Extraction du venin de la guêpe parasitoïde Trichogramma dendrolimi à l’aide d’un hôte artificiel

Résumé

Nous présentons ici un protocole d’extraction du venin de Trichogramma dendrolimi à l’aide d’un hôte artificiel créé avec un film de polyéthylène et une solution d’acides aminés.

Résumé

Les guêpes parasitoïdes sont un groupe diversifié d’insectes hyménoptères qui constituent des ressources inestimables pour la lutte biologique contre les ravageurs. Pour assurer un parasitisme réussi, les guêpes parasitoïdes injectent du venin dans leurs hôtes pour supprimer l’immunité de leurs hôtes, moduler le développement, le métabolisme et même le comportement des hôtes. Avec plus de 600 000 espèces estimées, la diversité des guêpes parasitoïdes dépasse celle d’autres animaux venimeux, tels que les serpents, les escargots coniques et les araignées. Le venin de guêpe parasitoïde est une source sous-explorée de molécules bioactives avec des applications potentielles dans la lutte antiparasitaire et la médecine. Cependant, la collecte du venin parasitoïde est difficile en raison de l’impossibilité d’utiliser la stimulation directe ou électrique et de la difficulté de dissection en raison de leur petite taille. Trichogramma est un genre de minuscules guêpes parasitoïdes d’œufs (~0,5 mm) qui sont largement utilisées pour la lutte biologique contre les lépidoptères ravageurs dans l’agriculture et les forêts. Nous rapportons ici une méthode d’extraction du venin de T. dendrolimi à l’aide d’hôtes artificiels. Ces hôtes artificiels sont créés avec un film de polyéthylène et des solutions d’acides aminés, puis inoculés avec des guêpes Trichogramma pour le parasitisme. Le venin a ensuite été recueilli et concentré. Cette méthode permet d’extraire de grandes quantités de venin de trichogramme tout en évitant la contamination d’autres tissus causée par la dissection, un problème courant dans les protocoles de dissection de réservoir de venin. Cette approche innovante facilite l’étude du venin de Trichogramma , ouvrant la voie à de nouvelles recherches et applications potentielles.

Introduction

Les guêpes parasitoïdes sont des insectes hyménoptères parasites qui sont des ressources importantes pour la lutte biologique¹. Il existe une grande variété de guêpes parasitoïdes, avec plus de 600 000 espèces estimées². La diversité des guêpes parasitoïdes dépasse de loin celle d’autres arthropodes venimeux, tels que les serpents, les escargots coniques, les araignées, les scorpions et les abeilles. Le venin est un facteur parasitaire important chez les guêpes parasitoïdes. Pour un parasitisme réussi, le venin est injecté dans l’hôte, modulant le comportement, l’immunité, le développement et le métabolisme de l’hôte³. De plus, le venin des guêpes parasitoïdes présente une diversité remarquable dans ses structures moléculaires, ses cibles et ses fonctions, reflétant une coévolution complexe avec leurs hôtes. Ainsi, le venin parasitoïde est une ressource précieuse et sous-estimée de molécules actives à des fins insecticides ou médicales⁴. Contrairement au venin des serpents, des escargots coniques, des araignées, des scorpions et des abeilles, le venin de guêpe parasitoïde ne peut pas être collecté par stimulation directe ou par stimulation électrique⁵. La méthode actuelle d’extraction du venin de guêpe parasitoïde consiste à disséquer le réservoir de venin. Cependant, les guêpes parasitoïdes sont souvent petites, et la dissection des guêpes parasitoïdes nécessite des compétences techniques élevées. Par conséquent, si nous pouvons trouver un moyen de collecter le venin des guêpes parasitoïdes de manière efficace et pratique, il sera d’une grande aide de rechercher le venin des guêpes parasitoïdes.

Trichogramma (Hymenoptera : Trichogrammatidae) est un genre de guêpes parasitoïdes minuscules (~0,5 mm de long)⁶. Ces guêpes sont parmi les agents de lutte biologique les plus utilisés, ciblant particulièrement les œufs de divers lépidoptères ravageurs dans l’agriculture et les forêts. Par exemple, T. dendrolimi, l’une des espèces de trichogrammes les plus utilisées en Chine, a été largement utilisé pour lutter contre une variété de ravageurs agricoles et forestiers, tels que Dendrolimus superans, Ostrinia furnacalis et Chilo suppressalis. Des études antérieures ont montré que les guêpes trichogrammes pouvaient injecter leurs œufs dans des hôtes artificiels⁷. Les hôtes artificiels peuvent être créés à l’aide de matériaux tels que la cire⁸, l’agar⁹, le parafilm¹⁰ et le film plastique¹¹. La solution dans les hôtes artificiels qui induit une ponte suffisante pour les trichogrammes peut être simple, comme les acides aminés ou les sels inorganiques¹². Sur la base de la caractéristique selon laquelle T. dendrolimi peut parasiter des hôtes artificiels, cette étude fournit une nouvelle méthode pour extraire le venin des guêpes parasitoïdes à l’aide d’hôtes artificiels. Cette approche vise à remédier aux lacunes du faible rendement, de la faible pureté et de la sensibilité à la contamination dans les techniques d’extraction actuelles. En utilisant cette méthode, une grande quantité de venin de haute pureté de T. dendrolimi peut être extraite, ce qui répond aux besoins de la recherche scientifique et du criblage de molécules bioactives à des fins insecticides ou médicales.

Protocole

1. L’élevage d’insectes

1. Nourrissez Corcyra cephalonica avec de la farine de maïs à une température de 26 ± 1 °C et à une humidité relative de 40 % ± 10 %.
2. Élevez la souche T. dendrolimi de l’insectarium Jilin à l’intérieur en utilisant les œufs de Corcyra cephalonica comme hôtes. Nourrir les guêpes adultes avec 10 % d’eau de saccharose dans des tubes de drosophile à une température de 26 ± 1 °C, une humidité relative de 70 % ± 10 %, une lumière (L) : sombre (D) une période de 14 h : 10 h.

2. Préparation de cartes d’oeufs en film plastique polyéthylène

1. Prenez un film plastique polyéthylène d’une longueur de 16 cm, d’une largeur de 12 cm et d’une épaisseur de 20 μm. Presser 30 protubérances semi-circulaires d’un diamètre de 2-3 mm et d’une hauteur d’environ 3 mm à l’aide d’une tige de meulage en verre selon la disposition standard de la plaque PCR de 96 trous.
   REMARQUE : Le processus d’extraction de 30 protubérances semi-circulaires à l’aide d’une tige de broyage en verre doit être effectué en faisant attention à la pression car une presse trop dure percera le plastique et contaminera la tige de broyage sans venin extraite.
2. Désinfectez le film plastique de polyéthylène pressé en exposant les deux côtés à la lumière ultraviolette (UV) pendant 1 h.
3. Ajoutez une petite quantité d’alcool polyvinylique à 10 % sur la surface semi-circulaire.

3. Parasitisme de Trichogramma dendrolimi

1. Après l’anesthésie au CO₂ , placez les guêpes femelles T. dendrolimi dans une boîte de collecte, et le nombre de guêpes était de ~3000.
2. Placez le côté convexe de la carte d’œuf en film vers la boîte de collecte et fixez les bords avec un élastique.
3. Ajouter 4 μL de solution d’acides aminés (6 g/L de leucine, 4 g/L de phénylalanine, 4,25 g/L d’histidine) à chaque saillie semi-circulaire. Recouvrez-le d’un film plastique plat en polyéthylène de 16 cm de long et 12 cm de large. Utilisez un élastique pour recouvrir hermétiquement la boîte de collecte de deux feuilles de plastique.
4. Laissez les guêpes T. dendrolimi parasiter librement pendant 4 à 8 h et fournissez 10 % d’eau de saccharose à travers le coton mouillé.

4. Collecte du venin de T. dendrolimi

1. Prélever la solution d’acides aminés parasités à partir de la saillie interne de la carte d’ovule artificiel et la transférer dans le bouchon des tubes de 1,5 ml.
2. Couvrez le bouchon du tube avec un filet en nylon de 10 μm avec un diamètre de 25 mm, fixez fermement le filet en nylon et le tube à centrifuger. Placez le tube de centrifugation à la verticale pour une centrifugation courte à l’aide d’une mini-centrifugeuse (1360 x g) pendant 10 s et collectez la solution filtrée (~100 μL de venin de T. dendrolimi ).
3. Mesurer la concentration de venin de T. dendrolimi recueilli à l’aide d’une trousse de dosage de l’acide bicinchoninique (BCA) (Table des matériaux).
4. Conservez le venin à -80 °C pour d’autres analyses.

5. Analyses SDS-PAGE

1. Ajouter 30 μL de venin de T. dendrolimi à 10 μL de tampon de chargement d’échantillon 4x dodécyl sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) (Table des matériaux) et chauffer à 95 °C pendant 10 min.
2. Effectuer un cycle de gel SDS-PAGE à 130 V pendant 120 min.
3. Teindre et décolorer le gel SDS-PAGE à l’aide de l’appareil de coloration des protéines (Table des matériaux).

Résultats

La concentration en protéines d’échantillons représentatifs de venin a été mesurée à l’aide de la trousse d’analyse des protéines, et les résultats sont présentés dans le tableau 1. Les résultats ont montré que la concentration de protéine de venin recueillie par cette méthode variait de 0,35 μg/μL à 0,46 μg/μL, tandis que le témoin négatif de la solution d’acides aminés n’avait qu’une concentration en protéines de 0,03 μg/μL à 0,05 μg/μL. La concentration de protéine de venin collectée par cette méthode...

Discussion

Nous présentons ici une méthode d’extraction du venin de T. dendrolimi à l’aide d’hôtes artificiels. Les points clés de l’expérience de collecte de venin sont les suivants. (1) Au cours de la préparation, T. dendrolimi doit être anesthésié rapidement avec une concentration appropriée de CO₂. Si la concentration de CO₂ est trop faible, elle sera insuffisante pour anesthésier rapidement les trichogrammes . À l’inverse, si la concentration est trop élevée, les trichogramm...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 &mu ; m Nylon Net	Millipore	NY1002500	Pour filtrer les œufs
10 % Alcool polyvinylique	Aladdin	P139533	Pour attirer  ; T. dendrolimi  ; pour pondre des oeufs
10 % Eau de saccharose	Sinopharm Réactif chimique  ;	10021463	Feed Trichogramma dendrolimi
4x LDS Tampon de chargement	Ace Hardware	B23010301	SDS-PAGE
Boîte de collection	Deli	8555	Conteneur pour T. dendrolimi parasitism
Future PAGE  ; 4&ndash ; 12 % (12 puits)	Ace Hardware	J70236502X	Appareil
de coloration des protéines SDS-PAGE GenScript eStain L1	GenScript	L00753	SDS-PAGE
Tige de meulage du verre  ;   ;	Applygen	tb6268	Saillies semi-circulaires  ;
L- Leucine	Solarbio	L0011	Composants artificiels de l’hôte
L-Histidine	Aladdin	A2219458	Composants artificiels
de l’hôte L-Phénylalanine	Solarbio	P0010	Composants artificiels
de l’hôte Mini-Centrifugeuses	Scilogex	D1008	Centrifugeuse
MOPS-SDS Tampon de fonctionnement	Ace Hardware	B23021	SDS-PAGE
Kit de dosage des protéines BCA instantané Omni-Easy	Shanghai Yamay Biomedical Technology  ;	ZJ102	Pour l’estimation de la concentration en protéines de venin
Disposition de la plaque PCR de 96 trous	Thermo Fisher	AB1400L	Saillies semi-circulaires  ;
Film plastique en polyéthylène	Suzhou Aopang Trading   ;	001c5427	Carte d’oeuf artificiel
Marqueur de protéine de couleur pré-coloré (10&ndash ; 180 kDa)	YiFeiXue Biotech	YWB007	SDS-PAGE
Élastique	Guangzhou qianrui biologie science et technologie	009	Resserrer le film plastique et la boîte de collecte
Tapis septa en caoutchouc de silicone, 96 puits, trou rond	Sangon Biotech	F504416-0001	Saillies semi-circulaires  ;