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Article de méthode

Démonstration de la culture de feuilles cellulaires auto-assemblées et de la génération manuelle d’un organoïde 3D de type tendon/ligament à l’aide de fibroblastes dermiques humains

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DOI :

10.3791/66047

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21 juin 2024

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1Department of Musculoskeletal Tissue Regeneration, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg, 2Laboratory for Experimental Trauma Surgery, Department of Trauma Surgery, University Hospital Regensburg, 3Department of Orthopaedics, Orthopaedic Hospital König-Ludwig-Haus, University of Würzburg

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous démontrons un modèle organoïde en trois étapes (expansion bidimensionnelle [2D], stimulation 2D, maturation tridimensionnelle [3D]) offrant un outil prometteur pour la recherche fondamentale sur les tendons et une méthode potentielle sans échafaudage pour l’ingénierie tissulaire des tendons.

Résumé

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des structures fortes et hiérarchisées qui unissent le système musculo-squelettique. Ces tissus ont une matrice extracellulaire (ECM) riche en collagène de type I strictement agencée et des cellules de la lignée T/L principalement positionnées en rangées parallèles. Après une blessure, les T/L nécessitent une longue période de rééducation avec un risque de défaillance élevé et des résultats de réparation souvent insatisfaisants. Malgré les progrès récents de la recherche en biologie T/L, l’un des défis restants est que le domaine T/L ne dispose toujours pas d’un protocole de différenciation standardisé capable de récapituler le processus de formation T/L in vitro. Par exemple, la différenciation osseuse et graisseuse des cellules précurseurs mésenchymateuses ne nécessite qu’une culture cellulaire bidimensionnelle standard (2D) et l’ajout de milieux de stimulation spécifiques. Pour la différenciation en cartilage, une culture tridimensionnelle (3D) de granulés et une supplémentation en TGFß sont nécessaires. Cependant, la différenciation cellulaire en tendon nécessite un modèle de culture 3D très ordonné, qui devrait idéalement être également soumis à une stimulation mécanique dynamique. Nous avons établi un modèle d’organoïde en 3 étapes (expansion, stimulation et maturation) pour former une structure 3D en forme de bâtonnet à partir d’une feuille cellulaire auto-assemblée, qui fournit un microenvironnement naturel avec ses propres facteurs ECM, autocrines et paracrines. Ces organoïdes en forme de bâtonnets ont une architecture cellulaire multicouche au sein d’une ECM riche et peuvent être manipulés assez facilement pour être exposés à des contraintes mécaniques statiques. Ici, nous avons démontré le protocole en 3 étapes en utilisant des fibroblastes dermiques disponibles dans le commerce. Nous avons pu montrer que ce type de cellule forme des organoïdes robustes et abondants en MEC. La procédure décrite peut être optimisée en termes de milieux de culture et optimisée pour la stimulation mécanique axiale dynamique. De la même manière, d’autres sources cellulaires peuvent être testées pour leur potentiel à former des organoïdes T/L et donc à subir une différenciation T/L. En résumé, l’approche éprouvée des organoïdes 3D T/L peut être utilisée comme modèle pour la recherche fondamentale sur les tendons et même pour l’ingénierie T/L sans échafaudage.

Introduction

Les tendons et les ligaments (T/L) sont des composants vitaux du système musculo-squelettique qui fournissent un soutien et une stabilité essentiels au corps. Malgré leur rôle critique, ces tissus conjonctifs sont sujets à la dégénérescence et aux blessures, provoquant des douleurs et des troubles de la mobilité1. De plus, leur apport sanguin limité et leur capacité de guérison lente peuvent entraîner des blessures chroniques, tandis que des facteurs tels que le vieillissement, les mouvements répétitifs et une réadaptation inadéquate augmentent encore le risque de dégénérescence etde blessures. Les traitements conventionnels, tels que le repos, la physiothérapie et les interventions chirurgicales, ne parviennent pas à restaurer complètement la structure et la fonction T/L. Au cours des dernières années, les chercheurs se sont efforcés de mieux comprendre la nature complexe de la T/L afin de trouver des traitements efficaces pour les troubles T/L 3,4,5. Les T/L se distinguent par une structure hiérarchiquement organisée, dominée par la matrice extracellulaire (ECM), composée principalement de fibres de collagène de type I et de protéoglycanes, une caractéristique difficile à reproduire in vitro6. Les modèles traditionnels de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ne parviennent pas à capturer l’organisation tridimensionnelle (3D) caractéristique des tissus T/L, ce qui limite leur potentiel de traduction et entrave les progrès innovants dans le domaine de la régénération T/L.

Récemment, le développement de modèles organoïdes 3D a offert de nouvelles possibilités pour faire progresser la recherche fondamentale et l’ingénierie tissulaire sans échafaudage de divers types de tissus 7,8,9,10,11,12,13. Par exemple, pour étudier la jonction myotendineuse, Larkin et al. 2006 ont développé des constructions musculaires squelettiques 3D avec des segments de tendon auto-organisés dérivés du tendon10 de la queue de rat. De plus, Schiele et al. 2013, en utilisant des canaux de croissance micro-usinés recouverts de fibronectine, ont dirigé l’auto-assemblage des fibroblastes dermiques humains pour former des fibres cellulaires sans l’aide d’un échafaudage 3D, une approche qui peut capturer les traits clés du développement des tendons embryonnaires11. Dans l’étude de Florida et al. 2016, les cellules stromales de la moelle osseuse ont d’abord été étendues en lignées osseuses et ligamentaires, puis utilisées pour générer des feuilles cellulaires monocouches auto-assemblées, qui ont ensuite été mises en œuvre pour créer une construction os-ligamentaire-os multiphasique imitant le ligament croisé antérieur natif, un modèle visant à améliorer la compréhension de la régénération ligamentaire12. Pour élucider les processus de mécanotransduction tendineuse, Mubyana et al. 2018 ont utilisé une méthodologie sans échafaudage par laquelle des fibres de tendon uniques ont été créées et soumises à un protocole de charge mécanique13. Les organoïdes sont des structures 3D auto-organisées qui imitent l’architecture native, le microenvironnement et la fonctionnalité des tissus. Les cultures d’organoïdes 3D fournissent un modèle plus pertinent sur le plan physiologique pour l’étude de la biologie des tissus et des organes ainsi que de la physiopathologie. De tels modèles peuvent également être utilisés pour induire une différenciation tissulaire spécifique de différents types de cellules souches/progénitrices14,15. Par conséquent, la mise en œuvre de modèles organoïdes 3D dans le domaine de la biologie T/L et de l’ingénierie tissulaire devient une approche très attrayante 9,16. D’autres sources cellulaires peuvent être mises en œuvre pour l’assemblage de l’organoïde et stimulées vers la différenciation ténogénique. Un type de cellule pertinent utilisé pour la démonstration dans cette étude est les fibroblastes dermiques 7,17,18. Ces cellules sont facilement accessibles grâce à une procédure de biopsie cutanée, qui est moins invasive que la ponction de la moelle osseuse ou la liposuccion et peut être multipliée assez rapidement en grand nombre en raison de leur bonne capacité de prolifération. En revanche, les types de cellules plus spécialisés, tels que les fibroblastes résidents T/L, sont plus difficiles à isoler et à développer. Par conséquent, les fibroblastes dermiques ont également été utilisés comme point de départ pour les technologies de reprogrammation cellulaire vers des cellules souches embryonnaires pluripotentes induites19. Soumettre les fibroblastes dermiques à des conditions de culture 3D spécifiques et à des signaux de signalisation, tels que le facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGFß3), qui a été signalé comme un régulateur clé de divers processus cellulaires, y compris la formation et le maintien de T/L, peut potentialiser leur différenciation ténogénique in vitro conduisant à l’expression de gènes spécifiques du tendon et au dépôt d’ECM20 typique de T/L, 21. Aéroport

Ici, nous décrivons et démontrons un protocole organoïde en 3 étapes précédemment établi et mis en œuvre (expansion 2D, stimulation 2D et maturation 3D) utilisant des fibroblastes dermiques humains adultes normaux (NHDF) disponibles dans le commerce comme source cellulaire, offrant un modèle précieux pour l’étude de la ténogenèse in vitro 7. Malgré le fait que ce modèle n’est pas équivalent au tissu T/L in vivo, il fournit tout de même un système plus pertinent sur le plan physiologique qui peut être utilisé pour étudier les mécanismes de différenciation cellulaire, imiter la physiopathologie T/L in vitro et établir des plateformes de médecine personnalisée et de dépistage de médicaments. De plus, à l’avenir, des études pourront évaluer si les organoïdes 3D sont adaptés à l’ingénierie T/L sans échafaudage en augmentant l’optimisation et utilisables pour le développement de constructions mécaniquement robustes à l’échelle qui ressemblent étroitement aux dimensions et aux propriétés structurelles et biophysiques des tissus T/L natifs.

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Protocole

REMARQUE : Toutes les étapes doivent être effectuées à l’aide de techniques aseptiques.

1. Culture et pré-expansion des NHDF

  1. Décongelez rapidement le flacon cryogénique contenant des fibroblastes dermiques humains normaux (NHDF, 1 x 106 cellules) à 37 °C jusqu’à ce qu’ils soient presque en train de décongeler.
  2. Ajouter lentement 1 mL de milieu de croissance des fibroblastes 2 préchauffé (trousse prête à l’emploi comprenant un milieu basal, un sérum de veau fœtal à 2 %, un facteur de croissance des fibroblastes basique (bFGF) et de l’insuline) complété par de la pénicilline/streptomycine à 1 % (pen/streptocoque) (milieu NHDF), préchauffé à 37 °C sur les cellules.
  3. Transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante (RT).
  4. Retirez le surnageant. Remettre la pastille de cellule en suspension dans 12 mL de milieu NHDF préchauffé.
  5. Transférez les cellules dans une fiole T-75 et agitez brièvement dans le sens transversal. Placer la fiole T-75 à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 .
  6. Changez de milieu tous les 2 jours. Observez les NHDF au microscope jusqu’à ce qu’ils atteignent une confluence de 70 à 80 %.

2. Expansion 2D

  1. Sortez la fiole T-75 de l’incubateur et retirez le milieu NHDF. Lavez les cellules avec une solution saline tampon de phosphate (PBS) préchauffée.
  2. Ajouter 3 ml de trypsine-EDTA à 0,05 % dans les cellules. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles se détachent du ballon (environ 3 min).
  3. Ajouter 6 ml de milieu NHDF préchauffé pour neutraliser l’action de la trypsine. Transférez les cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml.
  4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à RT et retirer le surnageant.
  5. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu DMEM (Modified Eagles Medium) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 1 x acides aminés MEM, 1 % de pen/streptocoque, préchauffé à 37 °C.
  6. Placez les NHDF dans une boîte de culture cellulaire adhérente de 10 cm à une densité de 8 x 103 NHDF/cm2 (au total, 4,4 x 105 NHDF par boîte de 10 cm). Balancez-vous doucement en croix.
  7. Placez la boîte de culture cellulaire de 10 cm à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 . Changez de support tous les 2 jours
  8. Surveiller les cellules au microscope jusqu’à ce que la confluence atteigne 100 % (environ 5 jours).

3. Stimulation 2D

  1. Sortez de l’incubateur les boîtes de culture cellulaire de 10 cm contenant les NHDF (étapes 2.6 et 2.7). Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du PBS préchauffé.
  2. Ajouter 10 ml de milieu à haute teneur en glucose DMEM complété par 10 % de FBS, 50 μg/mL d’acide ascorbique et 1 % de pen/streptocoque, préchauffé à 37 °C.
  3. Placez la boîte de Pétri à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 . Changez de milieu tous les 2 jours.
  4. Surveiller les NHDF au microscope pendant 14 jours.

4. 3D maturation

  1. Sortez la boîte de culture cellulaire de 10 cm de l’incubateur et retirez le milieu à haute teneur en glucose DMEM.
  2. Détachez doucement et rapidement la feuille de cellules formée de la parabole à l’aide d’un grattoir à cellules. Tout en détachant, roulez simultanément la feuille de cellule en un organoïde en forme de tige 3D.
  3. Prenez et placez les organoïdes NHDF dans une boîte de Pétri non adhérente (pour les cellules) de 10 cm. Ce type de parabole est utilisé pour éviter l’émigration cellulaire de l’organoïde vers le plastique.
  4. À ce moment-là ou un jour après (jour 0 ou jour 1 de la maturation 3D), prélevez certains des organoïdes pour des analyses plus approfondies telles que le poids humide, l’évaluation histologique (les organoïdes du jour 1 sont préférables car ils deviennent plus compacts), l’isolement de l’ARN et des protéines.
  5. Fixez les bords de l’organoïde avec des broches métalliques comme suit :
    1. Tenez soigneusement un côté de l’organoïde à l’aide d’une pince à épiler, et à l’aide d’une autre pince à épiler, appliquez doucement un étirement manuel d’environ 10 % d’allongement axial. Pour estimer l’allongement axial de 10 %, utilisez un papier millimétrique ou une règle.
    2. Ensuite, prenez une goupille métallique avec la pince à épiler et appuyez manuellement à travers le bord de l’organoïde dans le plat en plastique pour le fixer. Répétez cette procédure avec la deuxième goupille sur le deuxième bord de l’organoïde.
  6. Ajouter 10 ml de milieu à haute teneur en glucose DMEM complété par 10 % de FBS, 1 x acides aminés MEM, 50 μg/mL d’acide ascorbique, 10 ng/mL de TGFß3 et 1 % de pen/streptocoque, préchauffé à 37 °C.
  7. Placez la parabole de 10 cm à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2 . Changez de milieu tous les 2 jours.
  8. Surveillez régulièrement les organoïdes pendant 14 jours.
    REMARQUE : Les goupilles peuvent se desserrer, donc refixez-les en utilisant la même technique que celle décrite à l’étape 4.5.
  9. Après 14 jours, retirez le milieu à haute teneur en glucose DMEM des organoïdes. Lavez les organoïdes avec du PBS préchauffé.
  10. Mesurez les organoïdes pour le poids humide au jour 0 et au jour 14 à l’aide d’une balance de précision.
    1. Placez une parabole vide de 10 cm sur la balance et tarez le poids à zéro pour vous assurer que seul le poids des organoïdes est mesuré. Retirez complètement le milieu de culture de la boîte de 10 cm et mesurez le poids humide de l’organoïde un par un.
      REMARQUE : Dans cette étude, au jour 0, trois organoïdes par donneur et au jour 14, deux organoïdes par donneur ont été pesés.
  11. Selon les objectifs de l’étude, mettez en œuvre certains des organoïdes NHDF dans d’autres analyses histologiques ou congelez-les immédiatement dans de l’azote liquide à l’aide de tubes stériles sans ADN/ARN pour l’isolement ultérieur de l’ADN, de l’ARN et des protéines, puis stockez-les à -80 °C.
  12. Pour l’examen histologique, fixer chaque organoïde dans 5 mL de paraformaldéhyde prérefroidi (4 °C) à 4 % dans du PBS (ajusté à un pH neutre) pendant 45 min sur de la glace, suivi d’un lavage PBS à RT (2 x 5 min chacun).
  13. Cryoprotégez les organoïdes fixes à l’aide d’un gradient de saccharose en plaçant les organoïdes dans des bocaux en verre pour l’histologie. Incuber les organoïdes dans 10 % de saccharose dans une solution de PBS pendant 2 h à 4 °C, puis 2 h à 4 °C à 20 % de saccharose/PBS, et enfin une nuit d’incubation à 30 % de saccharose/PBS à 4 °C. Changez les solutions de saccharose en pipetant d’abord, puis en remplissant avec la nouvelle solution.
  14. Intégrez les organoïdes dans le cryo-milieu.
    1. Placez une plaque de cuivre sur de la glace sèche dans une boîte en polystyrène et laissez refroidir pendant 10 min.
    2. Ensuite, placez un cryomoule en plastique, pré-rempli de cryo-médium, sur la plaque de cuivre et appuyez doucement sur l’organoïde au fond du cryomoule à l’aide d’une pince à épiler. Attendez que le cryomédium soit complètement congelé.
    3. Pour les organoïdes longs, coupez d’abord en deux à l’aide d’un scalpel et placez les deux moitiés parallèles l’une à l’autre dans le cryomoule. Répéter la procédure pour chaque organoïde destiné à subir une analyse histologique.
  15. Conservez les échantillons à -20 °C jusqu’à la cryosection.
  16. À l’aide d’un cryotome, couper les organoïdes longitudinalement en sections de 10 μm d’épaisseur et les soumettre à une coloration histologique telle que l’hématoxyline et l’éosine (H&E) en utilisant le protocole standard8.

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Résultats

Le modèle organoïde 3D T/L a été précédemment établi et démontré ici par la mise en œuvre de NHDF achetés dans le commerce (n = 3, 3 organoïdes par donneur, NHDF ont été utilisés aux passages 5 à 8). Le flux de travail du modèle est résumé dans la figure 1. La figure 2 montre des images représentatives en contraste de phase de la culture NHDF pendant la pré-expansion dans des flacons T-75 (Figure 2A) ainsi qu’au début et après 5 jou...

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Discussion

Les résultats démontrés dans cette étude fournissent des informations précieuses sur l’établissement et la caractérisation du modèle organoïde NHDF 3D pour l’étude des tissus T/L. Le protocole en 3 étapes a conduit à la formation d’organoïdes 3D en forme de bâtonnets qui présentent des caractéristiques typiques de la niche T/L. Ce modèle a déjà été rapporté dans Kroner-Weigl et al. 20237 et démontré en détail ici.

Les images en contraste de phase présentées dan...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

D.D. et S.M.-D. reconnaître la subvention BMBF « CellWiTaL : Systèmes cellulaires reproductibles pour la recherche de médicaments - impression laser sans couche de transfert de cellules uniques hautement spécifiques dans des structures cellulaires tridimensionnelles » Proposition n° 13N15874. D.D. et V.R.A. récompensent la bourse EU MSCA-COFUND OSTASKILLS « Formation holistique de la recherche sur l’arthrose de nouvelle génération » GA Nr. 101034412. Tous les auteurs remercient Mme Beate Geyer pour son assistance technique.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide ascorbique  ;   ;Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne  ;   ;A8960
Boîte de culture cellulaire adhérente de 10 cmSigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne.
boîte de Pétri non adhérente de 10 cm  ;Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne  ;
Cryo-mediumTissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Pays-Bas  ;   ;4583
Norme de cryomoule  ;Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Pays-Bas4557
D(+)-Sucrose  ;AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, AllemagneA2211
DMEM moyen à haute teneur en glucose  ;Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne  ;DMEM-HA
DMEM low glucoseCapricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne  ;   ;DMEM-LPXA
Sérum fœtal bovinAnprotec, Bruckberg, Allemagne  ;AC-SM-0027
Milieu de croissance des fibroblastes 2  ;PromoCell, Heidelberg, Allemagne  ;   ;C-23020
H& Kit de coloration EAbcamab245880
Microscope inversé avec caméra haute résolutionZeissNAZeiss Axio Observer avec  ; Acides aminés Axiocam 506
MEM  ;Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne  ;   ;NEAA-B
Goupilles métalliques  ;EntoSphinx, Pardubice, République tchèque04.31
Fibroblastes dermiques humains normauxPromoCell, Heidelberg, Allemagne  ;C-12302
ParaformaldéhydeAppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne  ;A3813
Pénicilline/streptomycine  ;Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Allemagne15140122
Tampon phosphate salin  ;Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Allemagne  ;P4417
TGFß ; 3  ;R& D Systems, Wiesbaden, Allemagne  ;  ; 8420-B3
Trypsine-EDTA 0,05 % DPBS  ;Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Allemagne  ;  ; ESSAI-1B
CLS430167CLS430591

Références

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