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Article de méthode

Dosage immunologique portable sur papier combiné à une application pour smartphone pour la détection colorimétrique et quantitative de l’antigène NS1 de la dengue

2.7K vues

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DOI :

10.3791/66130

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26 janvier 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, Universitas Islam Indonesia, 2School of Bioresources and Technology, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 3Department of Otolaryngology, Phramongkutklao Hospital and College of Medicine, 4Sensor Technology Laboratory, Pilot Plant Development and Training Institute, King Mongkut's University of Technology Thonburi, 5Biosciences and Systems Biology Research Team, National Center for Genetic Engineering and Biotechnology, National Sciences and Technology Development Agency at King Mongkut's University of Technology Thonburi

Dans cet article

Résumé

Pour répondre aux besoins urgents de diagnostic de la dengue, nous présentons ici un dispositif d’analyse sur papier Dengue NS1 intégré à une application pour smartphone (DEN-NS1-PAD) pour quantifier la concentration de l’antigène NS1 de la dengue dans les échantillons cliniques de sérum/sang. Cette innovation améliore la gestion de la dengue en aidant à la prise de décision clinique dans divers contextes de soins de santé, même ceux aux ressources limitées.

Résumé

L’infection par le virus de la dengue (DENV), qui est transmise par les moustiques Aedes , est un problème majeur de santé publique dans les pays tropicaux et subtropicaux. Avec une incidence annuelle d’environ 10 millions de cas et 20 000 à 25 000 décès, en particulier chez les enfants, il est urgent de disposer d’outils de diagnostic pratiques. La présence de la protéine non structurelle 1 (NS1) de la dengue au début de l’infection a été liée à la libération de cytokines, aux fuites vasculaires et au dysfonctionnement endothélial, ce qui en fait un marqueur potentiel de la dengue sévère.

Les immunoessais sur papier tels que les tests à flux latéral (LFA) et les dispositifs d’analyse microfluidiques sur papier (PAD) ont gagné en popularité en tant que tests de diagnostic en raison de leur simplicité, de leur rapidité, de leur faible coût, de leur spécificité et de leur facilité d’interprétation. Cependant, les immunotests conventionnels sur papier pour la détection de la dengue NS1 reposent généralement sur une inspection visuelle, ne donnant que des résultats qualitatifs. Pour remédier à cette limitation et améliorer la sensibilité, nous avons proposé un test de détection de la dengue NS1 hautement portable sur un dispositif analytique sur papier (PAD), à savoir DEN-NS1-PAD, qui intègre une application pour smartphone comme lecteur colorimétrique et quantitatif. Le système de développement permet de quantifier directement les concentrations de NS1 dans les échantillons cliniques.

Des échantillons de sérum et de sang prélevés sur les patients ont été utilisés pour démontrer les performances du prototype du système. Les résultats ont été obtenus immédiatement et peuvent être utilisés pour une évaluation clinique, à la fois dans des établissements de santé bien équipés et dans des environnements à ressources limitées. Cette combinaison innovante d’un immunodosage sur papier et d’une application pour smartphone offre une approche prometteuse pour améliorer la détection et la quantification de l’antigène NS1 de la dengue. En augmentant la sensibilité au-delà des capacités de l’œil nu, ce système présente un grand potentiel pour améliorer la prise de décision clinique dans la prise en charge de la dengue, en particulier dans les zones reculées ou mal desservies.

Introduction

L’infection par le virus de la dengue (DENV) est la maladie transmise par les moustiques qui se propage le plus rapidement1, et plus de 390 millions de personnes sont infectées par 96 millions d’infections symptomatiques, 2 millions de cas de maladie grave et plus de 25 000 décès par an surviennent dans le monde 1,2. Selon l’Organisation mondiale de la santé (OMS), environ 3,9 milliards de personnes sont exposées au risque de dengue ; ~70 % vivent dans les pays d’Asie-Pacifique et principalement en Asie du Sud-Est3. En 2019, le nombre de cas de dengue notifiés à l’OMS était de 4,2 millions, et la Thaïlande a contribué à au moins 136 000 cas de dengue et 144 cas de décès dus à l’infection par la dengue4. L’épidémie de dengue en Thaïlande se produit pendant la saison des pluies, d’avril à décembre, dans les zones urbaines et rurales, en particulier dans la région nord-est.

Les infections à DENV ont différentes manifestations cliniques allant des symptômes subcliniques, de la dengue légère à la dengue hémorragique sévère. La principale caractéristique de l’état sévère de DHF est une perméabilité vasculaire accrue suivie d’un choc et d’un dysfonctionnement des organes1. Comprendre la voie moléculaire qui peut causer la fuite vasculaire est très important pour développer des traitements efficaces contre la dengue. La protéine non structurale 1 (NS1) de la dengue est une glycoprotéine sécrétée au début de l’infection virale 5,6, et elle fonctionne comme un cofacteur pour la réplication de l’ARN viral7. NS1 peut déclencher la libération de cytokines et contribuer à la fuite vasculaire en se liant au récepteur de type Toll 4 (TLR4) et au glycocalyxendothélial 8,9. La recherche in vitro a montré que NS1 interagit avec les cellules endothéliales et induit l’apoptose. Cette condition peut contribuer à un dysfonctionnement endothélial et à une fuite vasculaire10. Les taux d’antigène NS1, corrélés aux taux sériques d’interleukine (IL)-10, ont augmenté de manière significative chez les patients atteints d’une maladie clinique sévère11. La dengue NS1 contribue également à la pathogenèse de la maladie en induisant l’IL-10 et en supprimant les réponses des lymphocytes T spécifiques à la DENV12,13. De plus, la protéine NS1 de la dengue était liée à une maladie clinique grave, et la concentration de NS1 > 600 ng mL-1 au cours des 3 premiers jours de la maladie était associée au développement de DHF14.

La persistance de l’antigène NS1 de la dengue chez les patients atteints de DHF pourrait être utilisée comme marqueur de la dengue sévère6. Il existe plusieurs méthodes pour détecter la NS1 dans les échantillons cliniques, telles que le test immuno-enzymatique (ELISA) et le test rapide15. La méthode ELISA est l’étalon-or pour mesurer la concentration de protéines NS1 en milieu clinique. Cependant, la méthode ELISA est coûteuse et nécessite du personnel qualifié et des installations de laboratoire16. Par conséquent, le développement de la technologie de détection et de quantification des protéines NS1 dans le test au point de service (POCT) est toujours en cours. Au cours de la dernière décennie, les immunoessais sur papier tels que les tests à flux latéral (LFA) et les dispositifs d’analyse microfluidique sur papier (μPAD) sont devenus populaires comme tests de diagnostic en raison de leur simplicité, de leur rapidité, de leur faible coût et de leur spécificité 17,18,19. Dans un immunoessai sur papier, plusieurs marqueurs ont été utilisés pour générer des signaux, tels que des nanoparticules d’or (AuNPs)20, des nanoparticules magnétiques21,22, des points quantiques23 et des matériaux de fluorescence24,25. Les AuNP sont les étiquettes les plus couramment utilisées dans les immunoessais sur papier en raison de leur faible coût de production, de leur facilité de fabrication, de leur stabilité et de leur lecture simple. Actuellement, les tests à flux latéral (LFA) pour la dengue NS1 sont utilisés en milieu clinique26,27. Cependant, la détection conventionnelle des étiquettes LFA se fait généralement à l’œil nu et ne fournit que des résultats qualitatifs.

Au cours de la dernière décennie, plus de 5 milliards de smartphones ont été largement utilisés dans le monde, et il existe un potentiel de développement de la détection portable28,29. Les smartphones ont des capacités multifonctionnelles telles que des capteurs physiques intégrés, des processeurs multicœurs, des appareils photo numériques, des ports USB, des ports audio, des logiciels sans fil et des logiciels d’application, ce qui les rend adaptés à une utilisation dans diverses plates-formes de biocapteurs30. De plus, les technologies sans fil permettent d’envoyer rapidement des données et peuvent être utilisées pour une surveillance en temps réel et sur site31. Mudanyali et al. ont combiné le test immunologique sur papier et les smartphones pour développer une plate-forme POCT portable, sans équipement, rapide, peu coûteuse et conviviale pour le paludisme, la tuberculose et le VIH32. Ling et al. ont rapporté un test à flux latéral combiné à l’appareil photo d’un smartphone pour détecter quantitativement l’activité de la phosphatase alcaline dans le lait33. Hou et al. ont également développé un système d’imagerie à double modalité basé sur un smartphone pour les signaux quantitatifs de la couleur ou de la fluorescence dans le test à flux latéral34. De plus, l’utilisation du smartphone comme lecteur colorimétrique et quantitatif peut améliorer la sensibilité alors que l’œil nu ne peut pas signaler avec certitude la présence de la cible35.

Présentant une percée dans le diagnostic de la dengue, le DEN-NS1-PAD 36,37,38 (ci-après dénommé l’appareil) offre une solution portable et efficace. Utilisant une technologie à base de papier microfluidique imprimé à la cire, ce dispositif quantifie NS1 avec une sensibilité et une spécificité élevées grâce au traitement d’image. Pour améliorer encore son utilité, nous avons développé une application conviviale pour smartphone pour la lecture colorimétrique et quantitative. La validation clinique à l’aide d’échantillons de patients provenant d’hôpitaux thaïlandais souligne son impact immédiat sur l’évaluation des patients en temps réel. Notre innovation marque une avancée cruciale dans la gestion rationalisée de la dengue au point d’intervention, promettant de révolutionner les diagnostics dans les paysages de soins de santé aux ressources limitées.

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Protocole

Le comité d’éthique du comité d’examen institutionnel du département médical de l’armée royale thaïlandaise, hôpital Phramongkutklao, Bangkok, Thaïlande (IRBRTA 1218/2562) a accordé son approbation. En réalisant cette étude, nous avons respecté toutes les règles éthiques nécessaires.

1. Fabrication du dispositif d’immunodosage sur papier

REMARQUE : Le dispositif d’immunodosage sur papier a été fabriqué selon les méthodes 36,37 précédemment établies et la demande de brevet thaïlandaise n° 19010081638.

  1. Conception et dessin de modèle : Concevez l’appareil d’analyse du papier (Figure 1A,B) avec 18 modèles de cire PAD sur un ordinateur.
    REMARQUE : La conception est spécifique et destinée au papier de format A5. Le nombre de PAD est lié à la taille du papier, selon les besoins de l’utilisateur.
  2. Imprimez le motif conçu sur le papier cellulosique à l’aide d’une imprimante à cire (Table des matériaux).
  3. Faire fondre le papier imprimé à la cire dans un four de laboratoire pendant 75 s à 150 °C. Par la suite, conservez-le dans une boîte en silice jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour les étapes suivantes.
  4. Appliquer 0,5 μL de poly-L-lysine (PLL) à 0,025 % sur les zones d’essai et de contrôle. Incuber à température ambiante (RT) pendant 2 min dans une boîte de silice puis chauffer au four à 65 °C pendant 5 min.
  5. Appliquer 0,5 μL de 1 μg μL-1 d’anticorps IgG anti-souris de chèvre sur la zone témoin et 0,5 μL de 1 μg μL-1 d’anticorps de capture sur la zone d’essai. Laissez sécher les gouttes dans une boîte de gel de silice à RT pendant 30 min.
  6. Appliquez 2 μL de tampon bloquant sur la zone de l’échantillon, 3 μL sur la zone conjuguée et 2 μL sur la zone de détection. Laissez sécher les gouttes à RT dans une boîte de gel de silice pendant 30 min.
  7. Appliquer 2 μL de solution complexe nanoparticule-anticorps d’or (AuNPs-Ab) sur la zone conjuguée et laisser sécher dans une boîte de gel de silice à RT pendant 30 min.

2. Assemblage de l’immunoessai sur papier

  1. Retirez délicatement le film protecteur au verso de la carte de support en plastique adhésive pour exposer l’adhésif.
  2. Alignez le papier cellulosique traité avec la carte de support en plastique adhésif et appuyez fermement sur les deux couches ensemble.
    REMARQUE : Évitez de toucher le champ hydrophile pour minimiser le risque de contamination ou d’endommagement de l’appareil.
  3. Appliquez un film plastique pour enduire le papier et pressez-les ensemble.
  4. Coupez le morceau d’appareils souhaité à l’aide de ciseaux dans des feuilles d’appareils entièrement assemblés.
  5. Les DEN-NS1-PAD (Figure 1C) sont maintenant prêts à l’emploi. Pour une stabilité à long terme, stockez-les à 4 °C.

3. Préparation du conjugué AuNPs-Ab

NOTE : Les AuNPs-Ab ont été préparés comme décrit précédemment par Prabowo et al.36.

  1. Combiner 10 μL d’anticorps anti-NS1 de 1 mg mL−1 dans du PBS, 1 mL de colloïde AuNPs à 40 nm et 0,1 mL de tampon de borate 0,1 M (pH 8,5).
  2. Faites tourner le mélange à 50 tr/min pendant 60 min et incubez à RT.
  3. Appliquer 0,1 mL de BSA à 10 mg mL−1 dans le BBS, tourner à 50 tr/min et incuber à RT pendant 15 min.
  4. Centrifuger la solution à 20 187 × g et 4 °C pendant 30 min.
  5. Pipeter soigneusement et séparer le surnageant des AuNPs-Ab précipités.
  6. Remettre en suspension les AuNPs-Ab dans 500 μL de BBS et les disperser par sonication.
  7. Répéter la centrifugation à 20 187 × g et 4 °C pendant 30 min.
    REMARQUE : Répétez les processus de dispersion et de centrifugation 3 fois.
  8. Ajouter 50 μL de tampon conjugué à la suspension, la rendant prête à être appliquée sur la zone conjuguée.

4. Développement d’applications mobiles

  1. Développement de traitement d’images et d’apprentissage automatique
    1. Rassemblez un ensemble de données pour un modèle d’image supervisé en collectant plus de 900 images à mise au point automatique des DEN-NS1-PAD, en capturant diverses conditions telles que différentes concentrations, marques de caméra (12-13 mégapixels), rotations (90° et 180°) et paramètres d’éclairage. Visez 30 images dans chaque condition spécifique.
    2. Étiquetez la vérité terrain en identifiant et en annotant deux régions d’intérêt comme zones de test et de contrôle dans les images collectées pour l’apprentissage supervisé.
    3. Concevez un algorithme pour identifier la bande d’arrière-plan. Localisez la ligne médiane entre les régions de test et de contrôle, calculez son point médian et établissez une région carrée proportionnelle à la taille moyenne des deux régions principales tout en conservant la même orientation de rotation.
    4. Créez un modèle de segmentation d’image à l’aide du jeu de données et des étiquettes de vérité terrain des étapes 4.1.1 et 4.1.2 pour entraîner un modèle de segmentation d’image pour identifier les régions d’intérêt.
  2. Algorithme d’application
    1. Appliquez le modèle de segmentation d’image entraîné à de nouvelles images pour localiser automatiquement les régions de test, de contrôle et d’arrière-plan.
    2. Utilisez des techniques de traitement d’image de base pour obtenir une valeur d’intensité unique pour chacune des trois régions d’intérêt (test, contrôle et arrière-plan).
    3. Transformez l’image en une représentation matricielle 3D (canal y, x) pour accéder aux valeurs des pixels.
    4. Convertissez l’image en niveaux de gris en faisant la moyenne des valeurs RVB et appliquez l’inversion avec la formule (255-x).
    5. Normalisez les valeurs de la zone de test et de contrôle en soustrayant la valeur de la zone d’arrière-plan.
    6. Utilisez la courbe d’étalonnage préétablie pour calculer la concentration de NS1.
    7. Classez les résultats comme positifs ou négatifs en fonction d’une valeur seuil de 0,1103 dérivée des intensités normalisées en niveaux de gris37.

5. Courbe d’étalonnage et sensibilités

  1. Préparer l’échantillon de NS1 dans le sérum humain pour l’étalonnage avec des concentrations de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1,0 μg mL-1.
  2. Déposez 50 μL de chaque concentration sur la zone de l’échantillon et effectuez des mesures en trois exemplaires.
  3. Laissez les échantillons s’évacuer complètement dans l’appareil, ce qui peut prendre 20 à 30 minutes pour obtenir des résultats.
  4. Capturez des images de l’appareil à l’aide d’un appareil photo numérique ou d’un smartphone après 5 min d’incubation.
  5. Analysez les zones de test et de contrôle à l’aide d’ImageJ et d’une application mobile personnalisée.
  6. Construisez la courbe d’étalonnage à partir des données d’ImageJ et de l’application mobile.
  7. Calculer la limite à blanc (LOB), la limite de détection (LOD) et la limite de quantification (LOQ) à l’aide des équations (1-3) ci-dessous :
    LOB = Moyenne des données vierges + 1:645* ð (écart type des données vierges) (1)
    LD = LOB +1:645*ð (écart-type des données de concentration les plus faibles) (2)
    LOQ = Moyenne des données vierges + 10*ð (écart-type des données vides) (3)

6. Réalisation d’un immunodosage sur papier avec des échantillons cliniques

  1. Prélever et traiter 300 μL de sang périphérique de 30 patients le premier jour de l’hospitalisation dans des tubes EDTA violets, conformément aux bonnes pratiques cliniques.
  2. Centrifuger le sang à 2 884 × g et 4 °C pendant 20 min.
  3. Transférez le composant liquide (plasma) dans un tube en polypropylène propre à l’aide d’une pipette.
  4. Conservez immédiatement le plasma au congélateur à −20 °C pour une analyse ultérieure.
  5. Appliquez 20 μL de plasma sur la zone de l’échantillon sur le dessus de l’appareil. Ensuite, ajoutez 30 μL de tampon de lavage (0,05 % v/v Tween 20 dans 1x solution saline tamponnée au phosphate).
  6. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans l’appareil, ce qui peut prendre 20 à 30 minutes pour obtenir les résultats.
  7. Capturez des images de l’appareil à l’aide d’un appareil photo numérique ou d’un smartphone après 5 minutes d’incubation à température ambiante.
  8. Analysez les zones de test et de contrôle à l’aide d’ImageJ et d’une application mobile personnalisée.

7. Quantification avec application mobile

REMARQUE : L’intensité du dosage immunologique sur papier est analysée dans l’application mobile (Figure 2).

  1. Ouvrez l’application mobile développée sur le smartphone.
  2. Sélectionnez Utiliser l’appareil photo ou Télécharger depuis la galerie pour choisir ou télécharger la source de données. Pour ce faire, capturez l’appareil photo ou sélectionnez une image dans la galerie de l’appareil.
  3. Accédez à la section analytique et appuyez sur le bouton Analyser à l’écran.
  4. Attendez que l’application analyse les données et affiche les résultats.

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Résultats

Le choix d’une méthode de fabrication est essentiel pour garantir des performances de test reproductibles dans les dispositifs d’immunodosage sur papier. Dans notre étude, nous avons exploré divers procédés et matériaux de fabrication dans le contexte de la démonstration d’un immunoessai sur papier. La méthode que nous avons choisie utilise un système d’impression à la cire pour créer des barrières hydrophobes dans des dispositifs microfluidiques à base de papier. Cette approche se distingue par sa simplicité, sa rapidit...

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Discussion

L’un des paramètres de conception importants d’un système de lecture basé sur smartphone est la capacité à fournir un traitement d’image reproductible des échantillons. Dans cette étude, pour plus de simplicité et de commodité, les images ont été capturées à partir de trois marques de smartphones différentes avec des appareils photo de 12-13 MP sans utiliser de boîtier d’imagerie ou d’accessoires. Les conditions variables de capture d’image, telles que la résolution de la caméra, le temps de capture d’image, les conditio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

M.H.P. remercie l’Universitas Islam Indonesia (UII) pour le fonds de recherche de bourses. Les auteurs expriment leur gratitude à M. Nutchanon Ninyawee pour son expertise et son aide précieuses tout au long du développement de l’application mobile et de ses contributions au manuscrit. En outre, les auteurs apprécient le soutien financier apporté par Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Fonds de recherche fondamentale : Exercice 2023 (projet no. FRB660073/0164) dans le cadre du programme Smart Healthcare de l’Université de technologie du roi Mongkut, Thonburi.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Matériaux
0,1 M de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,2)  ;
BBS contenant 0,1 % de Tween 20, 10 % de saccharose et 1 % de caséine.  ; le traitement de la zone conjuguée et le tampon de blocage de la solution
saline tamponnée au borate (BBS) (25 mM de borate de sodium et 150 mM de chlorure de sodium à pH 8,2) complétés par 1 % de BSA.le tampon de lavage pendant le processus de conjugaison des AuNPs avec l’anticorps
Acide boriqueMerck10043-35-3
Albumine sérique bovine fraction V (BSA)  ;   ;PAA Lab GmbH (Allemagne)K41-001  ;
CaséineMerck9005-46-3
Papier de chromatographie Grade 2  ;GE Healthcare3002-911°
Film stratifié transparent3M (Papeterie)
Hydrogénophosphate disodiqueMerck7558-79-4
Double bande latéralePapeterie Chèvre
anti-souris Anticorps IgG  ;MyBiosource (États-Unis)MBS435013
Nanoparticules d’or (40 nm)  ;   ;Serve Science Co., Ltd. (Thaïlande)
Anticorps polyclonaux IgG humains  ;   ;MerckAG711-M
Souris dengue NS1 anticorps monoclonal  ;MyBiosource (États-Unis)MBS834415
Anticorps monoclonal NS1 de sourisMyBiosource (États-Unis)MBS834236
antigènes du sérotype 2 NS1MyBiosource (États-Unis)MBS 568697
PBS 1X contenant 0,1 % de Tween 20 a été utilisé commetampon d’élution
de support en plastique 10x30 cmPacific Biotech Co., Ltd. (Thaïlande)
Poly-L-lysine (PLL)Sigma AldrichP4832
Chlorure de potassiumMerck104936
Monophosphate de potassiumMerck104877
Chlorure de sodiumMerck7647-14-5
Tétraborate de sodium.Sigma Aldrich1303-96-4
SucroseMerck57-50-1
Tween 20Sigma Aldrich9005-64-5
Instruments
CytationTM 5 lecteur multimodeBioTek
Téléphones mobilesHuawei Y7, iPhone 11, Samsung a20
Scanner photoEpson Perfection V30
OvenMemmert
Wax printer  ;Xerox ColorQube 8880-PS
Software
Could AutoML Vision Documentation sur la détection d’objetsGoogle Cloud
ImageJNational Institute of Health, Bethesda, MD, États-Unis
Inkscape 0.91 Software
Papier

Références

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