Ici, nous décrivons les étapes nécessaires à l’établissement d’un modèle EVLP chez le rat et montrons le profil inflammatoire associé aux poumons perfusés. L’objectif est de propager les connaissances et les expériences sur le modèle EVLP du rat, permettant la compréhension intégrale des réponses biologiques associées à cette technique révolutionnaire.
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Article de méthode
Etablissement d’un modèle de rat de perfusion pulmonaire ex vivo pour des connaissances translationnelles en transplantation pulmonaire
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Depuis la mise en place de la transplantation pulmonaire comme stratégie thérapeutique pour les maladies pulmonaires avancées, la communauté scientifique est confrontée au problème d’un faible nombre de poumons considérés comme viables pour le processus de don. Au cours des dernières décennies, cependant, ce scénario a été positivement modifié, compte tenu du développement de la perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) comme stratégie d’évaluation et de reconditionnement des poumons marginaux. La mise en place de l’EVLP dans les grands centres de transplantation a favorisé une augmentation du nombre de greffes pulmonaires, à la fois en augmentant la précision diagnostique de la fonction pulmonaire et en constituant une plateforme efficace pour le reconditionnement des greffes pulmonaires. Dans ce contexte, face à des enjeux éthiques et logistiques, ainsi que dans l’étude des facteurs immunologiques associés à la transplantation pulmonaire, le développement de modèles EVLP de rongeurs est devenu important, compte tenu de leur fiabilité, de la possibilité de manipulation génétique et de la baisse des coûts. Cet article décrit un protocole pour établir un modèle EVLP chez le rat et montre le profil inflammatoire associé aux poumons perfusés. Cela aidera à propager les connaissances sur le modèle EVLP du rat, favorisant ainsi notre compréhension des réponses biologiques associées à cette technique révolutionnaire.
Introduction
La transplantation pulmonaire a été reconnue comme une stratégie thérapeutique pour les maladies en phase terminale avec des améliorations dans les méthodes chirurgicales et l’immunosuppression au cours des dernières décennies. Malgré la forte demande, le nombre de donneurs de poumons décédés acceptables est inférieur à celui des autres organes solides, ce qui converge vers le nombre plus faible de greffes de poumons effectuées 1,2,3. Pour remédier à la pénurie de donneurs, la communauté médicale a élargi les critères de don de poumons, transformant des organes auparavant considérés comme non viables en organes potentiels pour la transplantation. Cependant, les critères élargis nécessitent des efforts différents pour une meilleure compréhension et une meilleure intervention compte tenu des conséquences systémiques possibles provenant de l’organe donné. La perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) est apparue comme une technique qui permet la préservation normothermique des poumons, l’évaluation des fonctions pulmonaires et le reconditionnement des poumons auparavant considérés comme irréalisables pour le processus de don 4,5,6.
Compte tenu du nombre croissant de transplantations pulmonaires depuis la mise en place de l’EVLP dans les grands centres de transplantation, les stratégies de préservation et de réparation des poumons sont de plus en plus étudiées. En ce sens, face aux enjeux éthiques et logistiques, ainsi qu’à l’étude des facteurs immunologiques associés à la transplantation pulmonaire, le développement de modèles EVLP de rongeurs est devenu important, compte tenu de leur fiabilité, de la possibilité de manipulation génétique et de la réduction des coûts 7,8,9. Ici, nous décrivons les étapes nécessaires pour établir un modèle EVLP chez le rat et montrons le profil inflammatoire associé aux poumons perfusés.
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Protocole
Les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément au protocole d’utilisation des animaux approuvé par le Comité de protection des animaux du Réseau universitaire de santé. Des rats Lewis mâles (255-330 g) ont eu accès ad libitum à de la nourriture et à de l’eau. Ensuite, ils ont été maintenus dans un environnement contrôlé (18-22 °C) avec un cycle jour-nuit de 12 h. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, solutions et instruments utilisés dans ce protocole.
1. Initialisation du système de perfusion pulmonaire ex vivo
- Assurez-vous que toutes les sondes sont connectées à l’organe de perfusion isolé et au système d’acquisition de données (Figure 1). Ensuite, ouvrez le logiciel d’acquisition de données.
- Avant la perfusion, remplissez le circuit EVLP avec 150 ml de solution de Steen complétée par 1 000 unités USP d’héparine sodique, 50 mg de céfazoline et 50 mg de méthylprednisolone.
- Réglez le bain d’eau chaude à 20 °C. Commencez à faire circuler de l’eau tiède pour réchauffer l’ensemble du système EVLP.
2. Procédure d’acquisition de poumons de donneur
- Anesthésier le rat par une injection intrapéritonéale de kétamine (50 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg) ou selon la pratique locale. Confirmez la bonne profondeur de l’anesthésie en vérifiant le réflexe de pincement des orteils.
- Effectuer une intubation orotrachéale (cathéter intraveineux de 14 G). Après l’intubation, connectez le tube trachéal au système de ventilation pour petits animaux. Aérer le rat avec un volume courant de 10 mL/kg, une fréquence de 60 respirations/min, une fraction d’oxygène inspiré (FiO2) de 0,5 et une pression expiratoire positive (PEP) de 2 cmH2O.
- Placez le rat en position couchée.
- À l’aide de ciseaux et de pinces appropriés, entrez dans la cavité péritonéale et effectuez l’incision par voie crânienne, en effectuant une laparotomie médiane et en injectant de l’héparine sodique (400 unités USP) dans la veine porte.
- Par la suite, entrez dans la cavité thoracique par le processus xyphoïde. Réalisez la sternotomie avec la résection crânienne du sternum et l’ouverture radiale prudente du diaphragme, afin de ne pas endommager le poumon.
- Pour récupérer le bloc cardiaque et pulmonaire, faites une incision dans la veine cave inférieure (VCI) et le long de l’apex du cœur gauche.
- À l’aide de micro-ciseaux, effectuez une incision antérieure dans la voie d’éjection ventriculaire droite. Ensuite, insérez un cathéter intraveineux de 18 G dans le tronc pulmonaire et rincez les poumons avec 20 ml de solution de dextran à faible teneur en potassium (LPD) contenant 10 μg/mL de prostaglandine E1.
- Immédiatement après le rinçage, clampez le tiers inférieur de la trachée à la fin de l’inspiration pour préserver les poumons dans un état gonflé.
- Récoltez le bloc cardiaque et pulmonaire et placez-le dans une solution LPD pour le stockage.
REMARQUE : Le greffon pulmonaire peut être stocké à des températures et à différents intervalles de temps en fonction de l’objectif de la recherche. Ici, nous montrons des résultats représentatifs de poumons qui ont subi des durées variables de temps ischémique à froid (CIT) sur glace.
3. Procédure de perfusion pulmonaire ex vivo
- Placez une ligature de soie 0 sous l’artère pulmonaire principale (AP) et autour des ventricules, et attachée pour faciliter la canulation.
- Connectez la canule PA dans la conduite d’entrée du système EVLP et démarrez la pompe péristaltique avec 10 % de débit de maintenance, permettant l’évacuation de tout air dans la canule PA.
- Placez et fixez la canule d’entrée dans le PA principal (OD : 2,0 mm / Diamètre de la tête : 2,5 mm), puis la canule de drainage de l’apex du cœur dans l’oreillette gauche (diamètre de la tête LA : 4,0 mm) à travers la valve mitrale pour une perfusion ultérieure. Utilisez des pinces pour dilater la valve mitrale, facilitant ainsi la canulation.
- Faites un petit trou dans la trachée et insérez la canule trachéale (OD : 2,0 mm/L : 14 mm). Ensuite, connectez-le à la conduite de ventilation du système.
- Connectez la canule LA à la conduite d’évacuation du système.
- REMARQUE : Nous fixons 10 % du flux de maintenance comme début de la perfusion. Pour éviter l’insertion de bulles d’air dans les poumons, assurez-vous que le piège à bulles est rempli.
- Augmentez progressivement le débit de perfusion pour atteindre 20 % du débit cardiaque (CO).
REMARQUE : Pour perfuser les deux poumons, nous avons utilisé une dose de CO estimée à 75 mL/min pour des rats de 250 g10,11. Le débit de perfusion a été progressivement augmenté jusqu’à 1 h pour atteindre le débit cible selon notre protocole clinique EVLP12. Les paramètres de perfusion sont résumés dans le tableau 113. - Retirer la pince trachéale 20 minutes après le début de la perfusion et commencer la ventilation pulmonaire suivie du démarrage du débit de gaz EVLP (8 % CO2, 6 % O2, 86 % N2) pour maintenir le perfusat PCO2 entrant entre 35 et 45 mmHg.
REMARQUE : Les paramètres de ventilation sont résumés dans le tableau 113.
4. Paramètres et gestion des échantillons
- Toutes les heures pendant l’EVLP, enregistrez en temps réel la compliance pulmonaire dynamique et la résistance vasculaire pulmonaire (PVR).
REMARQUE : À 5 minutes avant les évaluations physiologiques, les poumons doivent être dilatés à une pression de gonflage. - Prélever des échantillons de perfusat dans l’orifice d’échantillonnage toutes les heures et les congeler dans de l’azote liquide pour des analyses plus approfondies.
REMARQUE : De plus, nous effectuons une manœuvre de recrutement (jusqu’à 20 cmH2O) 5 min avant l’évaluation, après quoi nous prélevons des perfusats pour des analyses de gaz sanguins afin de mesurer le pH, le PCO2, le PO2, les électrolytes, le glucose et le lactate. - Arrêtez la perfusion et clampez la trachée pour maintenir les poumons dans un état gonflé. Par la suite, isolez des échantillons de poumons et congelez-les dans de l’azote liquide ou placez-les dans des solutions de fixation pour des études ultérieures.
REMARQUE : Ici, les poumons ont été perfusés pendant 4 h.
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Résultats
Tous les poumons avec une CIT allant de 20 min à 18 h ont pu être perfusés pendant 4 h (Figure 2)13. L’observance était stable dans la plupart des groupes, à l’exception de l’IT de 18 h, qui a progressivement diminué au cours de la période de perfusion de 4 h (Figure 2A). Malgré cela, aucune différence significative n’a été observée dans la résistance vasculaire, l’oxygénation du greffon pulmonaire et les...
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Discussion
Cette étude a décrit les étapes nécessaires à l’établissement d’un protocole EVLP pour le rat. Ici, nous montrons que les poumons du donneur peuvent être perfusés pendant 4 h après une conservation statique à froid jusqu’à 18 h à 4 °C. Cela a été démontré en évaluant la compliance pulmonaire, la résistance vasculaire pulmonaire, la concentration de glucose/lactate perfusé et le rapport P/F.
L’essor de la plateforme EVLP en tant qu’outil important dans l’évalu...
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Déclarations de divulgation
MC est actionnaire de Traferox Technologies Inc. et consultant pour Lung Bioengineering Inc. MC reçoit un soutien à la recherche de Beyond Air Inc. et de Synklino. Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas eu d’intérêts concurrents qui auraient pu influencer le résultat rapporté dans cet article.
Remerciements
La figure 1 a été créée avec BioRender.com (confirmation des droits de publication et de licence [Contrat : BT25KGSKWF]).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ; 14 g de cathéter intraveineux | BD | 381167 | ; Intubation orotrachéale |
| 16 g de cathéter intraveineux | BD | 381157 | Cathéter pour rincer le poumon |
| 2-0 Suture Sofsilk | Covidien | S-305 | ; Fixation du tube trachéal |
| Suture 3-0 Sofsilk | Covidien | S303 | ; Fixation des canules artérielles et auriculaires |
| Système IPL-2 Core Isolated Crated Perfused Poumon pour le Rat | Appareil de Harvard | 734276 | Système de perfusion pulmonaire ex vivo (EVLP) |
| Kétamine (Narketan) | Vetoquinol | 440894 | Sédation/anesthésie |
| Grande canule de l’artère pulmonaire ; | Appareil de Harvard | 73-0711 | |
| Canule auriculaire gauche ; | Appareil de Harvard | 73-0712 | |
| Solution de glucose de dextrane à faible taux de potassium (Perfadex) | XVIVO | 19811 | Solution de préservation |
| Méthylprednisolone succinate de sodium (SOLU-MEDROL) | Pfizer | 14705 | Anti-inflammatoire |
| Prostaglandine E1 (Prostin VR) | Pfizer | RX297945 | |
| Ventilateur pour petits animaux (Modèle 683) | Appareil de Harvard | 55-0000 | |
| Héparine sodium | Leo Pharma | 453811 | |
| Steen Solution | XVIVO | 19004 | Solution extracellulaire tampon pour perfuser les poumons pendant l’EVLP |
| Sugita Aneur clip curv | Mizuho | 07-940-86 | Pince trachéale |
| Canule trachéale ; | Appareil de Harvard | 73-3384 | |
| Xylazine (Rompun) | Bayer Healthcare & nbsp ; | 2169592 | Sédation/anesthésie |
Références
- Chambers, D. C., et al. The International Thoracic Organ Transplant Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: Thirty-eighth adult lung transplantation report — 2021; Focus on recipient characteristics. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 40 (10), 1060-1072 (2021).
- Meyer, K. C. Recent advances in lung transplantation. F1000Research. 7, 1684(2018).
- Valapour, M., et al. OPTN/SRTR 2018 Annual Data Report: Lung. American Journal of Transplantation. 20, 427-508 (2020).
- Chaney, J., Suzuki, Y., Cantu, E., van Berkel, V. Lung donor selection criteria. Journal of thoracic disease. 6 (8), 1032-1038 (2014).
- Watanabe, T., Cypel, M., Keshavjee, S. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 13 (11), 6602-6617 (2021).
- Saddoughi, S. A., Cypel, M. Expanding the lung donor pool. Clinics in Chest Medicine. 44 (1), 77-83 (2023).
- Wang, A., Ali, A., Keshavjee, S., Liu, M., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion for donor lung assessment and repair: a review of translational interspecies models. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (6), L932-L940 (2020).
- Noda, K., Philips, B. J., Atale, N., Sanchez, P. G. Endothelial protection in lung grafts through heparanase inhibition during ex vivo lung perfusion in rats. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 42 (6), 697-706 (2023).
- Nelson, K., et al. Method of isolated ex vivo lung perfusion in a rat model: lessons learned from developing a rat EVLP program. Journal of Visualized Experiments. (96), (2015).
- Malik, A. B., Kaplan, J. E., Saba, T. M. Reference sample method for cardiac output and regional blood flow determinations in the rat. Journal of Applied Physiology. 40 (3), 472-475 (1976).
- Noda, K., et al. Successful prolonged ex vivo lung perfusion for graft preservation in rats. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 45 (3), e54-e60 (2014).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Ohsumi, A., et al. A method for translational rat ex vivo lung perfusion experimentation. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 319 (1), L61-L70 (2020).
- Soares, P. R. O., et al. Comparison between perfadex and locally manufactured low-potassium dextran solution for pulmonary preservation in an ex vivo isolated lung perfusion model. Transplantation Proceedings. 43 (1), 84-88 (2011).
- Pêgo-Fernandes, P. M., et al. Experimental model of isolated lung perfusion in rats: first Brazilian experience using the IL-2 isolated perfused rat or guinea pig lung system. Transplantation Proceedings. 42 (2), 444-447 (2010).
- Yamanashi, K., et al. Reduction of donor mononuclear phagocytes with clodronate-liposome during ex lung perfusion attenuates ischemia-reperfusion injury. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 165 (4), e181-e203 (2023).
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Réimpressions et autorisations
