4. Dessinez un ROI autour de l’ovocyte, en excluant le cortex pour éviter les effets de bordure du plugin.
5. Lancez le plugin STICS map jru V2 (dans les outils ICS), avec une taille de sous-région de 32 pixels, une taille de pas de 16 pixels, un décalage temporel STICS de 3, des décalages X et Y de 0, un multiplicateur de vitesse de 8, un seuil de magnitude de 0 et des cases à cocher Normaliser la longueur du vecteur, Vecteurs centraux, Vitesses de sortie et Utiliser un masque vidéo.
   NOTE : Le plugin génère une carte de l’ovocyte au format .tif, affichant les flux cytoplasmiques sous forme de vecteurs avec des couleurs indiquant les amplitudes d’écoulement, comme dans⁹ et¹¹, et un fichier excel avec les vitesses d’écoulement mesurées.

6. Analyse d’images : fluctuations du contour nucléaire

NOTE : Les fluctuations du contour nucléaire qui reflètent l’agitation de la membrane nucléaire peuvent être déterminées à partir de films de noyaux marqués avec YFP-Rango (Figure 4A,C). L’analyse d’images pour les fluctuations du contour nucléaire nécessite Fiji et l’installation des plugins StackReg (permettre au site de mise à jour^{BIG-EPFL 29} d’accéder au plugin StackReg), PureDenoise³⁴ et Ovocyte_nucleus. Le plugin StackReg effectue le repérage des images pour corriger un éventuel mouvement global. Le plugin PureDenoise supprime le bruit des images multidimensionnelles corrompues par le bruit mixte de Poisson-Gaussienne et lisse le contour nucléaire. Le plugin Ovocyte_nucleus seuil le signal et comble le trou correspondant au nucléole afin de créer un masque de noyau binaire, de le réaligner avec StackRreg et de calculer la distance r du centroïde du masque de noyau à la circonférence du masque pour tous les angles θ (θ° de 0° à 360° par incrément de 1°), comme dans la figure 4. Tous les codes de ces plugins se trouvent à ³⁵.

1. Sur Fidji, dans le menu Plugins > CIRB > Verlhac , sélectionnez Forme du noyau ovocytaire.
2. Dans la boîte de dialogue, effectuez la sélection suivante.
   1. Sélectionnez le dossier contenant les films à analyser.
   2. Sélectionnez l’angle θ (une valeur de 1° à 360° peut être choisie et une valeur de 1° a été utilisée pour une résolution optimale du contour), les marges de recadrage (5 μm est recommandé afin de conserver l’ensemble du noyau).
   3. Sélectionnez l’étalonnage XY et l’intervalle de temps. Cliquez sur OK.
      REMARQUE : les résultats sont fournis sous forme de fichiers .xls dans un dossier de sortie dans le dossier contenant les films d’origine. Ce fichier affiche tous les rayons mesurés pour chaque temps t et chaque angle θ. Un exemple de fichier de sortie est fourni dans le tableau supplémentaire 1. Le dossier de sortie contient également un film du masque du noyau.
3. À l’aide d’une feuille de calcul, calculez le rayon moyen R sur tous les points temporels t pour chaque angle θ défini. Cela permet de tracer la forme moyenne dans le temps (Figure 4B). Voir l’exemple dans le tableau supplémentaire 2.
4. Pour chaque t et θ, soustrayez le rayon moyen R au fil du temps du rayon r. La variance (r-R)² est une mesure des fluctuations de l’enveloppe nucléaire.
5. Calculez la moyenne des fluctuations pour tous les points temporels t et tous les angles θ pour chaque noyau et éventuellement pour tous les noyaux à partir d’une condition.
   NOTE : Lorsque la forme des noyaux est considérablement modifiée, comme dans le cas d’un cytosquelette perturbé, les noyaux marqués avec YFP-Rango sont tournés sur Fiji pour orienter la partie lisse vers le haut et l’invagination vers le bas, avant de procéder à l’analyse des fluctuations du contour nucléaire, comme dans la^{section 10}.

7. Analyse d’images : mouvements de chatoiement nucléaire (dynamique diffusive)

NOTE : L’analyse du mouvement du chatoiement nucléaire permet de déduire le type de dynamique (entraînée, diffusive ou confinée) de ces organites à partir de leurs traces.

1. Sélectionnez des images en mode flux d’ovocytes exprimant des gouttelettes SRSF2-GFP qui se déplacent principalement dans l’axe X-Y.
2. Correction du blanchiment des images en accéléré d’ovocytes exprimant SRSF2-GFP à l’aide de la méthode d’appariement d’histogramme aux Fidji (Image > Adjust > Bleach Correction).
3. Réalignez les images avec le plugin Fiji StackReg.
4. Suivez les centres de gouttelettes SRSF2-GFP à l’aide du plug-in Fiji Manual Tracking (Plugins > Tracking > Manual Tracking). Appuyez sur Ajouter une piste pour démarrer le suivi et appuyez sur Terminer la piste lorsque vous avez terminé. N’activez pas la correction de centrage.
5. Copiez les traces dans un fichier de feuille de calcul pour procéder aux calculs temporels des déplacements quadratiques moyens (MSD) comme dans ¹¹, et calculez les MSD temporels à partir de chaque trajectoire de gouttelettes de 20 s.
6. Ajuster les courbes (msd(t) = beta x t^α) avec la méthode de Nelder-Mead en utilisant le logiciel R pour estimer l’exposant de diffusion alpha (α).
7. Mesurer le coefficient de diffusion effectif pour pouvoir comparer les différentes conditions puisque la diffusion est censée être anormale (α< 1).
8. Calculer le coefficient de diffusion effectif D_eff à partir d’un ajustement linéaire (alpha=1) sur les 40 premiers points (20 s) de la courbe MSD temporelle et normaliser par la taille des gouttelettes (D_eff en μm²/s x 3/2 πr en μm).

8. Analyse d’images : Fluctuations de surface des mouchetures nucléaires

NOTE : L’évolution du contour du chatoiement nucléaire dans le temps, une lecture de la transmission de la force active sur ces organites, a été mesurée avec un plug-in personnalisé Radioak³⁶ pour une utilisation aux Fidji et disponible sur³⁷. Le plugin extrait les valeurs des rayons d’une sélection donnée pour tous les angles autour du centre de sélection. La variation de forme dans le temps a été mesurée en comparant la valeur du rayon par rapport à sa valeur moyenne pour chaque angle. Le plugin permet de quantifier les fluctuations de forme et offre une option pour visualiser ces dynamiques. Pour l’installer, téléchargez le fichier Radioak_.jar et placez-le dans le dossier plugins de Fidji. Redémarrez Fidji. Ce plugin est une version mise à jour du plugin utilisé pour analyser les fluctuations des contours nucléaires ci-dessus et implémenter un pipeline comparable.

1. Dans les films en flux de gouttelettes SRSF2-GFP, sélectionnez des gouttelettes plus grosses de tailles comparables (rayon ~2,5 μm).
   REMARQUE : Si les gouttelettes sont trop petites, une résolution insuffisante entraînera des mesures de fluctuation de surface aberrantes.
2. Recadrez des images en accéléré de gouttelettes sur une période de 15 s (Δt = 0,5 s) en dessinant un rectangle autour de la gouttelette et sélectionnez Image > Recadrage (Figure 5).
3. Réalignez les images avec le plug-in Fiji StackReg dans Plug-ins > StackReg et choisissez Transformation de corps rigide .
4. Lisser l’image pour supprimer le bruit autour de la gouttelette à l’aide de l’option Fiji Smoothen sous Traiter.
5. Créez un masque binaire de droplet à l’aide de l’option Convertir en masque aux Fidji sous Traiter > binaire. Utilisez la méthode par défaut et Dark pour l’arrière-plan (Figure 5).
6. Analysez le masque de gouttelettes binaires généré à l’aide de l’option Analyser les particules dans Fidji sous Analyser, sélectionnez les options Effacer les résultats et Ajouter au gestionnaire et enregistrez la région d’intérêt (ROI) dans le RoiManager (Plus > Enregistrer) au format zip pour être lu par Radioak. Les ROI doivent être enregistrés dans un dossier appelé contours dans le même dossier que les films, dans des fichiers appelés imagename_UnetCortex.zip pour chaque film à retrouver par Radioak.
7. Dans le menu Fiji Plugins > CIRB > Radioak , sélectionnez Obtenir des rayons pour traiter un seul film ou Faire un dossier pour analyser tous les films du même dossier.
   REMARQUE : Une fenêtre s’ouvre pour sélectionner le numéro d’angle et l’échelle. Radioak a été lancé avec des incréments d’angle de 1° de 0° à 360° (entrée de 360) et les valeurs de rayon ont été extraites.
8. Sélectionnez le film ou le dossier contenant les films à analyser. Les résultats sont fournis sous forme de fichiers .xls (un pour chaque film) dans un répertoire radioakres dans le dossier contenant les films originaux. Chaque fichier affiche tous les rayons mesurés r (en μm si le paramètre d’échelle a été rempli) pour chaque temps t (en tranche) et chaque angle (en radians ; Graphique 5 ; voir exemple de .xls production dans le tableau supplémentaire 3).
9. Dans la feuille de calcul, calculez le rayon moyen R sur tous les points temporels t pour chaque angle défini (voir l’exemple dans le tableau supplémentaire 4). Cela permet de tracer la forme moyenne dans le temps.
10. Tracer la variance (r-R)² en μm² qui correspond à la mesure des fluctuations de surface des gouttelettes.

Résultats

Les panneaux d’images de la figure 3 montrent des exemples d’ovocytes adultes typiques (figure 3A), le nucléoplasme d’un ovocyte adulte exprimant YFP-Rango (figure 3B), le nucléoplasme d’un ovocyte adulte exprimant une valeur correcte (panneau de gauche ; Figure 3C) ou un excessif (panneau de droite ; Figure 3C) dose d’ARNc SRSF2-GFP et une immunocoloration des taches nucléaires dans un ovocyte adulte à l’aide de l’anticorps SC35 (Figure 3D). La dose correcte d’ARNc SRSF2-GFP à micro-injecter a été définie sur la base de comparaisons visuelles entre les profils d’expression de SRSF2-GFP avec les profils endogènes de mouchetures nucléaires.

Les forces d’agitation cytoplasmique dans les ovocytes, comme le montrent des travaux antérieurs du laboratoire utilisant des cartes vectorielles STICS et une analyse de corrélation d’images (voir⁹ et¹¹), peuvent être diminuées par des perturbations cytosquelettiques, à la fois génétiques (par exemple, souris mutante FMN2) et chimiques (par exemple, cytochalasine D). Les cartes STICS des ovocytes témoins affichent de nombreux vecteurs, les couleurs indiquant des vitesses d’écoulement élevées, tandis que les cartes des ovocytes avec des forces cytosquelettiques perturbées affichent moins de vecteurs, les couleurs indiquant de faibles vitesses d’écoulement. De même, la corrélation d’images est perdue très rapidement dans les ovocytes témoins par rapport aux ovocytes avec des forces cytosquelettiques perturbées. Ceci est observable sur les courbes de corrélation, avec une diminution plus rapide de la courbe pour les ovocytes témoins par rapport aux ovocytes avec des forces cytosquelettiques perturbées⁹ ou une augmentation plus rapide lorsque la courbe est inversée¹¹.

Les forces du cytosquelette agitent le noyau et ses organites internes, en particulier les condensats nucléaires comme les taches nucléaires ^10,11. Sur la figure 4A, le noyau des ovocytes témoins est soumis à d’importantes fluctuations périphériques, ce qui est visible à l’aide de la sonde nucléaire YFP-Rango. La forme du noyau dans les ovocytes avec des forces cytosquelettiques perturbées est stable dans le temps (Figure 4C). L’analyse des fluctuations du contour nucléaire est essentielle pour quantifier précisément l’agitation. En déterminant la variance de la distance entre le centroïde du noyau et sa périphérie, (r-R)² (Figure 4B), les fluctuations ont pu être quantifiées, montrant que l’agitation nucléaire est 6 fois plus élevée dans les ovocytes témoins que dans les ovocytes avec des forces cytosquelettiques perturbées¹⁰. Dans la figure 5A-B, les taches nucléaires (gouttelettes SRSF2-GFP⁺) sont montrées dans des contextes de contrôle et de perturbation des forces cytoplasmiques à haute résolution temporelle. Chez les témoins, la surface des gouttelettes fluctue beaucoup plus que les surfaces des gouttelettes dans les ovocytes avec des forces cytoplasmiques perturbées, ce qui peut être visualisé et quantifié à l’aide du plugin Radioak³². Visuellement, les couleurs vert et rouge (sortie Radioak vue sur les images du bas de la figure 5A-B) indiquent les angles où le plugin a détecté des changements de surface entre des images consécutives et le blanc indique un manque de changements de surface.

Figure 1 : Illustration de l’ovogenèse tardive et de l’embryogenèse précoce de la souris. Illustration du centrage du noyau qui se produit à la fin de la croissance des ovocytes, du décentrement des chromosomes qui se produit pendant la division des ovocytes et des étapes précoces (stades 1 cellule et 2 cellules) de l’embryogenèse. Les génomes femelles (noyau ovocytaire et pronoyau femelle) sont en rose, le pronoyau mâle est en bleu. Les noyaux embryonnaires (après fusion des génomes parentaux) sont violets. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Illustration du remodelage cytoplasmique et nucléaire à travers les échelles dans des ovocytes de souris en croissance. Cette figure résume les principales conclusions de ^9,10,11. Illustration du remodelage du cytoplasme à base d’actomyosine, de l’agitation nucléaire et du remodelage fonctionnel des condensats biomoléculaires nucléaires à travers les échelles spatio-temporelles. Le remodelage à l’échelle des chatoiements nucléaires améliore les réactions biomoléculaires associées à leur fonction (c’est-à-dire l’épissage du pré-ARNm). Notez que ce protocole permet d’évaluer l’agitation nucléaire uniquement à travers les échelles spatiales mais pas temporelles, puisque toutes les images sont effectuées avec la même résolution temporelle de 0,5 s entre les images d’image. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Exemples d’images de l’ovocyte adulte et du nucléoplasme. (A) Image en fond clair d’un ovocyte adulte montrant la chromatine (cyan) qui entoure le nucléole. Un cercle blanc pointillé délimite le noyau. (B) Noyau ovocytaire vivant exprimant YFP-Rango ; notez l’absence de fluorescence dans le nucléole. (C) Exemple de noyau d’ovocyte vivant exprimant SRSF2-GFP après micro-injection de doses correctes d’ARNc (panneau de gauche) ou de fortes doses d’ARNc (panneau de droite) ; Notez les phases condensées (gouttelettes) et dissoutes à gauche et leur absence dans l’état à droite. (D) Immunocoloration du chatoiement nucléaire dans un ovocyte fixe ; notez le profil d’expression endogène qui est comparable à celui de C (panneau de gauche). Barres d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Sorties du plug-in de contrôle et fluctuations du contour nucléaire perturbé. (A) Time-lapse d’un noyau d’ovocyte témoin exprimant YFP-Rango (en haut) et son masque binaire correspondant généré par le plug-in Ovocyte_nucleus (en bas). (B) Principe du nucléaire : contour, fluctuations, mesures dans le temps et dans une direction donnée. Les directions sont définies par un angle de rotation θ de 1° incrémenté de 0° à 360°. Deux formes représentatives à t=0 s (jaune) et t=135 s (violet) sont représentées. La forme bleue correspond à la forme moyenne dans le temps. (C) Fluctuations du contour nucléaire d’un noyau dans un ovocyte avec des forces cytosquelettiques réduites en raison de la perturbation de l’actine F (souris mutante FMN2) et des microtubules (traitement au nocodazole ; comme dans¹⁰). Barres d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Sorties du plug-in des fluctuations de surface des gouttelettes de contrôle et perturbées. (A) Recadrage d’une gouttelette nucléaire de contrôle SRSF2-GFP imagée à 500 ms par image et montrée dans la table de recherche de glace (LUT) (en haut) ; masque binaire de la même gouttelette générée par Fidji (au centre) ; et Radioak sort après analyse des fluctuations de surface de la gouttelette (en bas), le vert et le rouge indiquant les angles où le plugin a détecté des changements de surface entre des images consécutives et le blanc indiquant une absence de changements de surface. (B) Fluctuations de surface d’une gouttelette nucléaire dans les ovocytes avec des forces cytosquelettiques réduites en raison de la perturbation de l’actine F et des microtubules (comme dans¹¹). Barres d’échelle = 5 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire 1 : Exemple de sortie d’analyse de Ovocyte_nucleus plugin. Le même noyau analysé que celui de la figure 4A. Thêta (θ) est l’angle en degrés et t1 à t600 correspondent au numéro de cadre, qui peut être converti dans le temps. Les rayons sont en μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Exemple de feuille de calcul utilisée pour calculer les fluctuations du contour nucléaire. Le même noyau analysé que celui de la figure 4A. Thêta (θ) est l’angle en degrés et t1 à t600 correspondent au numéro de cadre, qui peut être converti dans le temps. Tab Brut et moyen : Les rayons sont en μm. Tab r-R : Les distances r-R sont en μm. Tableau (r-R)² : Les valeurs de fluctuation sont exprimées en μm². Les tabulations x et y correspondent aux coordonnées cartésiennes des rayons de l’onglet Brut et moyenne. Ils permettent de dessiner la forme moyenne du noyau au fil du temps dans l’onglet forme moyenne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 3 : Exemple de sortie d’analyse du plugin Radioak. La même gouttelette analysée que celle de la figure 5A. Les rayons mesurés à des moments et des angles distincts sont indiqués. Les rayons sont en μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 4 : Exemple de feuille de calcul utilisée pour calculer les fluctuations de surface des gouttelettes nucléaires. La même gouttelette analysée que celle de la figure 5A. Thêta (θ) est l’angle en degrés et t1 à t600 correspondent au numéro de cadre, qui peut être converti dans le temps. Tab Brut et moyen : Les rayons sont en μm. Tab r-R : Les distances r-R sont en μm. Tableau (r-R)² : Les valeurs de fluctuation sont exprimées en μm². Les onglets x et y correspondent aux coordonnées cartésiennes des rayons de l’onglet Brut et moyenne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les étapes clés de ce protocole comprennent une micro-injection appropriée d’ovocytes sans affecter leur survie ou leur fonction normale ^9,10,11, ainsi que la micro-injection de quantités prédéfinies d’ARNc qui permettraient une visualisation correcte des structures pertinentes, comme les taches nucléaires.

Établir le lien entre la dynamique cytoplasmique et la dynamique (intra)nucléaire est essentiel pour étudier comment le cytosquelette agite le noyau ou son intérieur. Ce protocole, avec de légères modifications, permet de le faire en corrélant les intensités d’agitation cytoplasmique à la dynamique des gouttelettes nucléaires YFP-Rango ou SRSF2-GFP (comme dans¹¹). Pour continuer, les ovocytes doivent d’abord être filmés pendant 120 s en mode fond clair pour capturer l’agitation cytoplasmique, avant d’être immédiatement filmés pendant 120 s avec un laser de 491 nm pour capturer le contour nucléaire ou la dynamique des gouttelettes. Dans le cas de gouttelettes nucléaires SRSF2-GFP, la corrélation peut simplement être évaluée en comparant leurs coefficients de diffusion effectifs (voir étape 7 de ce protocole) aux valeurs d’intensité maximale inversée de l’agitation cytoplasmique obtenues à l’aide d’analyses de corrélation d’images (voir étape 4 de ce protocole). Un autre point important est la taille des condensats choisis pour l’analyse des fluctuations de surface des gouttelettes. Des gouttelettes d’un diamètre similaire doivent être sélectionnées pour les analyses comparatives afin d’éviter les biais, car la taille module l’intensité des fluctuations de surface.

Il existe certaines limites pour ce protocole. Les analyses des fluctuations du contour nucléaire reposent sur une coloration intranucléaire complète, telle que YFP-Rango ou NLS-GFP. Pour les analyses sur les chatoiements nucléaires, la micro-injection de quantités excessives d’ARNc SRSF2-GFP peut entraîner des altérations apparentes des propriétés de séparation de phase de ce marqueur de condensat (figure 3C), comme d’autres l’ont déjà examiné²⁶. Il est donc essentiel de vérifier que les profils d’expression des protéines exogènes sont comparables aux profils endogènes. De plus, les gouttelettes relativement petites (rayon de <2 μm) doivent être exclues des pipelines d’analyse des fluctuations de surface en raison des limites de la résolution spatiale avec les outils définis ici. Ce problème de résolution peut généralement être résolu par l’utilisation de microscopes plus résolutifs qui, par exemple, pourraient être nécessaires pour sonder les fluctuations de surface de condensats plus petits dans le noyau de l’ovocyte ou dans le noyau nettement plus petit des cellules somatiques.

Dans l’ensemble, ce protocole permet de capturer l’agitation du noyau de l’ovocyte de souris à travers les échelles à base d’actine et de cytosquelette des microtubules. Plus précisément, il permet de documenter la mobilisation du cytoplasme basée sur le cytosquelette, les fluctuations du contour nucléaire, ainsi que les déplacements de chatoiement nucléaire de type liquide et les fluctuations de surface. Bien que certaines études sur d’autres types de cellules abordent certaines de ces questions 38,39,40 via des protocoles distincts de complexité variable à des échelles spatiales individuelles, ce protocole simple fournit pour la première fois les outils nécessaires pour aborder la dynamique cellulaire mentionnée à plusieurs échelles dans un seul pipeline de travail. De plus, les données générées par cette approche, lorsqu’elles sont complétées par une modélisation biophysique comme en^10,11, permettent une évaluation peu invasive de : i) changements dans la mécanique nucléaire¹⁰ ; ii) la transmission des forces actives basées sur le cytosquelette dans le cytoplasme aux condensats du noyau¹¹ ; et iii) la dissipation de cette énergie active à travers différents compartiments cellulaires^10,11. Il est important de noter que ce protocole est polyvalent, car il peut être adapté non seulement à d’autres condensats nucléaires comme le nucléole²³, mais aussi à d’autres types de cellules comme les cellules cancéreuses, où des changements dans les comportements du cytosquelette et des condensats nucléaires ont été documentés ^17,41.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Albumine sérique bovine (BSA)	Sigma  ;	A3311
CSU-X1-M1 Disque rotatif	Yokogawa
DMI6000B microscope  ;	Leica
Femtojet	Eppendorf
Fiji
Roue à filtres	Sutter Instruments Roper Scientific
Fluorodish	World Precision Instruments	FD35-100
Metamorph software  ;	Imagerie universelle,  ;		version 7.7.9.0
Huile minérale	Sigma Aldrich	M8410-1L
NanoDrop 2000  ;	Souris Thermo Scientific
OF1 et C57BL/6	Charles River Laboratories
Poly(A) Kit de résidus  ;	Thermo Fisher	AM1350
Retiga 3	QImaging
RNAeasy kit  ;	Qiagen	74104
SC35	Abcam	ab11826	Anticorps anti-chatoiement nucléaire ; souris IgG1 anti-SRSF2/SC35 (1:400)
SRSF2-GFP plasmide  ;	; OriGene Technologies	MG202528	Micropipette NM_011358
Stripper	; XLAB Solutions		spécialisées pour le prélèvement d’ovocytes
T3 mMessage mMachine	Thermo Fisher	AM1384  ;
T7 mMessage mMachine  ;	Thermo Fisher	AM13344
Chambre thermostatique	Life Imaging Service
Windows Excel	Windows