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Article de méthode

Analyse par micro-tomodensitométrie du genou chez des cobayes Dunkin-Hartley âgés après injection intra-articulaire

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DOI :

10.3791/66053

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2 août 2024

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1Drug Discovery and Biomedical Sciences, Medical University of South Carolina, 2Department of Biomedical Science, The University of Alabama at Birmingham, 3Department of Comparative Medicine, Medical University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

Les cochons d’Inde Dunkin-Hartley sont un modèle animal établi pour la recherche sur l’arthrose. De telles études peuvent bénéficier des injections intra-articulaires pour diverses raisons, notamment l’étude de nouveaux agents ou le traitement de maladies. Nous décrivons une méthodologie pour les injections intra-articulaires du genou chez les cobayes et l’analyse ultérieure par micro-tomodensitométrie évaluant les changements du genou associés à l’arthrite.

Résumé

L’objectif de ce protocole est de guider les chercheurs dans la réalisation d’une technique guidée par palpation d’injection intra-articulaire du genou chez les cobayes et d’évaluation à l’aide de la micro-tomodensitométrie. Les cobayes Dunkin-Hartley sont des modèles robustes pour la recherche sur l’arthrose, car ils développent spontanément de l’arthrose dans les genoux. L’administration intra-articulaire de médicaments est une méthode courante pour étudier les effets d’un médicament expérimental in vivo. Chez l’homme, les agents thérapeutiques administrés par injection intra-articulaire peuvent soulager la douleur et retarder la progression de l’arthrose. Comme pour toute espèce, l’introduction d’une aiguille dans un espace articulaire peut causer des blessures, ce qui peut entraîner des douleurs, des boiteries ou des infections. De tels événements indésirables peuvent compromettre le bien-être des animaux, fausser les résultats de l’étude et nécessiter la présence d’animaux supplémentaires pour atteindre les objectifs de l’étude. En tant que tel, il est impératif de développer des techniques d’injection appropriées pour prévenir les complications, en particulier dans les études longitudinales qui nécessitent des injections intra-articulaires multiples et répétées. À l’aide de la méthodologie présentée, cinq cobayes ont reçu des injections bilatérales au genou sous anesthésie générale. Sept jours après l’injection, les animaux ont été euthanasiés sans cruauté pour l’analyse de la gravité de l’arthrose. Aucun effet indésirable n’est survenu après l’anesthésie ou les injections au genou, y compris la boiterie, la douleur ou l’infection. L’analyse par micro-tomodensitométrie à rayons X du genou permet de détecter les changements pathologiques associés à l’arthrose. Les données de micro-tomodensitométrie indiquent que l’arthrose est plus grave chez les animaux plus âgés, comme l’indique l’augmentation de la densité minérale osseuse et de l’épaisseur trabéculaire avec l’âge. Ces résultats sont cohérents avec les changements histologiques et les scores de Mankin modifiés, un système de notation établi et largement utilisé pour évaluer la gravité de l’arthrite chez ces mêmes animaux. Ce protocole peut être utilisé pour affiner les injections intra-articulaires chez les cobayes.

Introduction

L’arthrose touche 32,5 millions d’adultes américains. Elle est causée par une perte progressive du cartilage articulaire, une légère inflammation des tissus dans et autour des articulations et la formation d’ostéophytes et de kystes osseux 1,2. Les symptômes se manifestent généralement dans les derniers stades de la maladie, les traitements actuels n’apportant qu’un soulagement palliatif et ayant des effets secondaires systémiques. Le manque de médicaments modificateurs de la maladie provient d’une mauvaise compréhension des mécanismes sous-jacents de la maladie3. Par conséquent, il existe un besoin médical critique et continu d’agents améliorés pour traiter l’arthrose.

Il existe plusieurs modèles animaux d’arthrose qui examinent différentes composantes des processus pathologiques4. Bien qu’il existe plusieurs modèles chirurgicaux, dont la section du ligament croisé antérieur et la déstabilisation du ménisque médial, ceux-ci sont invasifs et nécessitent un haut niveau de compétence technique5. Les modèles induits chimiquement sont des procédures comparativement moins invasives généralement utilisées pour étudier les mécanismes de la douleur de l’arthrose6. L’un de ces modèles murins largement utilisés implique l’induction de l’arthrose par une injection intra-articulaire d’iodoacétate monosodique (MIA) dans le genou. Ce modèle génère un phénotype douloureux reproductible, robuste et rapide qui peut être classé en modifiant la dose7 de MIA. Les détails techniques de l’induction de ce modèle ont été décrits précédemment7. L’application de cette technique aux rongeurs plus gros, comme les cochons d’Inde, est difficile en raison de leurs différences anatomiques. Certaines différences incluent une augmentation de la musculature entourant les os adjacents et l’espace articulaire chez le cobaye et un péroné et un tibia articulés par rapport à la fusion distale observée chez la souris8. Les cobayes Dunkin-Hartley, une souche de cobaye largement disponible, constituent un modèle animal d’arthrose établi car ils développent naturellement cette maladie, offrant ainsi un modèle robuste pour étudier les effets de nouvelles thérapies administrées par injection intra-articulaire sur la progression de la maladie9. Les cobayes Dunkin-Hartley commencent à développer une arthrose à trois mois, les mâles présentant un développement accéléré et un phénotype10 plus sévère. Chez les cobayes, l’arthrose progresse avec l’âge, et à 12 mois, la pathologie associée est apparente à l’imagerie11. Les modèles d’arthrose spontanée, comme le modèle de Dunkin-Hartley, ne nécessitent aucune intervention pour induire l’arthrose et récapitulent ainsi le développement et la progression du phénotype de la maladie chez l’homme, fournissant ainsi un modèle translationnel puissant10. De plus, le développement spontané de l’arthrose permet le contrôle interne lorsque de nouveaux traitements sont administrés unilatéralement dans un seul genou d’un animal donné. Ce contrôle interne minimise les effets des variabilités inter-animaux lors de l’analyse des données et peut aider à réduire le nombre total d’animaux.

L’analyse par microtomodensitométrie à rayons X (μCT) est un outil puissant qui permet une évaluation quantitative de la gravité de l’arthrose12. La tomodensitométrie consiste à balayer plusieurs images radiographiques à haute résolution, obtenues à partir d’un échantillon en rotation ou d’une source de rayons X en rotation et d’un détecteur13. Ensuite, des données volumétriques tridimensionnelles (3D) sont reconstruites sous la forme de tranches d’images empilées14. Étant donné que l’os minéralisé présente un excellent contraste sur la tomodensitométrie, cette modalité peut être utilisée pour évaluer les caractéristiques 3D et effectuer des analyses quantitatives des changements associés à l’OA 15,16,17. La tomodensitométrie offre plusieurs avantages par rapport aux outils plus largement utilisés, notamment l’histopathologie et les analyses de la démarche. Contrairement à l’évaluation histologique d’une ou de quelques sections de tissus, la TDM scanne l’ensemble de l’articulation et offre une évaluation plus holistique des lésions d’arthrose18. Bien que l’analyse de la marche puisse discerner des changements symptomatiques dans la fonction articulaire au fil du temps, les changements articulaires se développent bien avant les changements fonctionnels associés à l’arthrose. μCT peut fournir une mesure plus sensible du développement de l’arthrose avant le début de la boiterie. Deux mesures quantitatives particulièrement pertinentes comprennent la densité minérale osseuse et l’épaisseur trabéculaire, car les deux augmentent tout au long de la progression de l’arthrose19,20. Il peut être utile de diviser l’analyse en plaque sous-chondrale et en os trabéculaire, car elles ont des caractéristiques différentes, afin d’obtenir des mesures et des comparaisons plus robustes.

L’objectif global de cette méthode est d’aider les chercheurs à réaliser avec succès des injections intra-articulaires sur des cobayes. Le protocole présenté a utilisé des cobayes Dunkin-Hartley mâles intacts âgés de cinq (n = 2), neuf (n = 1) et 12 (n = 2) mois ; Les procédures peuvent être extrapolées à d’autres souches et âges de cobayes nécessitant des injections intra-articulaires au genou. Dans les modèles spontanés d’arthrose, comme le modèle Dunkin-Hartley, la progression de la maladie et la réponse au traitement en série sont souvent surveillées sur de longues périodes, allant de quelques semainesà plusieurs mois. Ce protocole étendu entraîne de multiples injections intra-articulaires, et il est donc important de disposer d’une technique d’injection appropriée pour prévenir les événements indésirables, notamment la douleur, la boiterie ou les infections, qui peuvent tous avoir un impact sur le bien-être des animaux et fausser les résultats de l’étude tout en nécessitant la présence d’animaux supplémentaires à l’étude. Le protocole présenté décrit la méthodologie des injections intra-articulaires chez les cobayes et l’analyse ultérieure des données de μCT.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université médicale de Caroline du Sud. L’étude a suivi le principe des 3R.

1. Préparations d’injection intra-articulaire

  1. Laissez les cobayes Dunkin-Hartley s’acclimater à l’installation pendant au moins une semaine avant de commencer l’expérience.
    REMARQUE : Des cobayes mâles âgés de 5 (n = 2), 9 (n = 1) et 12 (n = 2) mois ont été utilisés. Les mâles présentent un développement accéléré et un phénotype plus sévère de l’arthrose.
  2. Rasez la zone du genou avec un rasoir électrique.
    REMARQUE : Faites attention aux mamelons médialement.
  3. Anesthésier le cobaye dans une chambre d’isoflurane délivrant 3 à 5 % d’isoflurane dans un mélange d’O2 (débit de 2,5 L/min), puis transférer le cobaye dans un cône nasal relié à un circuit d’anesthésie sans réinspiration. Ajustez l’isoflurane pour maintenir le plan chirurgical de l’anesthésie pendant l’injection, généralement avec un débit d’oxygène de 0,5 à 1 L/min et de 1 à 3 % d’isoflurane.
    REMARQUE : Les injections intra-articulaires provoquent une douleur légère et momentanée. Les animaux sont anesthésiés pendant la procédure pour éviter la perception de stimuli douloureux et améliorer la précision de l’injection. Dans l’étude présentée, l’administration d’agents analgésiques, y compris d’anti-inflammatoires non stéroïdiens, interférerait avec la progression de l’arthrose21. En raison de la douleur momentanée, de l’anesthésie fournie et du potentiel d’analgésiques à confondre le modèle, les analgésiques n’ont pas été administrés à moins que les animaux ne présentent des effets secondaires, y compris une boiterie et des signes de douleur à la palpation articulaire après l’injection. Les chercheurs doivent envisager l’utilisation d’analgésiques pour les injections de routine. Les analgésiques sont recommandés en cas d’effets secondaires. Les schémas analgésiques doivent être discutés avec le vétérinaire de l’établissement et approuvés par l’IACUC avant le début des études.
  4. Assurez-vous que le cochon d’Inde est à la profondeur d’anesthésie appropriée en l’absence de réponse par pincement des orteils.
  5. Placez un lubrifiant oculaire stérile sur les deux yeux pour éviter la dessiccation et les blessures.
  6. Diluer la bétadine avec de l’eau stérile à 10%.
  7. Diluez de l’éthanol à 200 degrés avec de l’eau stérile à 70 % d’éthanol.
  8. Préparez les solutions injectables, dans une enceinte de biosécurité, pour maintenir la stérilité. Dans le protocole présenté, un véhicule stérile (1 solution saline tamponnée au phosphate) a été utilisé pour injecter les deux genoux. Les solutions peuvent être modifiées en fonction des objectifs de recherche.
    REMARQUE : Assurez-vous de diluer les solutions injectables fraîches immédiatement avant la séance d’injection pour assurer la stérilité. Toutes les solutions non utilisées doivent être jetées à la fin de chaque séance d’injection.
  9. Remplissez des seringues à insuline stériles à usage unique avec des solutions injectables. Prenez soin d’utiliser le plus petit volume possible pour éviter de surcharger l’espace articulaire avec du volume. Dans la présente étude, 50 μL ont été utilisés.
  10. Placez le cochon d’Inde et le cône nasal sur une surface propre avec un coussin chauffant pour le soutien thermique et un rembourrage sous la tête pour l’élever légèrement.
  11. Enfilez une blouse chirurgicale, un filet à cheveux, des gants stériles et un masque pendant la procédure d’injection.
  12. Versez 10 % de bétadine sur une boule de coton et essuyez les deux zones des genoux.
  13. Versez de l’éthanol à 70 % sur une boule de coton et essuyez les deux zones des genoux.
  14. Répétez 1.12 et 1.13 deux fois de plus.
    REMARQUE : À des fins de démonstration, la vidéo correspondante montre le nettoyage du genou et du site d’injection une fois avec 10 % de bétadine et 70 % d’éthanol. Le site d’injection a ensuite été nettoyé deux fois de plus en effectuant des mouvements circulaires, en alternant ces solutions. Trois gommages en série avec une alternance de solutions de gommage et d’alcool sont recommandés pour réaliser une technique aseptique.

2. Injection intra-articulaire

  1. Placez le cochon d’Inde en position couchée pendant toute la durée de la procédure.
  2. Enfilez une nouvelle paire de gants stériles et palpez l’articulation du genou.
    REMARQUE : Dans le protocole et la vidéo présentés, des gants en nitrile autoclavés ont été utilisés. Des gants stériles, y compris des gants en nitrile autoclavés ou des gants chirurgicaux, doivent être utilisés pour la technique aseptique.
  3. Fléchissez manuellement le genou à 90°.
  4. Déplacez le doigt distal sur la rotule pour localiser le sillon de la face distale de l’espace articulaire en fléchissant et en étendant la patte postérieure.
    REMARQUE : La rotule peut être palpée dans cette position comme une petite structure ferme située directement sur l’espace articulaire. Le tibia peut être ressenti comme une structure osseuse distale à la rotule. Une fois que l’emplacement du tibia et de la rotule est déterminé, l’articulation, ressentie comme un sillon, se trouve entre eux, distale à la rotule et proximale au tibia.
  5. Insérez soigneusement l’aiguille à insuline sur la ligne médiane distale de la rotule dans l’espace articulaire. L’aiguille doit être insérée à 1-2 mm sous la peau pour pénétrer dans l’espace articulaire.
    REMARQUE : La plus grande fenêtre d’accès pour l’espace articulaire lorsque le genou est fléchi se trouve sur la face antérieure du membre sur la ligne médiane, directement distale de la rotule. L’injection sur la ligne médiane dans la direction antenne-arrière aidera à injecter avec précision dans l’espace articulaire sans pénétrer les structures osseuses. Une injection précise dans l’espace articulaire peut être réalisée en utilisant une approche latérale à médiale, bien que la fenêtre d’accès soit plus étroite, en particulier lorsque le genou est fléchi.
  6. Injectez lentement 50 μL de la solution dans le joint. Assurez-vous que l’aiguille s’insère facilement et que le contenu est injecté sans résistance.
    REMARQUE : Assurez-vous de ne pas insérer l’aiguille trop profondément car elle peut causer des lésions articulaires ou osseuses et entraîner une inflammation et/ou une douleur indésirables. Si le sillon correspondant à l’espace articulaire n’est pas trouvé, l’aiguille pourrait pénétrer le fémur, la rotule ou le tibia. Par conséquent, il est bénéfique de palper en toute confiance le sillon correspondant à l’espace articulaire pour prévenir les injections péri-articulaires ou les blessures associées à la pénétration des structures osseuses. Si une bulle se forme au site d’injection sous la peau, c’est que l’injection était trop peu profonde et que le liquide a pénétré dans l’espace sous-cutané. Selon les propriétés de l’agent utilisé, le médicament peut pénétrer dans l’espace articulaire par diffusion, ou une autre tentative d’injection peut être nécessaire.
  7. Une fois cela fait, jetez l’aiguille dans le bac à objets tranchants.
    REMARQUE : À des fins de pratique et de formation, injectez un liquide contenant un colorant dans l’espace articulaire d’un cadavre chez un rongeur ou un cochon d’Inde de taille similaire. Ensuite, disséquez l’articulation pour confirmer l’emplacement de l’injection.
  8. Massez le genou en fléchissant et en étendant l’articulation plusieurs fois pour favoriser la diffusion du médicament dans l’espace articulaire.
  9. Répétez les étapes 2.1 à 2.5 une fois sur le membre controlatéral avec 1 fois la solution PBS.

3. Récupération après une injection intra-articulaire

  1. Éteignez l’isoflurane et maintenez un débit d’oxygène de 100 % jusqu’à ce que l’animal reprenne conscience.
  2. Placez l’animal sur un coussin chauffant pour le soutenir thermiquement jusqu’à ce qu’il soit ambulatoire.
  3. Appliquez un sac de glace sur le genou pendant 30 secondes avec une serviette en papier comme barrière pour aider à réduire l’enflure de l’injection.
  4. Évaluez la démarche de l’animal lorsqu’il est ambulatoire avant de le ramener au logement.
    REMARQUE : Si des anomalies de la marche sont notées, des analgésiques et des soins de soutien peuvent être justifiés. Il est conseillé d’évaluer à nouveau leur démarche plusieurs heures après la récupération de l’anesthésie afin d’assurer une mobilité normale.

4. Microtomodensitométrie (μCT)

  1. Pour le prélèvement tissulaire, établissez un plan chirurgical d’anesthésie avec un mélange 100 % d’oxygène et 5 % d’isoflurane.
  2. Confirmer un plan chirurgical d’anesthésie avec l’absence de réponse à un stimulus de pincement des orteils. Euthanasier l’animal sans cruauté en lui administrant ≥ 150 mg/kg de pentobarbital par voie intraveineuse, conformément aux politiques de l’établissement et au protocole d’utilisation approuvé des animaux.
    REMARQUE : Dans le protocole présenté, chacun des cinq cobayes a reçu une injection dans les deux genoux. Les animaux ont été anesthésiés et euthanasiés sans cruauté une semaine après l’injection.
  3. Récoltez les deux membres postérieurs en disséquant la peau loin de la musculature environnante.
  4. Ensuite, désarticulez la patte postérieure avec des Rongeurs au milieu de la tige du fémur et à proximal de la cheville.
    REMARQUE : Le lit de balayage et le porte-échantillon utilisés n’ont pas pu accueillir toute la patte postérieure d’un cochon d’Inde adulte. De grands porte-échantillons sont disponibles dans le commerce pour les échantillons de plus grande taille.
  5. Placez les tissus dans une solution de formol neutre et tamponnée pendant 72 h pour la fixation avant d’effectuer la μCT.
  6. Ouvrez le logiciel de scan μCT et placez l’échantillon avec du formol dans un récipient compatible qui s’adaptera au dossier de l’échantillon μCT tout en maintenant les tissus dans le champ de vision.
  7. Calibrez l’appareil μCT pour les expositions en fond sombre et en champ clair selon les recommandations du fabricant.
  8. Scanner l’échantillon avec un filtre Al+Cu à 18 μm. Utilisez le pas de rotation 0,7° pour 360° avec caméra décalée.
    REMARQUE : L’analyse est automatiquement enregistrée.

5. Traitement d’images pour l’évaluation des paramètres microarchitecturaux osseux

  1. Téléchargez et installez le logiciel de reconstruction μCT pour la reconstruction d’images μCT.
  2. Sélectionnez le dossier du logiciel et double-cliquez pour ouvrir le logiciel.
  3. Sélectionnez une tranche dans les images μCT en cliquant sur une tranche d’image.
  4. Choisissez la destination du fichier de reconstruction. Sélectionnez Parcourir et créez un nouveau dossier nommé Recon. Le format de fichier sélectionné doit être BMP(8).
  5. Vérifiez la compensation de désalignement.
    REMARQUE : Habituellement, l’estimation est presque correcte, mais elle peut être ajustée manuellement pour décaler les images qui se chevauchent afin que les bords droit et gauche s’alignent aussi étroitement que possible.
  6. Sous Paramètres, appliquez les algorithmes Lissage, Renforcement du faisceau, Rotation CS et Artefacts d’anneau .
    REMARQUE : Il peut être utile de choisir l’image d’aperçu pour déterminer la clarté avant de reconstruire. Le réglage fin peut également être utile pour déterminer quels paramètres sont les meilleurs.
  7. Sélectionnez Démarrer pour commencer le traitement de la reconstruction.

6. Collecte de données microarchitecturales à partir d’images reconstruites

  1. Téléchargez et installez Dataviewer.
  2. Sélectionnez VOI et orientez l’échantillon pour qu’il s’aligne verticalement afin de faciliter l’analyse ultérieurement.
  3. Enregistrez la VOI modifiée dans un nouveau dossier.
  4. Téléchargez et installez CTAnalyser pour l’analyse des propriétés osseuses des paramètres microarchitecturaux.
    REMARQUE : La version gratuite de CTAnalyser est limitée en fonctionnalités, il est donc recommandé d’obtenir une licence complète.
  5. Divisez l’analyse en plaque sous-chondrale et en os trabéculaire en les enregistrant dans une plage d’images distincte.
    REMARQUE : Il n’est pas nécessaire de diviser l’analyse, mais comme la plaque sous-chondrale et l’os trabéculaire ont des caractéristiques différentes, des analyses distinctes peuvent aider à des mesures et à des comparaisons robustes.
  6. Sélectionnez la plage d’images à analyser, en commençant par la plaque sous-chondrale, en cliquant sur la tranche d’image par laquelle vous souhaitez commencer.
  7. Sélectionnez la région d’intérêt pour chaque image pour vous assurer qu’elle englobe l’os en cliquant sur l’onglet de la région d’intérêt.
  8. Sélectionnez l’onglet Sélection binaire . Ajustez l’histogramme de sorte que l’arrière-plan et l’os soient complètement séparés.
  9. Sélectionnez l’onglet Densité minérale osseuse (DMO). Enregistrez ces données dans un nouveau dossier de données d’analyse.
  10. Sélectionnez Traitement personnalisé et accédez à l’onglet Interne .
  11. Tout d’abord, effectuez le seuillage et sélectionnez Otsu automatique, puis Exécuter.
  12. Sélectionnez ensuite Supprimer les taches noires, puis Exécuter.
  13. Répétez l’opération Suppression des taches blanches et choisissez Supprimer les taches blanches, puis Exécuter.
  14. Choisissez Analyse 3D et sélectionnez Valeurs de base et Valeurs supplémentaires.
  15. Répétez les étapes 6.2.2 à 6.4.5 pour réinitialiser l’image pour l’analyse de l’os trabéculaire.
    REMARQUE : Assurez-vous que le fichier de sortie se trouve dans un nouveau dossier avec le même fichier que les données BMD.

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Résultats

Avant d’effectuer des injections intra-articulaires sur des animaux vivants, le protocole ci-dessus a été pratiqué sur trois cadavres de rats pour assurer le bon emplacement de l’injection. Au cours des séances d’entraînement, 50 μL de nouveau colorant bleu de méthylène à 70 % ont été injectés dans les deux articulations du genou en utilisant la méthodologie décrite ci-dessus. Cela équivaut à six injections d’entraînement. Après les injections, l’articulation du genou a été disséquée par incision à travers la face crânie...

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Discussion

Malgré les progrès récents dans le traitement symptomatique de l’arthrose, il y a une absence totale d’agents thérapeutiques qui préviennent l’apparition ou retardent la progression de l’arthrose24. À l’heure actuelle, le seul remède contre l’arthrose sévère est le remplacement articulaire, qui est coûteux, invasif et peut entraîner une morbidité et une mortalité pour les patients25. Par conséquent, il existe un besoin urgent de poursuivre la recherche sur des modèles anima...

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Remerciements

La recherche décrite dans ce manuscrit a été soutenue par les fonds de dotation de la chaire SmartState® de Caroline du Sud en matière de découverte de médicaments (PMW), la division des ressources animales de laboratoire de la MUSC et le centre de découverte de médicaments de la MUSC. Cette publication a également été soutenue par le National Center for Advancing Translational Sciences des National Institutes of Health sous les numéros de subvention TL1 TR001451 et UL1 TR001450, ainsi que par le National Institute of Dental & Craniofacial Research des National Institutes of Health sous le numéro de subvention R01DE029637.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
200 Proof EthanolDecon Laboratories2701agent stérilisant
3D. Logiciel SUITEBruker&mu ;-CT logiciel d’analyse
Betadine Surgical ScrubAvrio Health67618-151-16agent stérilisant
Seringue à insuline avec aiguilleUlticare91008pour effectuer des injections
IsofluranePiramal803249anesthésie animale
Neutral Buffered FormalinFisher Scientific23-427098Fix tissue
Nrecon SoftwareBruker&mu ;-CT logiciel de reconstruction
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30258.01agent de contrôle et de dilution
SkyScan 1176Brukerpour scanner des échantillons  ;

Références

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