Utilisation de colorants à faible coût pour visualiser l’accumulation de glycogène et l’intégrité intestinale chez Caenorhabditis elegans

Résumé

L’enseignement des sciences biologiques peut être rendu plus stimulant pour les élèves par l’utilisation de l’expérimentation. Ce manuscrit présente deux protocoles différents mais complémentaires qui peuvent être utilisés en classe pour encourager les élèves à formuler et à tester des hypothèses liées aux régimes riches en calories, à la famine et au vieillissement.

Résumé

Caenorhabditis elegans (C. elegans) est un nématode transparent, non parasite, de biologie simple, ce qui en fait un excellent outil pour l’enseignement des sciences biologiques grâce à la coloration des cellules ou à leur contenu moléculaire. Le colorant Lugol (solution d’iode d’iodure de potassium) a été largement utilisé en biochimie pour colorer les réserves de glycogène. Dans ce contexte, il est possible d’observer des différences entre les animaux nourris et affamés, en plus des effets de différentes conditions, telles que des régimes alimentaires et des niveaux d’oxygène différents. L’érioglaucine est un colorant bleu qui indique la perte de la barrière intestinale. Lorsque la barrière intestinale est intacte, le colorant bleu tache à l’intérieur de la lumière ; Cependant, lorsque cette intégrité est perturbée, le colorant s’infiltre dans la cavité corporelle. À l’aide d’un stéréomicroscope ou d’un microscope, les enseignants peuvent démontrer des altérations physiologiques et biochimiques, ou ils peuvent inciter les élèves à poser une question scientifique et à émettre des hypothèses et à tester leur hypothèse à l’aide de ces tests. Le présent protocole décrit deux techniques de coloration chez C. elegans qui peuvent être facilement réalisées par les étudiants.

Introduction

L’enseignement des sciences biologiques au secondaire est un défi permanent. Notamment, l’accès et l’utilisation de la technologie ont apporté d’importantes avancées dans le processus d’enseignement-apprentissage, cependant, des outils tels que les chatbots d’intelligence artificielle rendent la rationalisation et la recherche de preuves plus difficiles en raison des réponses faciles (et parfois incorrectes) obtenues¹. Pour cette raison, l’utilisation d’une méthode scientifique avec une expérimentation pratique dans une approche basée sur l’enquête en classe est une stratégie importante pour développer ou stimuler la pensée critique, la créativité et les compétences techniques chez les élèves².

Dans ce contexte, le nématode libre Caenorhabditis elegans a été utilisé avec succès à des fins d’expérimentation à des fins pédagogiques³ en raison de ses avantages particuliers : ce n’est pas un parasite et l’Escherichia coli utilisé pour l’alimentation est de niveau de biosécurité-1, réduisant ainsi presque à zéro le risque biologique ; Il a un mouvement de locomotion élégant et quantifiable, qui est intéressant à observer pour les étudiants ; Et il est transparent, ce qui permet l’observation des organes, mais aussi la coloration avec des pigments qui peuvent indiquer la présence de biomolécules ou l’apparition d’altérations physiologiques⁴. Par conséquent, il est possible d’émettre des hypothèses et de tester en classe des postulations simples liées à la biochimie et aux changements physiologiques tels que le vieillissement.

Le glycogène est un glucide de stockage, formé d’une longue chaîne ramifiée de molécules de glucose formées par des résidus glucosyles avec des liaisons linéaires glycosidiques (1→4)-α et des liaisons glycosidiques (1→6)-α aux points de ramification et est particulièrement important pour la contraction musculaire, la différenciation cellulaire et le maintien de la glycémie⁵. Le glycogène est synthétisé après l’alimentation en raison de l’activation par l’insuline de l’enzyme glycogène-synthase. Pendant l’exercice ou le jeûne, l’épinéphrine ou le glucagon, respectivement, activent la glycogène phosphorylase et, par conséquent, décomposent le polysaccharide pour fournir du glucose-6-phosphate aux cellules musculaires ou libérer du glucose libre pour contourner l’hypoglycémie ^6,7. Les modifications des niveaux de glycogène ont un impact sur la différenciation cellulaire, la signalisation, la régulation redox et la souche dans diverses conditions physiologiques et physiopathologiques, y compris le cancer⁸. Chez C. elegans, le glycogène se trouve principalement dans les muscles de l’œsophage, l’hypoderme, l’intestin, les neurones et principalement dans les muscles de la paroi corporelle⁹. La teneur en glycogène peut être mesurée en utilisant la solution d’iode de Lugol, car l’iode se lie aux bobines hélicoïdales formant un complexe iode-glycogène, donnant une couleur bleu-noir ou brun-noir visible, qui a été utilisée avec succès pour démontrer la teneur en glycogène chez C. elegans¹⁰. Il a été démontré que l’accumulation de glycogène causée par une alimentation élevée en glucose peut réduire la durée de vie du ver, accélérant ainsi le processus de vieillissement^11,12. De plus, les perturbations métaboliques, d’autres hormones et l’exposition aux xénobiotiques peuvent également modifier le métabolisme du glycogène^13,14. Par conséquent, l’expérimentation sur la teneur en glycogène de C. elegans est très intéressante, car divers facteurs peuvent perturber son métabolisme et peuvent stimuler une discussion en classe sur la biochimie de base associée à des thèmes transversaux tels que l’exercice, les régimes alimentaires, les maladies et le vieillissement.

Le vieillissement est un déclin fonctionnel dépendant du temps causé par des dommages cellulaires. Ces dommages peuvent être associés au stress oxydatif, à l’attrition des télomères, à la perte de protéostasie, à l’inflammation et même à l’accumulation de corps polyglucosanes insolubles¹⁵, pour n’en nommer que quelques-uns. L’une des caractéristiques du vieillissement est la réduction de l’intégrité intestinale, associée à plusieurs affections chroniques qui surviennent au cours de la vie d’un organisme¹⁶. Le maintien de l’homéostasie intestinale dépend de l’intégrité de l’épithélium intestinal, qui est soutenu par des protéines jonctionnelles formant une barrière physique et reliant les cellules épithéliales adjacentes. Lorsque cet épithélium est endommagé, il y a une fuite de contenu luminal dans l’interstitium¹⁷. Sur la base de ce mécanisme, le test du schtroumpf a été utilisé pour vérifier l’intégrité intestinale dans plusieurs modèles animaux, car ce colorant bleu Erioglaucine sel disodique ne traverse pas la membrane intestinale, restant dans la lumière¹⁸. Lorsque les vers sont infectés par un agent pathogène, contaminés par des substances toxiques ou par l’âge, altérant l’intégrité interstitielle, le colorant traverse la barrière et se répand sur tout le ver, qui devient tout bleu. Ce test permet de discuter de la physiologie du vieillissement et d’expérimenter sur les facteurs qui peuvent accélérer ou retarder ce processus en exposant les vers à différentes conditions. Les protocoles ici décriront en détail ces deux méthodes à base de colorants qui peuvent être facilement mises en pratique en classe pour susciter et stimuler les étudiants à formuler et à tester des hypothèses liées à la biochimie et à la physiologie.

La première partie du protocole montre son applicabilité à l’analyse qualitative et quantitative de la teneur en glycogène dans le modèle¹⁰ de C. elegans. Le but de la deuxième partie du protocole est d’évaluer l’intégrité de l’intestin de C. elegans. Cette technique permet de suivre le vieillissement de C. elegans en évaluant l’intégrité des membranes intestinales. De plus, il permet d’évaluer si une substance accélère ou retarde le vieillissement et si des substances ont un potentiel toxique sur la barrière intestinale¹⁹.

La souche de C. elegans utilisée pour la présente étude était de type sauvage Bristol N2. Cependant, la procédure peut être reproduite en utilisant des souches qui présentent des taux de croissance comparables, ou la méthode doit être ajustée en fonction de la nécessité de remplacer l’équipement, étant donné qu’elles ont une fonction identique ou similaire, ou en fonction de la souche utilisée, car certaines souches ont des exigences spécifiques en matière d’entretien et/ou de sensibilité ; ces informations peuvent être obtenues auprès du Centre de génétique Caenorhabditis (CGC) ou du site Web WormBase. Ces modifications ne devraient pas avoir d’impact sur la reproductibilité de la méthode.

Protocole

REMARQUE : La bactérie Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) et les souches sauvages de Bristol N2 peuvent être obtenues auprès du CGC, Université du Minnesota, États-Unis, ou grâce à un don d’un laboratoire de C. elegans . Pour la sécurité des chercheurs, il est impératif d’utiliser des équipements de protection individuelle. Bien que les concentrations de réactifs comme l’hypochlorite et l’hydroxyde de sodium soient faibles, il est essentiel de porter l’EPI recommandé, comme souligné dans le manuscrit, afin de minimiser les risques potentiels associés à ces produits chimiques.

1. Teneur en glycogène

1. Préparation des plaques d’essai
   1. Préparez^{six plaques de} gélose NGM de 60 mm x 15 mm (10 mL de gélose gélose au milieu de croissance des nématodes, NGM, comme décrit dans le tableau supplémentaire 1) par souche de ver et laissez-les sécher pendant 1 jour à température ambiante. Gardez les plaques fermées pour éviter toute contamination.
   2. Ajouter 200 μL de culture liquide d’E. coli OP50 (avec une densité optique = 0,600, environ à une longueur d’onde de 600 nm) par plaque pour inoculer un total de quatre plaques NGM de 60 mm x 15 mm par souche dans la hotte d’écoulement. Laisser incuber les plaques fermées à 37 °C pendant 1 jour avant utilisation.
      REMARQUE : Préparez six plaques (étape 1.1), mais n’en inoculez que 4 avec la bactérie E. coli OP50. Réservez les deux plaques restantes à 4 °C pour une utilisation ultérieure lorsque vous placez les vers dans des conditions de famine. Cette analyse peut être effectuée en double.
   3. Le jour de l’essai, ajouter 200 μL de D-glucose 0,025 M à deux plaques de gélose NGM (6 mm x 15 mm) par souche qui ont déjà été ensemencées avec la bactérie E. coli OP50. Laissez sécher les plaques à température ambiante dans la hotte d’évacuation.
      REMARQUE : Les plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 peuvent également être séchées à proximité de lampes à alcool comme alternative à l’utilisation d’une hotte à flux.
2. Synchronisation
   1. Environ 3 jours avant la synchronisation, transférez 3 à 4 morceaux (3 cm x 3 cm) d’une gélose d’entretien NGM avec C. elegans Bristol N2 (type sauvage) à différents stades (environ 500 vers par morceau) dans une nouvelle plaque (150 mm x 90 mm) qui a été préalablement ensemencée avec la bactérie E. coli OP50.
   2. Placez la nouvelle plaque avec les vers dans un environnement contrôlé à 20 °C et maintenez l’humidité >95% pendant 3 jours (72 h permettent à la plupart des vers d’atteindre le stade adulte gravide).
      REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster la température de croissance en fonction de la ou des souches de C. elegans utilisées.
   3. À l’aide d’une pipette Pasteur, prélever les vers de la plaque préparée avec du H₂O distillé et les transférer dans un tube à centrifuger de 50 ml.
   4. Attendez la sédimentation des vers par gravité (environ 15 min) puis retirez le surnageant. Répétez ce processus 3 fois pour éliminer les bactéries. Après le dernier lavage, réduisez le volume à 5 ml.
   5. Ajouter 10 ml de solution de blanchiment (tableau supplémentaire 1) et agiter vigoureusement avec les mains pendant environ 6 minutes.
   6. Immédiatement après la fin de l’agitation, remplissez les tubes à une capacité de 50 ml avec un tampon M9.
   7. Centrifugez à 1400 x g pendant 3 min, retirez le surnageant jusqu’à 5 mL, puis ajoutez à nouveau 45 mL de tampon M9. Répétez ce processus 4 fois.
   8. Après le dernier lavage, réduisez le volume à 15 mL et maintenez-le à une température (20 °C) et une humidité (>95 %) contrôlées pendant environ 14 h.
      REMARQUE : Le processus de synchronisation peut être remplacé par l’obtention d’œufs par ponte : Transférer environ 20 vers gravides adultes sur une plaque NGM (6 mm x 15 mm) préalablement ensemencée avec 200 μL d’E. coli OP50. Laissez les vers pondre des œufs pendant 1 jour. Après cela, retirez les vers enceintes et attendez que les œufs éclosent.
3. Préparation des vers
   1. À l’aide d’une pipette automatique, ajoutez 10 μL de vers synchronisés (étape 1.2.8) à une lame de microscope et comptez le nombre de vers. Calculez le volume à pipeter pour obtenir 500-1000 vers/μL.
   2. Transvaser 500 à 1000 vers synchronisés L1 (étape 1.2.8) dans des plaques de gélose NGM (150 mm x 90 mm, tableau supplémentaire 1) ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 comme source de nourriture, jusqu’à ce qu’elles atteignent le stade larvaire 4 (L4) à 20 °C.
      REMARQUE : Les vers peuvent être transférés à l’aide d’une pipette automatique. Si vous ne disposez pas d’une pipette automatique, utilisez une pipette Pasteur en verre, et les volumes peuvent être contrôlés à l’aide d’étiquettes à microtubes ou de pipettes graduées en verre.
   3. Après 48 h de synchronisation²⁰ : prélever les larves L4 sur les plaques avec le tampon M9 (tableau supplémentaire 1), à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique jusqu’à un tube conique propre de 50 mL et les laver 3 fois avec du tampon M9 frais ou répéter les lavages jusqu’à ce que toutes les bactéries E. coli OP50 restantes soient complètement éliminées (à température ambiante).
      REMARQUE : L’étape de lavage est importante car certains vers souffriront de famine pendant la procédure.
4. Exécution du test
   1. Transvaser 500 à 1000 vers L4 (étape 1.3.1) à partir de chacune des nouvelles plaques de gélose NGM (60 mm x 15 mm) précédemment préparées (étapes 1.1.2 et 1.1.3). Maintenez-les à 20 °C pendant 48 h jusqu’au jour du test. Ce calendrier aboutira à trois groupes expérimentaux comme suit, en double (Figure 1) :
      A- (famine) : les vers se développeront sur des plaques de gélose NGM régulières sans la bactérie E. coli OP50 ;
      B- (régulier) : les vers se développeront sur des plaques de gélose NGM régulières ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 ;
      C- (taux élevé de glucose) : les vers se développeront sur des plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 et contenant 0,025 M de D-glucose.
   2. Le jour du test (après 48 h) : récupérez les vers et faites-les passer trois brèves fois dans le tampon M9 (étapes 1.2.2 et 1.2.3)
      REMARQUE : Ici, préparez des plaques de gélose NGM avec l’ajout de D-glucose (étape 1.3) et mettez-les de côté jusqu’à ce qu’il soit temps d’ajouter les vers.
      1. Coloration à l’iode : préparer une solution d’iode de Lugol à 5 % (v/v) (solution d’iode/iodure de potassium) à l’aide d’un tampon M9 frais.
         REMARQUE : La solution d’iode de Lugol peut être obtenue auprès de fournisseurs de réactifs locaux ou de pharmacies, donc la concentration initiale peut varier. Si nécessaire, calculez pour obtenir une solution à 5 % (v/v).
   3. Transférez environ 100 μL de vers lavés (étape 4.2) de chaque groupe dans le microtube de 1,5 mL contenant une solution de Lugol diluée (5 % v/v). À l’aide d’une pipette automatique dans une proportion de 1:5, transférez 100 μL de vers dans 400 μL de solution de Lugol, puis agitez doucement dans un mélangeur pendant 5 min.
      REMARQUE : Si un mélangeur n’est pas disponible, il est possible de secouer soigneusement les microtubes à la main.
   4. Juste après ces 5 min, centrifuger le microtube de 1,5 mL (vers + solution de Lugol) à 1400 x g pendant 3 min.
      REMARQUE : Si ce test est effectué sur des vers de l’étage L4 ou au-delà, il est possible d’obtenir une sédimentation par gravité au lieu d’utiliser une centrifugeuse. Laissez les microtubes ouverts dans des grilles sur la paillasse pendant 10 minutes jusqu’à ce que tous les vers se soient déposés au fond du microtube.
   5. Retirez le surnageant et lavez les vers avec 1,0 mL de tampon M9 frais. Répétez le lavage jusqu’à ce que tout l’iode restant soit retiré de la solution (minimum 3x).
   6. Après la dernière étape de lavage, retirez le surnageant, à l’exception d’un résidu d’environ 100 μL. Utilisez-le pour remettre doucement les vers en suspension et pour une analyse microscopique.
   7. Transférez environ 50 μL de la solution de ver en suspension sur des lames de microscopie et couvrez-les avec des lamelles. Observez les images en fond clair à l’aide d’un stéréomicroscope (à 1,5x).
      REMARQUE : Si un stéréomicroscope n’est pas disponible, un microscope ordinaire peut être utilisé et les images peuvent être capturées avec l’appareil photo d’un téléphone portable (à 3,4x) à l’aide d’un adaptateur. Pour éviter les erreurs de lumière, de luminosité et d’exposition, il est essentiel que tous les paramètres de l’appareil photo du téléphone portable restent cohérents pour toutes les photos.
5. Inspection des données
   1. Données quantitatives : Calculez la teneur en glycogène sur la base de la coloration à l’iode des vers.
      1. Enregistrez les images du stéréomicroscope contenant un minimum de 10 vers par groupe dans un fichier .jpeg pour un traitement ultérieur. Pour ce faire, téléchargez le logiciel gratuit ImageJ. Les détails sont fournis dans le Fichier supplémentaire 1, la Figure supplémentaire 1, la Figure supplémentaire 2.
      2. Ouvrez l’image .jpeg à l’aide du logiciel ImageJ (qui peut être téléchargé gratuitement sur https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Cliquez sur Ligne segmentée et tracez le contour du ver (un ver à la fois). Cliquez sur Analyser, puis sélectionnez Mesurer pour obtenir la quantification de la tache. Les données seront affichées sous forme de moyenne dans le tableau. La moyenne indique les données calculées à partir de la densité de coloration par surface de ver.
   2. Données qualitatives : Obtenez des images du stéréomicroscope de chaque groupe et comparez visuellement la coloration des vers. Créez un système de notation, si nécessaire, pour analyser la coloration : 0 incolore ; 1 légèrement taché ; 2 tachés et 3 fortement tachés. À l’aide du stéréomicroscope, comptez manuellement environ 10 vers par groupe (minimum) à l’aide d’un compteur manuel.

Figure 1 : Schéma de dosage de la teneur globale en glycogène chez C. elegans. Un schéma de l’expérience réalisée ici pour réaliser le dosage de la teneur en glycogène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Évaluation de la perméabilité intestinale

1. Préparation des vers
   1. Environ 14 h après la synchronisation (étape 1.2.8), transférez de 500 à 1000 vers (étape 1.3.1 et REMARQUE) au premier stade larvaire (L1) dans chaque nouvelle plaque de gélose NGM (60 mm x 15 mm) préalablement préparée et maintenez-les à 20 °C jusqu’au jour de l’essai. Ce calendrier mènera à deux groupes expérimentaux comme suit (Figure 2) :
      A- (jeune) : les vers vont se développer sur des plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 jusqu’au stade larvaire 4 (L4) ;
      B- (vieux) : les vers vont se développer sur des plaques de gélose NGM ensemencées avec la bactérie E. coli OP50 jusqu’au 7^ème jour de l’âge adulte.
      REMARQUE : Les vers maintenus jusqu’au 7^e jour de l’âge adulte doivent être lavés avec un tampon M9 tous les jours et transférés dans de nouvelles plaques de gélose NGM (60 mm x 15 mm) avec 200 μL de bactéries E. coli OP50 préalablement ensemencées pour le remplacement de la nourriture et l’élimination de la progéniture. Les vers plus jeunes flottent pendant la décantation et peuvent être séparés en éliminant le surnageant. La proportion de vers schtroumpfs augmente avec l’âge. Cependant, l’évaluation de la perméabilité intestinale peut être effectuée à n’importe quel stade et à n’importe quel âge, en fonction de l’objectif de l’étude.
2. Exécution du test
   1. Le jour de l’essai, prélever les vers L4 (2 jours après l’étape 2.1.1) et les vers adultes le 7^e jour (maintenant dans leur 9^e jour) avec un tampon M9 (tableau supplémentaire 1) et transférer dans des microtubes de 1,5 ml marqués.
   2. Centrifuger à 1400 x g pendant 3 min, retirer le surnageant, ajouter 1,0 mL de M9 et mélanger délicatement. Répétez ce processus 3 fois pour éliminer les bactéries. Après le dernier lavage, réduisez le volume à 500 μL.
   3. À l’aide d’une pipette automatique, ajoutez 10 μL de sédiments de vers à une lame de microscope et comptez le nombre de vers. Calculer le volume à pipeter pour obtenir 100 vers/μL.
   4. Coloration par schtroumpf : préparer une solution de sel disodique d’érioglaucine à 25 % (tableau supplémentaire 1) avec de l’eau distillée. Si nécessaire, utilisez le vortex pour une meilleure solubilisation.
   5. Dans les nouveaux microtubes précédemment identifiés, à l’aide d’une pipette automatique, ajouter le volume contenant 100 vers, 100 μL de solution de sel disodique d’érioglaucine à 25 %, 200 μL d’E. coli OP50 et compléter avec le tampon M9 pour un volume final de 500 μL.
      REMARQUE : Les volumes d’Erioglaucine disodique, d’E. coli et le nombre de vers sont fixes. Le volume du tampon M9 est variable et peut être utilisé pour porter le volume final à 500 μL.
   6. Incuber pendant 3 h avec agitation dans un mélangeur, à l’abri de la lumière, à température ambiante.
      REMARQUE : Si un mélangeur n’est pas disponible, secouez soigneusement les microtubes avec vos mains toutes les 15 minutes.
   7. Après 3 h, centrifuger le microtube de 1,5 mL à 1400 x g pendant 3 min. Retirer 1,0 mL de surnageant et laver les vers avec 1,0 mL de tampon M9.
   8. Répétez les lavages jusqu’à ce que la solution de sel disodique d’érioglaucine restante soit retirée de la solution. Après la dernière étape de lavage, retirez le surnageant, à l’exception d’un résidu d’environ 250 μL. Utilisez-le pour remettre soigneusement les vers en suspension et les traiter pour une analyse microscopique.
   9. Transférez environ 50 vers de la solution de vers en suspension sur des lames de microscopie et couvrez-les de lamelles. Incuber les lames de microscopie au réfrigérateur à -20 °C pendant 10 min pour paralyser les vers.
      REMARQUE : Une autre alternative pour paralyser les vers est d’ajouter 10 μL de solution de chlorhydrate de lévamisole (10 mM ; Tableau supplémentaire 1) et couvrez-les de lamelles.
   10. Observez et comptez le nombre total de vers et les vers totalement teints à l’aide du champ clair d’un stéréomicroscope (à 1,5x). Les images peuvent être obtenues à partir d’un appareil photo de téléphone portable (à 3,4x) couplé à un adaptateur. Pour éviter les erreurs de lumière, de luminosité et d’exposition, il est essentiel que tous les paramètres de l’appareil photo du téléphone portable restent cohérents pour toutes les photos.
3. Inspection des données
   1. Données qualitatives : Obtenir des images au stéréomicroscope de chaque groupe (L4 et 7^e jour de l’âge adulte) et comparer visuellement la coloration des vers.
   2. Comptez le nombre total de vers et le nombre de vers schtroumpfs (vers bleus) à l’aide d’un stéréomicroscope.
   3. Exprimer les résultats en pourcentage de vers schtroumpfs en comparant les jeunes vers (L4, en groupe témoin) et les vieux vers (7^e jour de l’âge adulte) :
      A x X = 100 (%) x B
      X = 100 x B / A
      Où, A = nombre total de vers
      B= nombre de vers schtroumpfs

Figure 2 : Schéma du test de perméabilité intestinale globale chez C. elegans. (A) Préparation de C. elegans. (B) Coloration au sel disodique d’érioglaucine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Le dosage de la teneur en glycogène fournit une méthode robuste et rapide pour cribler diverses conditions d’essai, telles que des études comparatives de différentes souches susceptibles d’influencer la synthèse ou la dégradation du glycogène. Dans cette étude, les vers L4 ont été soumis à trois conditions de test distinctes : le jeûne, l’alimentation et les groupes enrichis en glucose. Le test a été effectué trois fois, chaque condition étant reproduite deux fois dans chaque test ; une image représentative est illustrée à la figure 3. Après chaque essai, des vers colorés avec la solution d’iode de Lugol ont été observés à l’aide d’un stéréomicroscope, et une comparaison qualitative a été faite entre les groupes concernant la coloration des vers. En termes d’observation visuelle, les vers du groupe à jeun (famine) présentaient une coloration moins intense par rapport aux vers nourris avec E . coli OP50 (régulier), ainsi qu’à ceux nourris avec E . coli OP50 et D-glucose (glucose élevé). De plus, les vers nourris avec E. coli OP50 et D-glucose (glucose élevé) ont présenté la coloration la plus intense.

Figure 3 : Images représentatives du dosage de la teneur en glycogène. Les niveaux de glycogène chez C. elegans ont été évalués par coloration à l’iode. Les images microscopiques montrent des vers représentatifs de C. elegans soumis à (A) une famine, (B) à des conditions normales ou (C) à une glycémie élevée pendant 48 heures. Les vers ont été colorés en les immergeant dans une solution de tampon iode/M9 de Lugol (1%) pendant 5 min, en suivant la procédure détaillée à l’étape 1.4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les résultats de la perméabilité intestinale montrent la différence de coloration des jeunes vers (L4) avec un intestin intact et des vers âgés (7^ème jour de l’âge adulte) avec des membranes intestinales endommagées par le vieillissement (Figure 4). L’intestin de C. elegans est un tissu d’une importance capitale pour la santé, car il joue un rôle essentiel dans la digestion et le métabolisme et sert de centre de signalisation pour la réponse au stress et la régulation du vieillissement²¹. Chez les jeunes vers, l’intestin de C. elegans est constitué d’une barrière solide qui empêche la fuite du contenu intestinal. Cependant, à mesure que ces vers vieillissent, la fonction de barrière intestinale diminue et devient plus sensible aux perturbations dues à la dégradation progressive des cellules et des microvillosités et à l’accumulation de bactéries dans l’intestin vieillissant^21,22. Lorsque les jeunes C. elegans ingèrent le colorant Erioglaucine disodium sel, l’intestin du nématode est coloré (Figure 4A). D’autre part, il est possible d’observer que les vers âgés présentaient une extravasation du colorant, imprégnant tout le corps du ver, ce qui indique une lésion de la membrane intestinale (Figure 4B).

Figure 4 : Image représentative de la coloration de C. elegans au sel disodique d’érioglaucine. L’image microscopique montre C. elegans avec un intestin intact (stade L4) et des vers avec un intestin rompu (7^e jour de l’âge adulte). Les vers ont été colorés par immersion dans une solution de sel disodique d’érioglaucine à 25 % pendant 3 h, après l’étape 2.2.4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Capture d’écran d’ImageJ pour sélectionner le contour de C. elegans . Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Capture d’écran d’ImageJ pour le calcul de la moyenne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Recettes de milieux, de tampons et de culture. Composition des différents milieux, tampons et cultures utilisés dans le protocole actuel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 1 : Description détaillée du logiciel ImageJ pour la quantification de la teneur en glycogène des vers. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

En résumé, ce protocole fournit une évaluation qualitative de la teneur en glycogène chez les vers C. elegans individuels à l’aide de la coloration Lugol : un test simple, robuste et rapide. La coloration Lugol est une approche sans marquage et non invasive qui facilite l’acquisition de données moléculaires à des résolutions subcellulaires, permettant de surveiller les fluctuations de la teneur en glycogène au sein d’un seul ver¹⁰. De plus, le test offre l’avantage de la rentabilité en raison de ses exigences minimales en matière d’équipement. Seul un microscope ou un stéréomicroscope est nécessaire pour capturer les images, qui peuvent être facilement obtenues à l’aide de l’appareil photo d’un téléphone portable, à condition d’avoir les mêmes paramètres de lumière, de luminosité et d’exposition pour toutes les images. De plus, certaines modifications procédurales peuvent améliorer l’efficacité de ce protocole. Des équipements de laboratoire plus complexes, tels qu’une hotte à flux et une centrifugeuse, peuvent être remplacés par des lampes à alcool et une sédimentation par gravité. Ces alternatives rendent la méthode encore plus économique et accessible à un large éventail de chercheurs. En plus des chercheurs, les éducateurs peuvent également utiliser ce test à des fins éducatives dans les écoles pour illustrer les changements associés au stockage du glycogène et à sa biosynthèse.

Bien que les tests enzymatiques conventionnels puissent quantifier les niveaux de glycogène, la coloration Lugol est prometteuse en tant que méthode sensible, précise, rentable et à haut débit pour évaluer les réserves de glycogène chez C. elegans. Dans notre étude, les données ont révélé des différences notables dans la coloration entre les trois conditions, suggérant une corrélation potentielle entre les conditions d’alimentation et l’intensité de la coloration. En d’autres termes, il indique des variations de teneur en glycogène entre les différents groupes d’alimentation, car l’intensité de la coloration est directement proportionnelle à la teneur en glycogène. À l’aide de ces observations et preuves initiales, les élèves peuvent se renseigner et déterminer si divers facteurs, tels que différents aliments, boissons ou réactifs chimiques, peuvent également influencer la teneur en glycogène des nématodes.

L’un des inconvénients de cette approche provient de son recours à des procédures manuelles et à une interprétation subjective. La nature subjective de l’évaluation de la coloration, où les scores sont attribués en fonction de l’observation visuelle, peut entraîner une variabilité entre les différents analystes, ce qui peut introduire des fluctuations dans l’interprétation des résultats.

Ce rapport démontre également l’évaluation de l’intégrité intestinale de C. elegans à l’aide du colorant sel disodique d’érioglaucine. Il est possible d’évaluer la perte de la fonction de barrière intestinale chez C. elegans en nourrissant les vers avec un colorant bleu qui n’est pas absorbable par la cuticule. Ce test permet de vérifier s’il n’y a pas de fuite de colorant hors de l’intestin, un test connu sous le nom de test du schtroumpf car les animaux deviennent bleus comme le dessin animé Schtroumpfs²³. Cette méthodologie a déjà été appliquée à Drosophila melanogaster et Danio rerio en utilisant une méthode similaire pour l’évaluation intestinale^24,25. Chez C. elegans, nous avons utilisé le même principe de la technique avec le sel disodique Erioglaucine, étant considéré comme une technique simple et reproductible pour vérifier l’intégrité intestinale de C. elegans^19,26.

Ce protocole peut être utilisé pour évaluer l’induction ou le retard du vieillissement des nématodes et également pour vérifier le potentiel toxique des substances dans l’intestin de C. elegans de manière simple et rapide, sans avoir besoin d’utiliser un équipement complexe, ce qui rend la méthode économiquement viable^19,27. En plus de son utilisation dans la recherche scientifique, les enseignants peuvent également utiliser ce test à des fins éducatives dans les établissements d’enseignement pour étudier les changements dans la perméabilité intestinale de C. elegans. Avec un simple test, il est possible d’étudier des hypothèses sur le vieillissement et l’effet des réactifs chimiques sur la barrière intestinale des nématodes.

L’essai peut être adapté pour utiliser d’autres souches et stades larvaires de C. elegans en fonction de l’objectif de l’étude, à condition que les substituts remplissent la même fonction ou une fonction similaire pour maintenir la reproductibilité de la méthode. Pour une analyse réussie, il est important que les vers âgés soient colorés pendant 3 h, comme mentionné dans le protocole. Par la suite, les lavages pour éliminer l’excès de colorant sont une étape critique de la méthode et doivent être effectués avec soin afin que les vers ne soient pas éliminés en même temps que le surnageant. Dans le cas de l’évaluation de substances, l’une des limites du protocole est la difficulté de trouver un témoin positif facilement accessible qui lyse la membrane intestinale des nématodes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes de 1,5 ml  ;	Fournisseurs	locaux-Incubateur
à 37 degrés	KS 4000i  ;	97014-816
Tube conique de 50 mL	Fournisseurs	locaux-Plaques
de Petri de 6 cm  ;	Fournisseurs	locaux-Agar
	bactériologique Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; nea Ltda.	9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (type sauvage)	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, États-Unis)	-
CaCL2	Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; nea Ltda.	10035-04-8
Cholestérol	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	57-88-5
D-(+)-Glucose anhydre  ;	Neon	50-99-7
Distilled H2O	Fournisseurs
sel disodique	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	3844-45-9
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)	-
Hotte à flux	Mylabor
Incubator	Panasonic Healthcare Company d’Amérique du Nord, MIR-254-PA.	-
KH2PO4	Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; nea Ltda.	7778-77-0
Chlorhydrate de lévamisole	RIPERCOL L 150F-Lugol
	solution Sigma-Aldrich Brasil Ltda	L6146
MgSO4	Synth	S1063-01-AH
Microcentrifugeuse	Centrifugeuse 5425R Eppendorf SE, Allemagne
Na2HPO4	Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; nea Ltda.	7558-79-4
NaCl	Dinâ ; mica Quí ; mica Contemporâ ; nea Ltda.	7647-14-5
Nystatine	Sigma-Aldrich Brasil Ltda	N6261
Peptone bactériologique	ê ; xodo cientí ; fica	91079-38-8
Stéréomicroscope	Leica S8 Apo Stereomicroscope (Sã ; o Paulo, Brésil)
Sulfate de streptomycine	Estreptomax	-