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Imagerie calcique en direct de monocouches organoïdes intestinaux humains infectés par un virus à l’aide d’indicateurs de calcium codés génétiquement

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DOI :

10.3791/66132

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19 janvier 2024

 ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une approche pour effectuer l’imagerie calcique dans les organoïdes intestinaux humains infectés par le virus et propose une approche d’analyse.

Résumé

La signalisation calcique est un régulateur intégral de presque tous les tissus. Dans l’épithélium intestinal, le calcium est impliqué dans la régulation de l’activité sécrétoire, de la dynamique de l’actine, des réponses inflammatoires, de la prolifération des cellules souches et de nombreuses autres fonctions cellulaires non caractérisées. En tant que tel, la cartographie de la dynamique de signalisation du calcium dans l’épithélium intestinal peut fournir un aperçu des processus cellulaires homéostatiques et dévoiler des réponses uniques à divers stimuli. Les organoïdes intestinaux humains (HIO) sont un modèle à haut débit, dérivé de l’homme, pour étudier l’épithélium intestinal et représentent donc un système utile pour étudier la dynamique du calcium. Cet article décrit un protocole permettant de transduire de manière stable les HIO avec des indicateurs calciques génétiquement codés (GECI), d’effectuer une microscopie à fluorescence en direct et d’analyser les données d’imagerie pour caractériser de manière significative les signaux calciques. À titre d’exemple représentatif, des HIO tridimensionnels ont été transduits avec des lentivirus pour exprimer de manière stable GCaMP6s, un GECI cytosolique à base de protéines fluorescentes vertes. Les HIO modifiés ont ensuite été dispersés dans une suspension unicellulaire et ensemencés sous forme de monocouches. Après la différenciation, les monocouches de HIO ont été infectées par le rotavirus et/ou traitées avec des médicaments connus pour stimuler une réponse calcique. Un microscope à épifluorescence équipé d’une chambre d’imagerie en direct humidifiée et à température contrôlée a permis d’imager à long terme des monocouches infectées ou traitées par des médicaments. Après l’imagerie, les images acquises ont été analysées à l’aide du logiciel d’analyse gratuit ImageJ. Dans l’ensemble, ces travaux établissent un pipeline adaptable pour caractériser la signalisation cellulaire dans les DOI.

Introduction

Le calcium est un deuxième messager largement conservé qui joue un rôle essentiel dans la régulation de la physiologie cellulaire1. Compte tenu de sa forte charge, de sa petite taille et de sa grande solubilité dans des conditions physiologiques, le calcium est un manipulateur idéal de la conformation des protéines. Cela fait du calcium un moyen puissant de transduire les signaux électrochimiques en altérations enzymatiques, transcriptionnelles ou post-transcriptionnelles. Les gradients stricts de concentration de calcium à travers le réticulum endoplasmique (RE) et les membranes plasmiques créent une force motrice élevée qui permet des changements rapides de la concentration de calcium cytosolique. De multiples mécanismes, y compris la mise en mémoire tampon et le transport actif, maintiennent étroitement ce gradient. Bien que nécessaire aux fonctions cellulaires normales, cet entretien est coûteux en énergie, ce qui le rend particulièrement sensible aux états de stress 2.

En tant que tel, la dérégulation du calcium dans le cytosol est un signal quasi universel de nombreux types de stress cellulaire. Les perturbations métaboliques, les toxines, les agents pathogènes, les dommages mécaniques et les perturbations génétiques peuvent tous perturber la signalisation du calcium. Quel que soit le stimulus, au niveau de la cellule entière, des augmentations soutenues et incontrôlées du calcium cytosolique peuvent favoriser l’apoptose et éventuellement la nécrose 3,4. Cependant, les altérations des taux de calcium cytosolique de plus faible amplitude ou de fréquence plus élevée ont des effets variables2. De même, les résultats des fluctuations calciques peuvent différer en fonction du microdomaine spatial dans lequel elles se produisent5. La surveillance des niveaux de calcium peut donc donner un aperçu des processus de signalisation dynamiques, mais cela nécessite un échantillonnage avec une résolution temporelle et spatiale relativement élevée.

Les indicateurs calciques génétiquement codés (GECI) sont des outils puissants pour l’échantillonnage continu dans les systèmes de cellules vivantes6. Certains des GECI les plus largement utilisés sont des protéines fluorescentes sensibles au calcium à base de GFP, connues sous le nom de GCaMPs7. Le GCaMP canonique est une fusion de trois domaines protéiques distincts : une GFP permutée circulairement (cpGFP), la calmoduline et M136. Le domaine de la calmoduline subit un changement de conformation lors de la liaison du calcium, ce qui permet son interaction avec M13. L’interaction calmoduline-M13 induit un changement conformationnel de la cpGFP qui augmente son émission fluorescente lors de l’excitation. En tant que tel, une augmentation de la concentration de calcium est corrélée à une augmentation de l’intensité de fluorescence GCaMP. Ces capteurs peuvent être cytosoliques ou ciblés sur des organites spécifiques8.

Comme la plupart des tissus, le calcium régule diverses fonctions au sein de l’épithélium gastro-intestinal. L’épithélium intestinal fait partie intégrante de l’absorption des nutriments et des liquides, mais doit également former une barrière étanche et une interface immunitaire pour éviter l’invasion d’agents pathogènes ou les agressions toxiques. Les voies dépendantes du calcium influencent presque toutes ces fonctions vitales 9,10,11. Cependant, la signalisation calcique dans l’épithélium intestinal reste une frontière sous-explorée avec un potentiel prometteur en tant que cible thérapeutique. Alors que la surveillance de la dynamique du calcium dans l’épithélium intestinal in vivo continue de présenter des défis, les organoïdes intestinaux humains (DOI) offrent un système ex vivo adaptable pour l’expérimentation12. Les HIO sont des sphéroïdes tridimensionnels (3D) dérivés de cellules souches intestinales humaines et, lors de la différenciation, récapitulent une grande partie de la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal natif12.

Ce protocole décrit des méthodes complètes pour concevoir des OIS qui expriment des GECI, puis préparer des OIS modifiés sous forme de monocouches pour l’imagerie du calcium sur cellules vivantes. Il propose l’infection virale comme exemple d’une manipulation pathologique qui perturbe la signalisation calcique et fournit une approche analytique pour quantifier ces changements.

Protocole

Tous les organoïdes intestinaux humains (HIO) utilisés dans ce protocole et les expériences représentatives ont été dérivés de tissus humains obtenus et conservés par le Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Tous les échantillons ont été prélevés conformément à un protocole approuvé par le comité d’examen institutionnel du Baylor College of Medicine.

1. Préparation des matériaux et des réactifs

  1. Pour l’entretien des organoïdes, prélever des plaques à 24 puits traitées par culture cellulaire, une matrice membranaire basale (BMM), des tubes coniques de 15 ml et des tubes coniques de 1,5 ml.
    1. Pour préparer un milieu complet sans facteurs de croissance (CMGF-), ajouter à 500 mL de DMEM F12 avancé 5 mL de 1M HEPES, 5 mL d’antibiotique-antimycosique 100x, 5 mL de supplément de glutamine 100x.
    2. Pour préparer les milieux contenant du Wnt, de la R-spondine et de la Noggin (WRNE), mélanger à parts égales des milieux conditionnés au CMGF et au Wnt, ajouter un milieu conditionné à la Noggin, 10 % en volume, un milieu conditionné à la R-spondine, 20 % en volume, 50 ng/mL de facteur de croissance épidermique humain, 10 mM de nicotinamide, 10 nM [Leu15]-Gastrine I, 500 nM A-83-01, 10 μM SB202190, 1 supplément de B27, 1 supplément de N2 et 1 mM de N-acétylcystéine.
  2. Pour la transduction lentivirale, préparer du sérum de veau fœtal (FBS), 0,05 % de trypsine-EDTA dans 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS), CMGF- avec 10 % de FBS, stérile 1x PBS, Polybrène, 10 μM Y-27632, Lentivirus, Wnt WRNE élevé + 10 μM Y-27632
  3. Pour générer des monocouches organoïdes, préparer une lame de culture cellulaire à 10 puits à fond de verre, FBS, collagène IV (1 mg/mL dans (di)H2O désionisé), matrice membranaire basale, 0,5 mM EDTA dans 1x PBS, 5 mM EDTA dans 1x PBS, tampon de dissociation enzymatique, CMGF- avec 10% FBS, WRNE + 10 μM Y-27632.
  4. Pour l’infection virale des monocouches organoïdes, préparez de la trypsine, du rotavirus, du CMGF-, de l’aiguille 25G, du PBS stérile 1x et du milieu de différenciation sans rouge de phénol.
    1. Pour préparer un milieu de différenciation sans rouge de phénol, prenez 500 mL de milieu de culture cellulaire sans rouge de phénol, ajoutez 5 mL d’acides aminés non essentiels 100x MEM, 5 mL de 100x L-Glutamine, 5 mL de pyruvate de sodium 100 nM et 7,5 mL de 1M HEPES.
  5. Pour la coloration par immunofluorescence des organoïdes, préparer 4 % de formaldéhyde (16 % de formaldéhyde dilué dans 1x PBS), Triton X-100 (0,1% Triton X-100 dans 1x PBS), Albumine sérique bovine (3% d’albumine sérique bovine dans 1x PBS), solution NH4Cl (50 mM), DAPI (1 μg/mL de solution DAPI dans 1x PBS).

2. Ingénierie d’organoïdes pour exprimer des capteurs de calcium codés génétiquement

NOTA : Ce protocole décrit les étapes à suivre pour transduire un seul puits d’organoïdes intestinaux humains tridimensionnels plaqués dans 30 μL de matrice membranaire basale (BMM) sur une plaque à 24 puits13. La plupart des lignes contiendront environ 400 000 cellules par puits. Un deuxième puits, non transduit, devrait être inclus comme témoin. Conservez tous les réactifs et les suspensions cellulaires sur de la glace.

  1. De 2 à 5 jours après le dernier passage, retirer le milieu d’entretien WRNE de deux puits d’OIR. Remplacez-le par 300 μL de trypsine-EDTA à 0,05 % par puits et pipetez doucement de haut en bas 5 fois pour détacher le BMM de la plaque. Placer dans un incubateur à 37 °C pendant 4 min.
  2. Ajouter 500 μL de CMGF- + 10% FBS par puits. Enduisez une pointe de pipette à faible liant de 1 ml avec FBS en pipetant 1 mL de FBS de haut en bas 2x. FBS peut être réutilisé sur plusieurs pointes. À l’aide de l’embout préenduit, pipetez les HIO de haut en bas 10x.
  3. Transférez le contenu de chaque puits dans son propre tube de microcentrifugation pré-enrobé de 1,5 ml. Rincez chaque puits avec 500 μL supplémentaires de CMGF- et ajoutez le nettoyant dans le tube correspondant.
  4. Centrifuger les tubes à 100 x g dans une centrifugeuse à godets oscillants pendant 5 min à 4 °C. Éliminez le surnageant et tout résidu de BMM.
  5. Remettre en suspension dans 1 mL de 1x PBS. Divisez chaque tube en deux tubes de microcentrifugation pour un total de 4 tubes. Centrifuger les tubes à 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Enlever le surnageant.
  6. Remettre chaque tube en suspension une fois de plus dans 1x PBS et centrifuger à 100 x g pendant 5 min à 4 °C.
  7. Préparer 400 μL de milieu de transduction et de milieu témoin (tableau 1). Remettre en suspension 2 tubes dans 200 μL du milieu témoin et 2 tubes dans 200 μL du milieu de transduction.
  8. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C pendant 24 h. Remettre en suspension en pipetant périodiquement de haut en bas avec une pointe enduite (p. ex., 2 h après la transduction (hpt), 12 hpt, 18 hpt) pour favoriser une transduction uniforme.
  9. Après 24 h, centrifuger les tubes à 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Enlever le surnageant.
  10. Remettre le granulé en suspension dans 500 μL de 1x PBS pour le laver. Centrifuger à 100 x g pendant 5 min à 4 °C. Enlever le surnageant.
  11. À l’aide d’un embout de pipette glacé de 200 μL, remettre en suspension chacun des 4 granulés dans 30 μL de BMM. Pipeter doucement de haut en bas pour disperser uniformément.
  12. Placez le contenu de chaque tube dans son propre puits sur une plaque de 24 puits. Incuber pendant 10 min à 37 °C pour permettre à BMM de se solidifier avant d’ajouter 500 μL de HighWnt WRNE + 10μM Y-27632.
  13. Laisser croître les HIO transduits pendant 1 semaine, en rafraîchissant le milieu (HighWnt WRNE + 10 μM Y-27632) tous les deux jours. Après 1 semaine, vérifier l’expression de l’indicateur fluorescent par microscopie. Si le signal est fort, commencez la sélection du médicament. Si le signal est faible, répétez la transduction comme décrit ci-dessus.
  14. Une fois la ligne établie, vérifier le fonctionnement de l’indicateur de fluorescence par traitement agoniste. L’ADP 100 nM est un agoniste fiable pour la validation GCaMP. Testez les organoïdes 3D pour la validation initiale, comme décrit ci-dessous.
    1. Après un passage, plaquez un puits (ou plusieurs) d’organoïdes dans BMM sur une plaque inférieure d’imagerie séparée. Plaquer les organoïdes à environ 1/3 de la densité normale pour éviter un chevauchement excessif lors de l’imagerie. Ne continuez pas à faire passer ces DOI après un traitement agoniste, car il est difficile d’assurer la stérilité.
    2. Prévoyez 2 à 3 jours pour que les DOI se rétablissent après le passage. Avant l’imagerie, passez le milieu à un milieu de différenciation sans rouge de phénol.
    3. À l’aide d’un microscope à fluorescence, mettez en place un cycle de 3 minutes avec des images acquises toutes les 5 s en utilisant une excitation de 488 nm et un jeu de filtres FITC/GFP. Après 30 s d’imagerie, ajoutez 100 nM ADP ou le contrôle du véhicule. Continuez à imager jusqu’à ce que le signal revienne à la ligne de base, ~2 min. Une augmentation transitoire de ~2 fois de la fluorescence GCaMP avec le traitement ADP indique une transduction réussie et une fonction de biocapteur. Pour une estimation plus précise de l’efficacité de la transduction, répétez le test d’agoniste avec imagerie en utilisant des monocouches générées par le processus décrit dans la partie 3.

3. Préparation des monocouches HIO pour l’imagerie par fluorescence en direct

  1. Enduisez tous les puits d’une lame de chambre inférieure d’imagerie à 10 puits avec du collagène IV. Pour ce faire, mélangez 34 μL de 1 mg/mL de collagène IV avec 960 μL d’eau déminéralisée stérile. Ajouter 95 μL de solution IV de collagène dilué dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 0,5 à 2 h.
  2. Retirer le milieu d’entretien WRNE de 4 puits d’OIE 3D. Les DOI devraient s’écouler de 5 à 7 jours à compter de leur dernier passage.
    REMARQUE : 1 plaque de 10 puits nécessite généralement ~1,25 x 106 cellules. Cela nécessite généralement 2 à 4 puits d’HIO 3D plaqués dans 30 μL de BMM chacun, mais varient en fonction de la densité.
  3. Ajouter 500 μL de 1x PBS + 0,5 mM EDTA par puits. À l’aide d’un embout pré-enduit de 1 ml, pipeter doucement de haut en bas pour détacher le BMM de la plaque. Transférez la suspension dans un tube conique pré-enduit de 15 mL, en combinant des puits similaires dans le même tube.
  4. Rincez chaque puits avec 500 μL supplémentaires de PBS + 0,5 mM d’EDTA. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et le BMM résiduel.
  5. À l’aide d’un embout pré-enduit, remettre en suspension le reste de la pastille dans 3 mL de PBS + 5 mM d’EDTA (notez que c’est 10x plus d’EDTA que le premier lavage).
  6. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et le BMM résiduel. Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de tampon de dissociation enzymatique.
  7. Incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 5 min. Ajouter 3 mL de CMGF- + 10 % FBS et pipeter doucement pour mélanger.
  8. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant. Ajouter 1 mL de CMGF-.
  9. Pipeter vigoureusement de haut en bas avec un embout pré-enduit 80x-100x pour décomposer mécaniquement les HIO en cellules individuelles. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Enlever le surnageant.
  10. Remettre en suspension 1 mL de WRNE + 10 μM Y-27632. Obtenir un nombre de cellules pour la suspension de 1 mL.
  11. Diluer la suspension cellulaire avec WRNE + 10μM Y-27632 pour obtenir une concentration de 1,25 x 105 cellules/100 μL (1,25 x 106 cellules/mL).
  12. À l’aide d’une pipette de 200 μL, retirez la solution de collagène de la plaque préparée à l’étape 1, car le collagène s’est maintenant déposé au fond du puits. Évitez de toucher le fond du puits avec la pointe de la pipette.
  13. À l’aide d’une pointe de pipette pré-enduite de 200 μL, ajouter 100 μL de la solution cellulaire de l’étape 3.11 (1,25 x 105 cellules) par puits.
  14. Incuber pendant 24 h dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C. Après 24 h, retirer le milieu de culture de tous les puits et le remplacer par 100 μL de milieu de différenciation par puits.
    REMARQUE : À ce stade, les cellules devraient adhérer à la plaque. Notez que la monocouche ne sera probablement pas confluente ou entièrement plane.
  15. Replacez la lame dans l’incubateur de culture cellulaire à 37 °C. Rafraîchir le milieu de différenciation toutes les 24 h jusqu’à ce que la monocouche soit confluente. Cela nécessite généralement 3 à 5 jours à partir du placage. Après ce point, les monocouches sont prêtes pour les applications en aval.

4. Infection virale des monocouches HIO

  1. Préparez l’inoculum du virus. Si nécessaire, la trypsine active le stock de virus. Dans le cas du rotavirus, ajouter 10 μg/mL de trypsine de Worthington aux stocks de virus et incuber à 37 °C pendant 1 h.
    1. Diluez le stock de virus activé en utilisant l’une des deux méthodes suivantes.
      1. Si vous visez le nombre maximal de cellules infectées en utilisant une seule souche virale, mélangez 50 μL de souche virale activée avec 50 μL de CMGF-.
      2. Si vous comparez plusieurs souches, préparez les inoculums pour obtenir des multiplicités d’infection équivalentes. Utilisez la formule suivante pour déterminer le volume de stock de virus par puits nécessaire pour le moment d’inertie souhaité. Ajouter CMGF- au volume de stock de virus calculé pour obtenir un volume final de 100 μL par puits.
        figure-protocol-1
        REMARQUE : Une seule monocouche HIO plaquée dans un puits d’un diamètre de 5,46 mm (plaque à 96 puits) contient environ 200 000 cellules. En raison de la faible efficacité de l’infection dans les monocouches, un moment d’inertie élevé (100 à 1 million de particules virales par cellule) est préférable. Le moment d’inertie optimal doit être déterminé empiriquement.
    2. Infectez les monocouches en retirant délicatement le milieu de la monocouche HIO à l’aide d’une pipette de 200 ml. Remplacer par 100 mL d’inoculum viral ou d’inoculum simulé.
      1. Étant donné que la plupart des souches de rotavirus se propagent dans des cellules MA104, utiliser un lysat de cellules MA104 non infectées pour l’inoculum simulé. Utiliser un volume équivalent au volume de stock de virus utilisé pour les puits infectés et ajouter CMGF- pour un volume final de 100 mL par puits.
      2. Pour les virus qui infectent les cellules par voie basolatérale, comme le rotavirus14, utilisez une aiguille 25G pour marquer la monocouche. Il est plus facile de faire une seule entaille sur toute la longueur de la monocouche, du bas vers le haut du puits. Appuyez doucement l’aiguille dans la monocouche en biseau vers le haut, dans le sens opposé au mouvement, et faites-la glisser sur toute la longueur de la monocouche pour créer une cicatrice (Figure 2A).
    3. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 2 h. Éliminez le virus et simulez l’inoculum. Lavez les monocouches une fois avec 1x PBS.
    4. Ajouter 100 μL de milieu de différenciation sans rouge de phénol. Placez la lame dans un incubateur à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit prête à être photographiée. La fenêtre d’imagerie optimale variera en fonction de la cinétique de l’infection virale. Dans le cas du rotavirus, commencer l’imagerie 6 à 8 h après l’infection.

5. Imagerie Ca2+ des monocouches infectées

  1. Préchauffez l’incubateur à 37 °C. Faire fonctionner le CO2 humidifié à 0,02 L/min. Placez la lame contenant les monocouches infectées dans la chambre de l’incubateur et scellez le couvercle.
  2. À l’aide de l’éclairage à fond clair (BF) et d’un objectif 20x, sélectionnez les coordonnées X et Y des champs de vision de la monocouche qui sera imagée. Il est préférable de sélectionner les points en tenant compte de la région marquée, car la plupart des cellules infectées se trouveront près de la rayure.
  3. Optimisez les paramètres d’imagerie et acquérez une image à l’aide d’une excitation de 488 nm. Pour minimiser la phototoxicité, réglez la source lumineuse à 50 % de puissance avec un temps d’exposition de 50 ms. Les paramètres d’acquisition appropriés peuvent varier et doivent être optimisés en acquérant plusieurs acquisitions. Assurez-vous qu’aucun pixel n’est saturé. Ajustez le temps d’exposition et la puissance lumineuse selon vos besoins pour vous assurer que toute la plage dynamique du capteur de calcium fluorescent peut être détectée.
  4. Si vous utilisez d’autres fluorophores (par exemple, des virus marqués par fluorescence), répétez l’optimisation sur ces canaux. Configurez la boucle d’imagerie et acquérez une image de 488 nm à chaque coordonnée X, Y sélectionnée dans une boucle de 1 min. Imagez cette boucle en continu. Lors de l’utilisation d’un virus marqué par fluorescence, acquérez une image sur le canal approprié toutes les 10e boucle (c’est-à-dire 1 image/10 min).
  5. Collectez des images pendant ~18 h. Si vous utilisez des virus sans marqueurs fluorescents, fixez les monocouches et effectuez une coloration par immunofluorescence pour identifier les cellules infectées. Effectuez cette opération après avoir terminé l’exécution de l’imagerie comme décrit ci-dessous.
    1. Retirez le support d’imagerie et remplacez-le par 100 μL de formaldéhyde à 4 % dans 1x PBS. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
    2. Retirer le fixateur et tremper avec 100 μL de 50mM NH4Cl pendant 10 min. Retirer NH4Cl. Perméabiliser les monocouches avec 100 μL de Triton X-100 à 0,1% dans 1x PBS pendant 1 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
    3. Supprimer le tampon de perméabilisation. Bloquer avec 100 μL d’albumine sérique bovine à 3 % dans 1x PBS pendant 1 h.
    4. Retirez la solution bloquante. Ajouter les anticorps primaires dilués à la concentration recommandée/optimisée dans 1x PBS. Ajouter 100 μL de solution d’anticorps par puits.
    5. Incuber toute la nuit à 4 °C en berçant doucement. Retirez les anticorps primaires. Laver 3x avec 1x PBS.
    6. Ajouter des anticorps secondaires conjugués à la fluorescence dilués à la concentration recommandée/optimisée dans 1x PBS. Ajouter 100 μL par puits. Incuber pendant 2 h à température ambiante.
      REMARQUE : FPBase15 est une excellente ressource pour vous aider à sélectionner des secondaires qui éviteront les débordements lors du multiplexage. La plupart des produits secondaires sont efficaces à une dilution de 1 :1000 dans 1x PBS.
    7. Retirez les anticorps secondaires. Préparez une solution DAPI de 1 μg/mL dans 1x PBS et ajoutez 100 μL par puits. Incuber pendant 20 min. Retirer le DAPI. Laver 3x avec 1x PBS.
    8. Conservez les monocouches fixes dans 100 μL de PBS 1x pour l’imagerie. Replacez la lame sur la platine du microscope, rechargez les coordonnées X et Y de l’exécution d’imagerie en direct et imagez chaque multipoint sur le canal qui correspond à l’anticorps secondaire qui a été utilisé pour la coloration. Référencez les images de l’exécution d’imagerie en direct pour vous assurer que les mêmes points sont capturés.

6. Quantification des ondes calciques intercellulaires

  1. Assurez-vous que Fidji est Just ImageJ (FIJI) est installé avec les plug-ins suivants : Bio-Formats (doit être préinstallé dans FIJI mais ne sera pas dans ImageJ) ; Livre de recettes : Pour l’installer, à partir du menu FIJI, accédez à Aide > mises à jour > Gérer les sites de mise à jour. Consultez le livre de recettes. Redémarrez FIJI.
  2. Divisez le fichier de données de l’exécution d’imagerie en direct en plusieurs fichiers, en séparant chaque coordonnée X, Y. Dans Nikon NES Elements, sélectionnez Fichier > Importer/Exporter > Fractionner les multipoints. Sélectionnez un dossier à exporter et un préfixe approprié.
  3. Ouvrez FIDJI. Chargez un seul fichier à partir des multipoints fractionnés. Si vous utilisez une image multicouche, divisez les couches. Sélectionnez la fenêtre avec les images du canal 488 nm (GCaMP).
  4. Exécutez la fonction DeltaF vers le haut pour déterminer la variation de la valeur de chaque pixel d’un point temporel à l’autre. Pour ce faire, sélectionnez Cookbook > T-functions > Delta F Up.
  5. Faites défiler la pile jusqu’à ce qu’une image avec une onde de calcium soit trouvée. Avec l’onde calcique en vue, définissez un seuil en cliquant sur Image > Ajuster > seuil. Ajustez la limite inférieure pour minimiser la quantité de signal qui ne fait pas partie de l’onde qui dépasse le seuil. Pour les images 16 bits acquises à l’aide des paramètres décrits ci-dessus, commencez par un seuil inférieur de 600 et ajustez-le si nécessaire.
  6. Exécutez l’analyseur de particules pour segmenter les ondes en cliquant sur Analyser > Analyser les particules. Définissez la taille minimale de l’onde en μm2 en ajustant la plage. Il est défini sur 0-infinity à la ligne de base. Pour les images de cellules MA104 acquises à l’aide d’un objectif 20x, commencez par augmenter la limite inférieure à 10 000 μm2 et ajustez au besoin.
  7. Cochez les cases Afficher les résultats et Effacer les résultats. Dans le menu déroulant « Afficher », sélectionnez Contours, puis cliquez sur OK. Cela devrait se traduire par 2 sorties : Une fenêtre, Résultats, répertoriera chaque onde détectée, la zone de l’onde et ses valeurs d’intensité moyenne, minimale et maximale (en fonction du delta F). L’autre fenêtre, intitulée Dessin de [nom du fichier], comprendra une nouvelle pile avec les contours des vagues segmentées. Utilisez-le pour vérifier la détection des vagues. Ajustez les valeurs seuils et la plage de tailles si nécessaire, et vérifiez à nouveau les appels d’onde.
  8. Pour le traitement par lots, utilisez le script de macro inclus (Fichier de codage supplémentaire 1). Pour l’utiliser, suivez les étapes décrites ci-dessous.
    1. Divisez les points multiples en fichiers uniques comme décrit à l’étape 6.2. Ouvrez FIDJI. Sélectionnez Traiter > Batch > Macro. Dans la zone « entrée », fournissez la carte au dossier contenant les fichiers multipoints fractionnés. Laissez la case « sortie » vide.
    2. Collez le script du fichier de codage supplémentaire 1 dans la zone. Ajustez le seuil d’intensité et le seuil de taille dans le script pour refléter les paramètres optimisés des étapes 6.5 et 6.6.
    3. Cliquez sur Traiter. En fonction du nombre de multipoints et de la vitesse de traitement de l’ordinateur, le traitement de toutes les images peut prendre 30 minutes ou plus. Une fois terminé, les données seront écrites dans un nouveau fichier de feuille de calcul nommé « Renommez-moi après l’écriture » sur le bureau. Le fichier de sortie doit contenir, pour chaque multipoint, un nombre de vagues et des mesures de vagues (surface, intensité moyenne, intensité minimale et maximale et densité d’intensité).

Résultats

La figure 1A montre un dôme BMM contenant des organoïdes intestinaux humains en 3 dimensions qui ont été transduits pour exprimer de manière stable les GCaMP6. La figure 1B montre la même lignée d’organoïde replaqué en monocouche à 24, 48 et 72 h après le semis. Pour valider la fonction des GCaMP6s, la monocouche a été imagée par microscopie à fluorescence toutes les 2 s pendant 4 min, et 100 nM d’ADP ont été ajoutés au milieu après ~20 s. L’ADP provoque la libération de calcium par le réticulum endoplasmique, augmentant ainsi le calcium cytosolique. L’intensité de fluorescence détectée sur le canal de 488 nm à chaque exposition est représentée à la figure 1C. La trace montre une intensité de fluorescence de base constante, suivie d’une augmentation rapide lors de l’ajout d’ADP et d’un retour progressif vers la ligne de base. Une commande de véhicule est incluse pour vérifier qu’il s’agit d’un véritable événement de signalisation, et non d’un simple changement d’intensité de fluorescence qui peut résulter de l’ajout de milieux.

Le marquage d’une monocouche HIO augmente l’efficacité de l’infection à rotavirus. Bien que les techniques de notation varient, il est plus facile d’obtenir une infection cohérente en utilisant un seul score sur toute la longueur de la monocouche, comme le montre la figure 2A. Lors de l’utilisation de souches recombinantes de rotavirus qui expriment des protéines fluorescentes, l’infection peut être vérifiée lors de l’imagerie en direct (Figure 2B). Lors de l’utilisation d’une souche qui n’exprime pas de marqueur, l’infection peut être détectée par immunofluorescence après imagerie. Compte tenu de la motilité des cellules dans les monocouches de GIO, il est souvent difficile de suivre une seule cellule infectée au fil du temps. Au lieu de cela, utilisez la coloration des points de terminaison comme méthode pour vérifier l’infection et confirmer que la multiplicité de l’infection correspond entre les champs de vision (Figure 2C).

Les ondes calciques intercellulaires dans les DOI peuvent être observées qualitativement, comme le montre la figure 3A. Cependant, la détermination de la fréquence des ondes calciques dans un champ de vision donné nécessite une analyse quantitative. Les étapes d’une segmentation réussie, telles que décrites à l’étape 6 du protocole ci-dessus, sont illustrées à la figure 3A. La figure montre l’image brute (Figure 3Ai), l’image après soustraction des intensités de pixels de l’image précédente (Figure 3Aii), puis l’onde calcique segmentée (Figure 3Aiii).

Une fois que les ondes calciques ont été segmentées et quantifiées pour chaque champ de vision au cours de l’imagerie, il est souvent instructif de comparer la fréquence des ondes dans les monocouches exposées à diverses conditions. Le diagramme en bandes de la figure 3B montre le nombre total d’ondes calciques par champ de vision dans les monocouches simulées et inoculées par le rotavirus. Cet exemple comprend deux souches de RV : une souche de rotavirus humain (Ito HRV) et une souche recombinante de rotavirus simien SA11 qui exprime mRuby (SA11-mRuby). Le témoin infecté simulé est considéré comme la fréquence d’onde calcique de base, les monocouches infectées par le rotavirus non traitées servent de témoins positifs, et les monocouches infectées par le rotavirus et traitées sont les conditions expérimentales. Les monocouches infectées par des simulacres et des RV traitées avec des médicaments, y compris l’inhibiteur du récepteur ADP, BPTU, peuvent ensuite être comparées aux deux conditions de contrôle par ANOVA à un facteur. Les données suggèrent que le BPTU diminue efficacement la fréquence des ondes calciques intercellulaires.

figure-results-1
Figure 1 : Validation de l’expression de GCaMP6s dans des organoïdes intestinaux humains jéjunaux. (A) Après la transduction des lentivirus, les HIO exprimant GCaMP ont subi une sélection et de multiples passages, montrés ici à 7 jours depuis le passage le plus récent. Lors de la stimulation avec le laser de 488 nm, l’expression de GCaMP6s est évidente dans les HIO transduits plaqués dans une matrice membranaire basale de 15 μL sous forme de sphéroïdes tridimensionnels (Ai). Des expositions de 50 ms ont été acquises à 50 % de la puissance laser à l’aide d’un objectif 20x, puis assemblées pour visualiser l’ensemble du dôme de la matrice de la membrane sous-jacente. Un processus similaire a été réalisé en utilisant des expositions en fond clair de 4 ms (Aii). Sur l’image en fond clair, les HIO sombres au centre du dôme indiquent que les cultures sont prêtes à être traversées. (B) Les HIO ont été digérés enzymatiquement dans une suspension unicellulaire, puis replaqués à une densité de 150 000 cellules par puits (5 mm de diamètre) d’une plaque inférieure d’imagerie pré-enrobée de collagène IV. 72 h après l’ensemencement, la monocouche était confluente et prête pour les applications en aval. Pour valider la fonction de GCaMP, les images ont été acquises à l’aide du jeu de filtres de 488 nm avec des expositions de 50 ms à 50 % de puissance laser toutes les 2 s pendant 4 min. (C) Les traces présentées ici représentent l’intensité de fluorescence du champ entier normalisée à la première acquisition au cours de l’imagerie. Vers 20 s (flèche), après la dixième exposition, 100 nM d’adénosine diphosphate (ADP) ont été ajoutés pour provoquer un pic de calcium cytosolique (rouge). L’ajout d’un volume égal de 1x PBS n’a pas suscité de réponse significative (bleu). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Rainage d’une monocouche HIO pour faciliter l’infection par le virus de la RV. (A) La figure illustre une technique appropriée pour marquer une monocouche à l’aide d’une aiguille 25G. (B) Une monocouche HIO a été infectée par une souche recombinante de RV qui exprime la protéine fluorescente mRuby (magenta, flèche), ce qui a permis d’identifier les cellules infectées. Alternativement, lors de l’utilisation d’une souche naturelle de RV, les cellules infectées peuvent être identifiées par immunofluorescence. (C) Les images présentées proviennent de 4 monocouches HIO différentes après fixation, coloration DAPI (bleu) et marquage d’anticorps de l’antigène du rotavirus (magenta). Les deux techniques illustrent l’infection préférentielle du RV près de la partie rainurée de la monocouche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Segmentation et quantification des ondes calciques intercellulaires induites par le RV. Les expositions de 488 nm d’HIO infectés par RV exprimant des GCaMP6 ont été acquises toutes les 1 minute pendant 16 h en utilisant le protocole. (A) La figure illustre le processus de segmentation de l’onde calcique intercellulaire. Tout d’abord, les valeurs de pixel de l’acquisition précédente (t-1) sont soustraites de chaque image brute (Ai) pour quantifier le changement d’intensité de fluorescence (Aii). Un seuil basé sur une augmentation minimale de l’intensité optimisée expérimentalement par rapport à l’image précédente est ensuite appliqué. Les images sont ensuite filtrées pour une zone de signal contiguë minimale afin de sélectionner les ondes calciques intercellulaires (Aiii) et d’exclure les signaux calciques unicellulaires. Ce traitement permet de quantifier les ondes calciques à chaque champ de vision. Dans cette expérience, les monocouches ont été soit infectées par simulacres, soit infectées par la souche ITO du rotavirus humain (HRV), soit infectées par une souche recombinante de rotavirus simien codant pour mRuby sur le segment de gène 7, en aval de la protéine non structurale 3 (SA11-mRuby). Les monocouches infectées ont été soit traitées avec l’inhibiteur du récepteur ADP BPTU, soit laissées sans traitement. Les monocouches ont ensuite été imagées à 8 positions différentes, et les ondes calciques dans chaque champ de vision ont été quantifiées à l’aide du pipeline décrit dans ce protocole. Les points sur le diagramme à bandes indiquent le nombre d’ondes calciques détectées à chaque position superposées sur un graphique à barres marquant la moyenne et l’écart-type. L’ANOVA à un facteur suivie des tests de Dunnett montre que, bien que l’une ou l’autre souche de RV augmente la fréquence des ondes calciques intercellulaires au-dessus de celle du groupe non infecté, le traitement BPTU empêche l’augmentation de la fréquence des ondes calciques médiée par la RV. **p<0,01, ***p<0,001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

RéactifTransductionContrôle
Y-27632 (stock de 1 mM)4 μL4 μL
Polybrène (1 mg/μL de bouillon)2 μL2 μL
Lentivirusvariable*
HighWnt-WRNE *voir notesjusqu’à 400 μLjusqu’à 400 μL

Tableau 1 : Milieu de transduction des lentivirus. Préparer le milieu de transduction et le milieu de contrôle en combinant les réactifs dans les volumes indiqués dans les deuxième et troisième colonnes, respectivement. Visez une multiplicité d’infection (MOI) de 10 unités de transduction de lentivirus par cellule. Pour le LV conditionné en interne, cela nécessite généralement ~25-50 μL de LV concentré. Le titre de la plupart des VG emballés commercialement sera fourni avec le certificat d’analyse.

Fichier de codage supplémentaire 1 : Script macro ImageJ pour permettre la quantification des ondes calciques par traitement par lots. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les altérations des taux cytosoliques de Ca2+ peuvent être à la fois une cause et un effet de pathologies au sein de l’épithélium 10,16,17. L’augmentation du calcium cytosolique peut entraîner directement la sécrétion via l’activation du canal chlorure dépendant du calcium TMEM16A18,19. L’activation de TMEM16A en réponse au Ca2+ permet l’efflux apical du chlorure, établissant un gradient osmotique qui favorise la sécrétion de liquide20,21. De plus, l’augmentation du Ca2+ dans les cellules entéroendocrines déclenche la libération de sérotonine, qui stimule les neurones sensoriels afférents qui peuvent moduler l’activité du système nerveux entérique22. Les signaux Ca2+ peuvent également moduler les jonctions serrées pour influencer la fonction barrière23,24 et réguler la prolifération dans les cellules souches intestinales25. Ainsi, la dérégulation du Ca2+ peut avoir des effets étendus et de grande portée.

De nombreux virus manipulent le Ca2+ cytosolique pour créer un environnement cellulaire propice à la réplication26. Le rotavirus en est un excellent exemple dans l’épithélium intestinal27. La protéine non structurale 4 du rotavirus (NSP4) est un canal conducteur de Ca2+ qui permet l’écoulement de Ca2+ du réticulum endoplasmique dans le cytosol28,29. Cela stimule l’autophagie et facilite l’assemblage de la capside externe 30,31,32. L’infection à rotavirus induit également la libération d’ADP, déclenchant des ondes intercellulaires de Ca2+ qui contribuent à la pathogenèse17. D’autres virus entériques, y compris les calicivirus et les entérovirus, codent pour des viroporines conductrices de Ca2+ qui déclenchent une dérégulation similaire de Ca2+ dans les cellules infectées33,34.

L’imagerie Ca2+ d’organoïdes intestinaux humains sur cellules vivantes offre une plate-forme polyvalente pour étudier la signalisation induite par le virus dans l’épithélium. Cependant, la force des conclusions tirées des données d’imagerie dépend inextricablement de la santé et de la qualité des DOI, des paramètres d’imagerie appropriés et d’une approche analytique solide.

Une transduction lentivirale efficace est souvent l’étape limitante lors de l’établissement de nouvelles lignées GIO, mais un lentivirus à titre élevé et des transductions multiples aident à assurer une expression suffisante du transgène. Il est important de noter que cela devra être équilibré avec le potentiel de stress cellulaire important lors de la transduction. Celle-ci est le plus souvent temporaire et disparaît après la sélection et de multiples passages. Néanmoins, il est essentiel que les OIS conçus pour exprimer les GECI affichent une croissance et une prolifération normales avant de commencer les expériences. De même, la dispersion des HIO tridimensionnels et leur reformation sous forme de monocouches induisent un stress cellulaire. Il est préférable d’attendre trois jours ou plus pour que les monocouches s’adaptent après le placage. Le revêtement des plaques avec du collagène IV est essentiel pour l’intégrité de la monocouche35,36. L’aliquotage du collagène IV et son stockage à -80 °C entre les utilisations permettent d’assurer l’adhérence de la monocouche. La détermination de la densité de semis optimale pour chaque lignée de DOI peut également aider à améliorer la cohérence. Enfin, il est indispensable d’inclure les contrôles appropriés et de les comparer d’une expérience à l’autre pour s’assurer que toute observation représente une réponse à la variable en question, plutôt qu’un facteur de confusion technique.

Bien que le marquage d’une monocouche puisse causer des dommages cellulaires indésirables, il améliore considérablement l’infection RV des HIO 2D. La figure 2 illustre cela, car presque toutes les cellules infectées sont directement adjacentes à l’égratignure. Des preuves expérimentales suggèrent que la RV infecte le plus efficacement à la surface basolatérale des cellules épithéliales intestinales37. Ainsi, il est prédit que le marquage d’une monocouche améliore l’infectivité en exposant la surface basolatérale. Une infection monocouche efficace peut également être obtenue en plaquant des HIO sur des membranes en polycarbonate suspendues dans des puits contenant un milieu de culture, qui permettent d’accéder à la surface basolatérale. Cependant, la distance relativement longue entre la plaque et la membrane en polycarbonate, la membrane en polycarbonate elle-même et la surface en plastique à la base du puits les rendent inappropriées pour l’imagerie par épifluorescence. Ainsi, la méthode de scoring décrite dans ce protocole reste l’approche privilégiée. Étant donné que la notation elle-même peut conduire à des perturbations de signalisation, l’inclusion du témoin non infecté et noté est essentielle pour l’interprétation. Pour les virus, tels que les norovirus humains, qui infectent efficacement via la membrane apicale, il n’est pas nécessaire de marquer la monocouche38.

Comme pour tout système d’imagerie en direct, la phototoxicité peut facilement confondre les expériences utilisant des monocouches GIO. Tout au long d’une expérience d’imagerie, il est important de surveiller la vacuolisation inattendue, le saignement de la membrane ou d’autres indicateurs morphologiques de stress39. Si l’un de ces signes est détecté, la durée, la fréquence ou la puissance de l’excitation doivent être réduites. L’augmentation du rapport signal/bruit se fait souvent au détriment de la santé cellulaire à long terme, il est donc crucial d’optimiser empiriquement les paramètres. Le photoblanchiment, comme l’indique une diminution de l’intensité de fluorescence de base au fil du temps, est un signe avant-coureur du stress cellulaire et doit être évité.

La visualité des données d’imagerie peut amener les chercheurs à privilégier les analyses qualitatives plutôt que quantitatives. Cependant, comme pour toute modalité, les conclusions reproductibles nécessitent une quantification. L’analyse quantitative d’images contient beaucoup plus de complexité que ce qui peut être couvert dans un seul manuscrit, mais il vaut la peine de souligner quelques points clés. Tout d’abord, une quantification cohérente nécessite une acquisition cohérente. Un pipeline d’analyse développé pour un ensemble donné de paramètres d’acquisition peut ne pas être efficace pour les images acquises à des fréquences, des temps d’exposition, des puissances laser ou des longueurs d’onde différents. Deuxièmement, la multiplicité des infections a une influence démesurée sur la fréquence des signaux calciques induits par le virus. En tant que tel, il est important d’évaluer le nombre de cellules infectées par champ de vision et d’assurer la cohérence entre les conditions de traitement. Alternativement, la normalisation de la fréquence du signal au nombre de cellules infectées par champ de vision peut aider à réduire les erreurs. Enfin, alors que l’indicateur calcique à base de mNG (NEMO) récemment mis au point offre une approche prometteuse pour déterminer les concentrations absolues de Ca2+ dans les cellules40, la plupart des biocapteurs ne transmettent que des informations relatives sur les systèmes biologiques. Ainsi, la soustraction de l’arrière-plan, la normalisation et la comparaison avec un contrôle sont essentielles.

Bien que ce protocole se concentre sur l’imagerie calcique lors d’une infection virale, l’approche générale est facilement adaptable. L’infection virale peut facilement être remplacée par une autre condition de traitement, et il existe une litanie sans cesse croissante de biocapteurs pour surveiller de nombreuses voies et processus cellulaires différents. Lors de toute adaptation de protocole, les chercheurs doivent garder l’analyse à l’esprit, en concevant des expériences avec des résultats clairs et quantifiables.

Dans l’ensemble, l’imagerie en direct offre une résolution temporelle inégalée, améliorant ainsi la caractérisation de processus hautement dynamiques. L’incorporation d’organoïdes dans des expériences d’imagerie en direct permet d’observer ces processus dans un modèle physiologiquement pertinent et fidèle aux tissus. Nous espérons que le protocole décrit ici facilitera la conception et l’optimisation expérimentales, permettant aux chercheurs de découvrir de nouveaux aspects de la signalisation cellulaire et tissulaire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été financés par des subventions R01DK115507 et R01AI158683 (PI : J. M. Hyser) des National Institutes of Health (NIH). Le soutien aux stagiaires a été fourni par des subventions des NIH F30DK131828 (PI : J.T. Gebert), F31DK132942 (PI : F. J. Scribano) et F32DK130288 (PI : K.A. Engevik). Nous tenons à remercier le Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core pour avoir fourni le milieu d’entretien des organoïdes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Advanced DMEM F12Gibco12634028
[Leu15]-Gastrin ISigma-AldrichG9145
0,05 % Trypsine EDTA  ;Gibco  ;
0,05 % de trypsine EDTA.Gibco  ;
Tubes microcentrifuges 1,5 mlFisherbrand5408137
Tubes coniques 15 mlThermofisher Scientific0553859A
16 % formaldéhydeThermofisher Scientific28906
1M HEPESGibco 15630080
1M HEPESGibco 15630080
1X PBSCorning  ;21-040-CV
Aiguille de calibre 25Thermofisher Scientific1482113D
A-83-01Tocris2939
ADPSigma-Aldrich  ;A2754
Advanced DMEM F12Gibco12634028
Antibiotique-antimycocytaireGibco15240062
Antibiotique-antimycosique  ;Gibco15240062
B27 SupplémentGibco17504-044
Albumine sérique bovineFisherScientific  ;
CellView Lame de culture cellulaire, PS, 75/25 MM, fond en verre, 10 compartimentsGreiner543979
Collagène IVSigma AldrichC5533
DAPIThermofisher ScientificD1306
EDTACorning46-034-CI
Sérum fœtal bovin  ;Corning  ;35010CV
Sérum fœtal bovin  ;Corning  ;35010CV
FluorobriteGibcoA1896701
GlutaMAX  ;Gibco  ;
GlutaMAX  ;Gibco  ;
Facteur de croissance épidermique humainProteinTechHZ-1326
LentivirusVectorBuilder(variable)
MatrigelBD Biosceicen356231/CB40230C
N2 SupplementGibco17502-048
N-acétylcystéineSigma-AldrichA9165-5G
NH4ClSigma-Aldrich  ;A9434
NicotinamideSigma-AldrichN0636
Nunc Culture cellulaire traitée Plaques 24 puitsThermofisher Scientific142475
PolybreneMilliporeSigmaTR1003G
SB202190Sigma-AldrichS70767
Triton X-100Fisher BioReagentsBP151100
Enzyme TrypLE Express, sans rouge de phénolThermofisherScientific 12604013
TrypsineWorthingtonNC9811754
Y-27632Tocris1254
2530005425300054BP16001003505007935050079biochimique

Références

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