Édition du génome CRISPR-Cas9 d’embryons de rats à l’aide d’un virus adéno-associé (AAV) et d’une électroporation d’embryons à 2 cellules

Résumé

Ce protocole présente une approche optimisée pour la production de modèles de rats génétiquement modifiés. Le virus adéno-associé (AAV) est utilisé pour fournir une matrice de réparation de l’ADN, et l’électroporation est utilisée pour délivrer des réactifs CRISPR-Cas9 afin de compléter le processus d’édition du génome dans un embryon à 2 cellules.

Résumé

La technologie d’édition du génome est largement utilisée pour produire des animaux génétiquement modifiés, y compris des rats. L’injection cytoplasmique ou pronucléaire de matrices de réparation de l’ADN et de réactifs CRISPR-Cas est la méthode d’administration la plus courante dans les embryons. Cependant, ce type de micromanipulation nécessite l’accès à du matériel spécialisé, est laborieux et nécessite un certain niveau de compétence technique. De plus, les techniques de micro-injection entraînent souvent une survie embryonnaire plus faible en raison du stress mécanique subi par l’embryon. Dans ce protocole, nous avons développé une méthode optimisée pour fournir de grands modèles de réparation de l’ADN qui fonctionnent en conjonction avec l’édition du génome CRISPR-Cas9 sans avoir besoin de micro-injection. Ce protocole combine l’administration d’ADN médiée par AAV de modèles de donneurs d’ADN simple brin avec l’administration de la ribonucléoprotéine (RNP) CRISPR-Cas9 par électroporation pour modifier les embryons à 2 cellules. À l’aide de cette nouvelle stratégie, nous avons réussi à produire des modèles ciblés de rats knock-in portant l’insertion de séquences d’ADN d’une taille de 1,2 à 3,0 kb avec des efficacités comprises entre 42 % et 90 %.

Introduction

Le développement d’outils d’édition du génome basés sur CRISPR a accéléré notre capacité à générer efficacement de nouveaux modèles de rats génétiquement modifiés plus sophistiqués. L’ARN guide unique, ainsi que la nucléase Cas9, sont combinés pour former des complexes ribonucléoprotéiques (RNP) qui ciblent les séquences d’ADN d’intérêt dans le génome et entraînent des cassures d’ADN double brin. Étant donné que les mécanismes de réparation de l’ADN cellulaire sont sujets aux erreurs, des insertions et des délétions (INDEL) sont introduites au cours du processus de réparation, ce qui peut perturber la fonction d’un gène cible. Lorsqu’il y a co-livraison d’une séquence....

Protocole

Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Missouri (protocole ACUC #25580) et ont été effectuées conformément aux directives énoncées dans le Guide pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire.

1. Livraison d’un modèle de réparation de l’ADN médié par l’AAV

1. Concevez la construction de l’ADN pour qu’elle contienne la séquence de knock-in souhaitée entre deux bras d’homologie. Les longueurs de bras d’homologie typiques sont de 300 à 500 pb de longueur. S’assurer que l’ensemble de la matrice de réparat....

Résultats

En suivant le protocole, il y a une administration efficace médiée par AAV du modèle de réparation de l’ADN, ce qui permet un HDR très efficace après que les embryons à 2 cellules aient été électroporés avec des RNP CRISPR-Cas9. Comme le montre la vidéo, un processus d’électroporation réussi entraîne la formation de bulles sur chaque électrode (Figure 2C) et l’impédance reste dans la plage de 0,100 à 0,300 kΩ. Après l’électroporation, il n’est pas rare que le.......

Discussion

Le système d’édition du génome CRISPR-Cas a révolutionné le domaine du génie génétique en permettant la production efficace de modifications génétiques personnalisées simples et complexes chez une variété d’espèces animales. Des raffinements et des améliorations fréquents dans les techniques associées à l’édition du génome renforcent sa polyvalence. Nous avons décrit ici une nouvelle approche utilisant l’administration d’ADN médiée par ssAAV ainsi que l’électroporation embryonnaire à 2 cellules de réactifs CRISPR-Cas9 da.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Sondes avec pinces crocodiles pour électrodes	NepaGene	C117
Huile minérale	MilliporeSigma	M5310
NepaGene21 Super Electroporator  ;	NepaGene	NEPA21
Électrodes à plaque de platine sur verre de lame	NepaGene	CUY501P1-1.5
PURedit Cas9 Protein	MilliporeSigma,	PECAS9
sgRNA (chimiquement modifié)	Synthego	N/A
ssAAV1 ou ssAAV6 modèle de réparation d’ADN emballé	Vectorbuilder	N/A