Ce protocole décrit l’établissement d’un modèle tridimensionnel (3D) ex vivo de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. Le modèle fournit une plate-forme pour élucider les mécanismes pro-tumoraux dans la niche adipeuse et pour tester de nouvelles thérapies.
Article de méthode
Un modèle ex vivo de métastases péritonéales du cancer de l’ovaire à l’aide d’un épiploon humain
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le cancer de l’ovaire est la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle. L’épiploon joue un rôle clé en fournissant un microenvironnement favorable aux cellules cancéreuses de l’ovaire métastatiques ainsi que des signaux immunomodulateurs qui permettent la tolérance tumorale. Cependant, nous disposons de modèles limités qui imitent étroitement l’interaction entre les cellules cancéreuses de l’ovaire et les tissus riches en tissu adipeux. Pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’épiploon fournit un microenvironnement pro-tumoral, nous avons développé un modèle 3D ex vivo unique de l’interaction cellule-épiploon cancéreux. À l’aide de l’épiploon humain, nous sommes en mesure de cultiver des cellules cancéreuses de l’ovaire dans ce microenvironnement riche en graisse et de surveiller les facteurs responsables de la croissance tumorale et de la régulation immunitaire. En plus de fournir une plate-forme pour l’étude de ce microenvironnement tumoral riche en graisse, le modèle fournit une excellente plate-forme pour le développement et l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques pour cibler les cellules cancéreuses métastatiques dans cette niche. Le modèle proposé est facile à générer, peu coûteux et applicable aux investigations translationnelles.
Introduction
Le cancer de l’ovaire est la tumeur maligne gynécologique la plus mortelle dans le monde1. Le risque de développer ce cancer au cours de la vie est d’environ 1 sur 70, l’âge médian du diagnostic étant de 63 ans2. Les tumeurs malignes primitives de l’ovaire sont classées histologiquement comme épithéliales ou non épithéliales. Les cancers épithéliaux de l’ovaire (COE) représentent plus de 90 % des tumeurs, et le sous-type le plus courant est le carcinome séreux de haut grade (HGSC), qui représente environ 70 à 80 % des COE. À l’heure actuelle, il n’existe aucune méthode de dépistage efficace pour détecter la maladie à un stade précoce. Ainsi, la plupart des patients sont diagnostiqués à un stade avancé (c’est-à-dire le stade III ou IV de la Fédération internationale de gynécologie et d’obstétrique [FIGO]) après que le cancer se soit propagé dans toute la cavité péritonéale2.
Le traitement de première ligne standard est la chirurgie cytoréductrice pour enlever toutes les maladies macroscopiques visibles, suivie d’une chimiothérapie adjuvante à base de platine pour détruire toute maladie microscopique résiduelle. Bien qu’il y ait eu de nombreux progrès dans le traitement du cancer de l’ovaire au cours des deux dernières décennies, environ 70 % des patientes atteintes d’une maladie avancée rechuteront dans les 3 ans suivant le traitement3. Compte tenu du mauvais pronostic global de ces patients, les efforts de recherche translationnelle en cours et à venir dans le cadre de l’EOC visent à identifier des biomarqueurs pour une détection précoce, à prévenir les métastases, à améliorer les thérapies actuelles pour échapper à la résistance et à développer de nouveaux traitements personnalisés contre le cancer.
Les métastases généralisées dans la cavité péritonéale et la chimiorésistance qui leur est associée sont deux des principales limites à l’amélioration du traitement des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire 4,5. L’épiploon, une structure graisseuse en forme de tablier qui pend de l’estomac au-dessus des intestins, est l’un des principaux sites de métastases du cancer de l’ovaire 6,7. En plus de sa fonction de barrière physique, il a été démontré que l’épiploon a des capacités régénératrices et angiogéniques et possède des activités immunitaires qui, ensemble, favorisent la vascularisation, accélèrent la cicatrisation des plaies et limitent l’infection8. Il contient une forte concentration de cellules souches qui peuvent se différencier en différents types de cellules et peuvent aider à réparer les tissus endommagés. L’épiploon peut s’enflammer en réponse à une blessure ou à une infection, ce qui déclenche la migration des cellules immunitaires vers le site de la blessure9. Ces cellules immunitaires libèrent des facteurs de croissance et d’autres molécules qui aident à favoriser la réparation et la régénération des tissus endommagés. Les cellules immunitaires, telles que les macrophages, les lymphocytes et les plasmocytes, localisées dans l’épiploon sont des structures connues sous le nom de « taches laiteuses », qui sont responsables de la détection et de l’attaque des agents pathogènes et de la régulation de l’immunité péritonéale. Il a également été démontré que l’épiploon joue un rôle dans l’induction de la tolérance immunitaire10, c’est-à-dire la capacité du système immunitaire à tolérer les auto-antigènes et à ne pas attaquer les tissus sains. Cependant, les mêmes activités liées au système immunitaire sont également impliquées dans les réponses pathologiques, telles que la croissance des tumeurs omentales, les métastases et l’échappement de la surveillance immunitaire 9,11. Des études antérieures de notre laboratoire et d’autres ont démontré un rôle unique et actif du microenvironnement adipeux dans l’inhibition des réponses immunitaires anti-tumorales et dans l’acquisition de la chimiorésistance12,13,14. Malheureusement, nous disposons de peu d’informations sur les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels l’épiploon fournit un microenvironnement pro-tumoral.
Pour mieux comprendre les interactions entre les cellules cancéreuses et l’épiploon, un système de culture 3D composé de cellules cancéreuses de l’ovaire humain et d’explants d’épiploon dérivés de patientes a été développé. Le protocole décrit ici représente un nouveau modèle ex vivo de carcinose péritonéale. Ce modèle imite la progression naturelle de la tumorigenèse du cancer de l’ovaire dans ce tissu riche en graisse. Le modèle proposé est facile à générer, peu coûteux et potentiellement applicable aux recherches translationnelles dans la recherche sur le cancer de l’ovaire.
Protocole
Le protocole de recherche suivant a été examiné et approuvé par le Wayne State University Institutional Review Board (IRB). Le consentement éclairé de tous les patients a été obtenu avant la chirurgie. La figure 1 illustre les trois étapes générales de ce protocole.
1. Préparation du tissu de l’épiploon humain
- Préparer les milieux de culture de l’épiploon (DMEM/F12 + 10 % de sérum de veau fœtal + 1 % de pénicilline-streptomycine) et les conserver à 4 °C. Aliquote 30 à 40 mL de ce milieu dans un tube conique stérile de 50 mL ou un récipient pour échantillon chirurgical.
- Obtenir des échantillons chirurgicaux provenant d’une biopsie omentale ou d’une chirurgie d’omentectomie. Immerger l’échantillon stérile dans un milieu de culture d’épiploon immédiatement après le retrait dans la salle d’opération. Si le flux de travail ne le permet pas, placez l’échantillon dans un milieu de culture d’épiploon dès que possible. Transférez l’échantillon en le plaçant sur de la glace et conservez-le à 4 °C jusqu’au traitement.
REMARQUE : La taille de l’échantillon d’épiploon retiré déterminera la quantité de tissu exploitable. - Traitez l’échantillon d’épiploon dans les 1 à 2 heures suivant le prélèvement à l’aide d’une hotte à flux laminaire. Assurez-vous que tous les matériaux et outils sont stériles ou stérilisés.
- Retirez l’épiploon du récipient de collecte et transférez-le dans une boîte de culture de 100 mm. Plongez l’échantillon dans 1x solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS) et lavez doucement l’échantillon pour éliminer tout caillot sanguin ou débris.
- Coupez le tissu en morceaux (0,5 cm x 0,5 cm ou 100-200 mg ; Graphique 2A) à l’aide de petits ciseaux chirurgicaux ou d’un scalpel de 10 à 15 mm. Utilisez de petites pinces chirurgicales pour aider à manipuler le tissu et éviter d’écraser l’épiploon. Si un dispositif énergétique a été utilisé pour retirer chirurgicalement l’échantillon d’épiploon, évitez d’utiliser le tissu déformé au bord scellé.
- Placer chaque morceau d’épiploon coupé dans les puits individuels d’une plaque de culture à 24 puits et remplir les puits avec 500 μL de milieu de culture d’épiploon ou jusqu’à un volume suffisant pour recouvrir l’épiploon sans permettre au morceau d’épiploon de flotter au-dessus du fond du puits (figure 2B).
- Conserver les morceaux d’épiploon dans des milieux de culture frais à 4 °C jusqu’au moment de l’injection.
2. Préparation des cellules cancéreuses de l’ovaire
- Cultiver des cellules cancéreuses de l’ovaire humain dans un flacon de culture de 75cm2 à 37 °C et 5 % de CO2 jusqu’à une confluence d’au moins 75 % le jour du prélèvement de l’épiploon.
REMARQUE : Ce protocole utilise des cellules cancéreuses de l’ovaire humaines OCSC1-F2 mCherry-positives précédemment décrites15,16,17,18. Il peut être modifié en n’importe quelle lignée cellulaire cancéreuse marquée avec un signal de fluorescence. - Préparez les cellules à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire immédiatement après le prélèvement de l’échantillon d’épiploon. Assurez-vous que tous les matériaux et outils sont stériles ou stérilisés.
- Ajouter 10 mL de PBS stérile 1x dans le flacon de culture et laver les cellules en balançant doucement le flacon. Retirez le 1x PBS, puis ajoutez 3 mL de trypsine-EDTA à 0,05 %.
- Basculez doucement le flacon de culture pour enrober toutes les cellules, puis placez le flacon dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO2) pendant 5 minutes maximum. Tapotez le flacon de culture pour détacher complètement les cellules, puis neutralisez la trypsine en ajoutant 3 mL de milieu de culture d’épiploon.
- Mélangez la suspension cellulaire par pipetage, puis transférez la suspension dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger la suspension pendant 5 min à 1 200 x g à 24 °C. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 6 mL de milieu de culture d’épiploon frais.
- Comptez les cellules à l’aide d’un hémacytomètre. Diluer la suspension cellulaire à au moins 100 000 cellules par 100-200 μL de suspension. Il s’agit du volume d’injection dans chaque morceau d’épiploon coupé.
- Transférez un nombre approprié de cellules dans un nouveau flacon de culture pour poursuivre le passage des cellules.
3. Injection de cellules cancéreuses de l’ovaire
- À l’aide d’une seringue de 1 ml, aspirer la suspension cellulaire, puis fixer une aiguille de 26 G. Ne tirez pas la suspension cellulaire à l’aide de l’aiguille, car cela pourrait fragmenter les cellules.
- Utilisez une petite pince chirurgicale pour ramasser un morceau d’épiploon coupé. Transférez l’épiploon dans une boîte stérile de travail séparée pour faciliter l’injection. Percez doucement l’épiploon avec la pointe de l’aiguille et injectez un petit volume de suspension cellulaire dans le tissu (Figure 2C).
- Répétez l’injection sur plusieurs zones de l’épiploon jusqu’à un volume total d’au moins 100 μL ou 100 000 cellules. Notez qu’une grande partie de la suspension cellulaire peut sembler s’accumuler autour de l’échantillon. S’il y a des doutes concernant la qualité de l’injection, répétez l’injection ou injectez un plus grand volume de suspension cellulaire dans l’échantillon.
- Remettez les échantillons d’épiploon injectés dans chaque puits d’une plaque de culture à 24 puits. Notez que le volume du milieu de culture de l’épiploon est à un niveau qui recouvre l’épiploon sans le laisser flotter. Manipulez délicatement l’assiette et placez-la dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO2).
- FACULTATIF : Utilisez Matrigel (matrice de membrane basale) pour suspendre le tissu de l’épiploon dans une matrice solide afin de faciliter l’injection et d’administrer une suspension cellulaire plus concentrée.
- Décongeler la matrice de la membrane basale à 4 °C et mélanger dans un rapport de 1 :1 avec un milieu de culture d’épiploon immédiatement avant l’utilisation. Conserver le mélange de matrice de membrane basale sur de la glace ou à 4 °C jusqu’à l’injection. Remplissez les puits vides avec suffisamment de mélange de matrice de membrane basale pour immerger un morceau coupé d’épiploon.
- Placer les échantillons dans le mélange de matrice membranaire basale, puis placer la plaque de culture à 24 puits dans un incubateur (37 °C et 5 % de CO2) pendant 20 min. Une fois le mélange solidifié, continuez avec l’injection comme décrit ci-dessus.
- Confirmez la réussite de l’injection à l’aide de l’imagerie par fluorescence. Assurez-vous qu’une traînée de signal fluorescent est visualisée aux sites d’injection (Figure 2D). Notez que le nombre réel de cellules attachées à l’épiploon après l’injection est imprévisible.
4. Co-culture de cellules cancéreuses de l’épiploon humain et de l’ovaire
- Changez de milieu toutes les 48 à 72 h en ajoutant 500 à 2000 μL de milieu de culture d’épiploon frais. Ne pas pipeter le milieu directement sur le tissu de l’épiploon, car cela pourrait déplacer les cellules cancéreuses. Notez que si la couleur du support devient jaune, changez le support.
REMARQUE : La fréquence des changements de milieu dépend du volume de milieu utilisé et de la trajectoire de croissance des cellules cancéreuses. Une fois que les cellules cancéreuses ont ensemencé l’épiploon, il n’est plus important de savoir si le morceau d’épiploon flotte ou non. - FACULTATIF : Si une matrice de membrane basale a été utilisée, la matrice sera généralement dissoute au moment du premier changement de milieu.
- Surveiller la croissance des tumeurs cancéreuses de l’ovaire à l’aide de l’imagerie fluorescente. La fréquence de l’imagerie est laissée à la discrétion de l’investigateur. Anticipez les signes de petites tumeurs d’environ 14 jours (Figure 3A-C). Les résultats peuvent varier en fonction de la qualité de l’injection.
- Mettez fin à l’expérience en fonction du point de terminaison de l’expérience.
REMARQUE : La croissance tumorale et l’intégrité du tissu de l’épiploon ont été observées après 50 jours.
Résultats
L’établissement réussi de cellules cancéreuses de l’ovaire dans les échantillons d’épiploon était évident vers le 14e jour (figure 3A-C). Au moins 24 répétitions ont été préparées et injectées par échantillon prélevé pour permettre d’autres expériences. La croissance tumorale a été surveillée par la prise d’images fluorescentes (Figure 3D,E). Les images devaient être interprétées avec précaution car une monocouche de cellules cancéreuses se développait également au fond de chaque puits qui n’était pas attaché à l’épiploon. Nous avons préféré prendre des images de l’épiploon lorsqu’il était en suspension dans un milieu afin d’éviter que les signaux fluorescents ne se chevauchent avec la monocouche de cellules cancéreuses.
L’absence de signal fluorescent au jour 14 peut être considérée comme des échecs d’injection. Il a été observé que les cellules cancéreuses se sont d’abord répandues à la surface de l’épiploon pendant les 7 premiers jours, mais qu’au fil du temps, elles se sont rassemblées pour former des tumeurs (Figure 3A-D). Une mesure de substitution de la charge tumorale entre les échantillons était la vitesse à laquelle les milieux de culture de l’épiploon changeaient de couleur du rouge au jaune (Figure 3F). Nous avons utilisé l’imagerie fluorescente, l’examen histologique et l’inspection macroscopique pour confirmer la croissance tumorale et la viabilité du tissu omental après 50 jours de co-culture (Figure 4).
Figure 1 : Illustration des étapes générales du protocole. (A) Étape 1 : Préparation de l’épiploon ; (B) Étape 2 : injection de cellules cancéreuses ; (C) Étape 3 : mise en place du microenvironnement cellule-épiploon cancéreux. (Figure préparée en BioRender.com). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Préparation et injection de cellules cancéreuses dans l’épiploon. (A) L’épiploon est coupé en morceaux de 1 x 1 cm. (B) Chaque pièce est placée dans un puits d’une plaque de 24 puits et recouverte de 500 μL de média. (C) Injection de cellules cancéreuses dans un morceau d’épiploon. (D) Une traînée de cellules cancéreuses fluorescentes est observée après l’injection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Images représentatives après 14 et 25 jours de co-culture. (A-C) Images représentatives après 14 jours de co-culture : (A) phase, (B) canal mCherry, (C) fusionné. (D-E) Des images représentatives après 25 jours de co-culture. (F) Le changement de couleur du milieu du rose au jaune est une indication de la réussite de l’injection de cellules cancéreuses et de l’établissement d’une co-culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Morphologie macroscopique et coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E). (A,B) Morphologie macroscopique représentative des co-cultures au jour 50 ; les flèches indiquent les sites de croissance des cellules cancéreuses de l’ovaire mCherry+. (C,D) Coloration H&E représentative des co-cultures au jour 50. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Discussion
À l’aide de ce protocole, un modèle préclinique de carcinose péritonéale pour le cancer de l’ovaire a été développé en utilisant une combinaison de techniques de base in vitro et ex vivo. Une croissance tumorale progressive a été observée au cours des 50 jours de co-culture après l’ensemencement d’échantillons d’épiploon avec des cellules cancéreuses de l’ovaire humaines mCherry+ OCSC1-F2. Cette méthode a été développée et optimisée au cours de plusieurs essais expérimentaux utilisant différents spécimens d’épiploon. Le succès de la croissance tumorale dépendait de la qualité de l’épiploon, de la viabilité des cellules cancéreuses et de l’efficacité de l’injection. Dans ce rapport, nous n’avons utilisé que les cellules mCherry+ OCSC1-F2 et les lignées de cancer de l’ovaire humain mCherry+ R182 précédemment rapportées dans plusieurs publications 12,15,16,17,18,19,20,21,22. En utilisant ces deux lignées cellulaires avec des temps de doublement différents (16 h pour OCSC1-F2 et 36 h pour R182), une différence dans le temps nécessaire pour atteindre la croissance logarithmique dans le tissu omental a été notée. Néanmoins, nous avons réussi à établir les deux lignées cellulaires dans le système de co-culture.
Une communication efficace entre les chercheurs, les coordonnateurs de recherche et les équipes chirurgicales était essentielle pour la collecte et le traitement des échantillons d’épiploon. L’investigateur a identifié les protocoles candidats, les coordonnateurs de la recherche ont obtenu le consentement des patients avant la chirurgie, et l’investigateur a recueilli les échantillons dans la salle d’opération. Compte tenu de ce flux de travail, l’horaire de l’investigateur devait être flexible, car de nombreux facteurs affectant le prélèvement du côté du patient étaient imprévisibles (p. ex., annulation de la chirurgie, modification de l’heure de la chirurgie, retrait inadéquat ou inexistant). La visualisation et la sélection directes des tissus de la salle d’opération ont permis de garantir l’intégrité de l’échantillon, la stérilité chirurgicale et le traitement en temps opportun. Initialement, la collecte des spécimens était déléguée à des coordonnateurs de recherche ; Cependant, après le prélèvement de quelques échantillons, nous avons constaté que le temps de traitement était retardé (c.-à-d. >4 h) et que la qualité de l’épiploon était nettement inférieure (p. ex., le tissu était en morceaux). Dans un essai expérimental, le tissu omental a été conservé à 4 °C pendant 48 h avant l’injection parce que les cellules cancéreuses n’étaient pas prêtes à temps. Une croissance tumorale similaire a encore été observée, mais cette séquence n’a pas été répétée car les changements de température sont connus pour affecter le microenvironnement tumoral (ETM).
Avant le prélèvement de l’échantillon, il était important d’avoir suffisamment de cellules cancéreuses confluentes selon le calendrier de la chirurgie. Étant donné que le nombre d’échantillons prélevés chaque mois variait, les cultures actives de cellules cancéreuses de l’ovaire n’étaient pas toujours maintenues. Les cellules congelées ont été décongelées au moins 1 semaine à l’avance, plaquées selon un protocole standard, puis passées au moins une fois pour assurer la viabilité. Les lignées cellulaires utilisées dans ce protocole étaient relativement résistantes ; Cependant, nous avons encore rencontré des cas où les cellules n’avaient pas récupéré le jour de la chirurgie et ne pouvaient pas être injectées. Dans cette étude, il n’y a eu aucune tentative d’injection de cellules cancéreuses confluentes à moins de 50%. Les retards subséquents liés à la préparation des cellules ont été atténués en utilisant une bonne technique stérile et en divisant les cellules en ratios pour maintenir la confluence en fonction du calendrier de prélèvement des échantillons prévu. Nous avons limité le protocole à seulement deux lignées cellulaires cancéreuses marquées par fluorescence, mais il est important de noter que d’autres lignées cellulaires cancéreuses établies ou des cellules cancéreuses primaires sans protéines fluorescentes pourraient également être utilisées.
Enfin, le taux de croissance tumorale était corrélé à la confluence des cellules cancéreuses adjacentes et à l’intérieur des adipocytes immédiatement après l’injection. Cela a été déterminé en prenant des images fluorescentes de tous les échantillons d’épiploon après l’injection. Par rapport à l’inoculation de cellules tumorales d’organes solides ou de tissus sous-cutanés, l’injection de cellules cancéreuses dans le tissu omental était plus difficile. La structure lâche et la consistance grasse de l’épiploon empêchent le tissu de retenir efficacement les volumes de suspension cellulaire sans fuite. Lorsqu’une aiguille plus petite (c.-à-d. 30 G ou moins) a été utilisée pour l’injection, on craignait la fragmentation cellulaire à mesure que la prolifération cellulaire diminuait. Nous avons testé diverses techniques d’injection, le nombre de cellules et les volumes de suspension cellulaire et avons trouvé des résultats cohérents avec le protocole décrit ci-dessus. Dans le même temps, nous reconnaissons que de telles variations du protocole sont susceptibles de produire des résultats similaires compte tenu de la nature maligne des cellules. L’ajout de Matrigel a facilité l’étape de l’injection, car la matrice extracellulaire a mieux maintenu la suspension cellulaire ; Cependant, cette méthode est plus coûteuse et n’a pas systématiquement produit une charge tumorale plus élevée dans les échantillons. Dans l’ensemble, il était rare que l’un des spécimens d’épiploon ne développe pas de tumeurs, mais le nombre de tumeurs et la vitesse de croissance variaient.
Ce modèle a simulé une caractéristique de la tumorigenèse du cancer de l’ovaire en répliquant les métastases précoces dans des tissus péritonéaux riches en graisse. Ce protocole permet de varier sans compétence requise, est facile à reproduire et génère un système avec une valeur translationnelle potentielle. Par rapport aux modèles in vitro et ex vivo existants dans le cancer de l’ovaire, la méthode décrite ici combine plusieurs techniques pour produire un modèle qui conserve l’architecture tumorale et l’ETM sur une longue durée de vie. De plus, nous avons observé que lorsqu’un échantillon d’épiploon avec plusieurs tumeurs était transféré dans un nouveau puits et cultivé avec un épiploon sans cancer (c’est-à-dire non injecté), l’épiploon naïf était ensemencé avec des cellules cancéreuses dans les 7 jours. Cette découverte suggère que les tumeurs répliquées conservent un potentiel métastatique via la transition épithélio-mésenchymateuse. Nous n’avons pas identifié de modèles similaires de cancer de l’ovaire dans la littérature qui ont cultivé des biopsies tissulaires pendant de longues périodes. Cette approche est étayée par une découverte antérieure selon laquelle des cellules mésothéliales isolées de l’épiploon de souris pourraient être cultivées pendant plus de 30 passages après le prélèvement23.
Le modèle décrit dans cette étude peut être utilisé pour mieux comprendre l’effet de l’interaction directe entre les cellules cancéreuses de l’ovaire et les cellules de l’épiploon riche en graisse. Les cellules cancéreuses peuvent être dissociées des tissus de l’épiploon et obtenues pour une analyse transcriptomique ou immunohistochimique (IHC). De plus, les cellules peuvent être utilisées pour des études de réponse aux médicaments.
Les principales limites de ce modèle sont que le nombre de tumeurs, le taux de croissance tumorale et l’emplacement des tumeurs étaient imprévisibles. Le manque de normalisation et la variation d’un échantillon à l’autre pourraient limiter l’application de ce modèle. Nous avons également fait plusieurs observations qui nécessiteront un examen plus approfondi lors de l’élaboration de ce protocole. Par exemple, les répétitions « témoins » d’une expérience n’étaient pas réellement exemptes de cancer, car le patient a ensuite été diagnostiqué avec des micrométastases omentales ; Cependant, les tumeurs non injectées sont restées viables tout au long de la période expérimentale. Les applications futures de ce modèle comprendront des études moléculaires de l’ETM au cours de la tumorigenèse précoce, la manipulation de l’ETM par injection de cellules immunitaires et des études sur la réponse aux médicaments. En résumé, nous pensons que le modèle préclinique décrit ici s’ajoutera au répertoire des outils de recherche existants et aidera à élucider les mécanismes moléculaires de l’ETM dans le cancer de l’ovaire.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette étude est financée en partie par la Janet Burros Memorial Foundation. Nous remercions les patientes et le service d’oncologie gynécologique de l’Institut du cancer Karmanos pour la collecte d’échantillons d’épiploon. Nous remercions également la biobanque et le noyau des sciences corrélatives de l’Institut du cancer Karmanos pour la coordination du recrutement des patients et la préparation des lames de pathologie. Le noyau de biobanque et de sciences corrélatives est soutenu en partie par la subvention P30 du NIH Center CA22453 à l’Institut du cancer Karmanos de l’Université d’État de Wayne.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsine-EDTA (1x) | Gibco | 25300054 | |
| 1 mL Seringue à insuline avec aiguille amovible de 26 g | BD | 329652 | |
| 10 mL Pipettes sérologiques | CELLTREAT | 229010B | |
| 100 mm Boîte de culture tissulaire | Fisherbrand | FB012924 | |
| 15 mL Tube à centrifuger | CELLTREAT | 229411 | |
| 24 puits Plaque de culture | Costar | 3524 | |
| 50 mL Tube à centrifuger | CELLTREAT | 229421 | |
| 75 cm2 Flacon de culture tissulaire | CELLTREAT | 229341 | |
| Corning Cell Counter | Corning | 9819000 | |
| Cytation 5 imager | Biotek | ||
| DMEM/F12 (1:1) (1x), +L-Glutamine, +2.438 g/L de sodium Bicarbonate | Gibco | 11320033 | |
| Sérum fœtal de bovin, qualifié | Gibco | 1043028 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Matrice à membrane basale |
| n° 10 Scalpel jetable en acier inoxydable | Integra-Miltex | 4410 | |
| Pénicilline Streptomycine | Gibco | 15140122 | |
| Saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 ( 1x) | Microscope Gibco | 10010023 | |
| Revolve | Echo |
Références
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Réimpressions et autorisations
