Polymérisation à deux photons : impression 3D de dispositifs de culture de cellules neuronales à micro-échelle

L’étude de l’activité neuronale chez les organismes comportementaux présente plusieurs défis. Par exemple, l’accès physique au tissu cérébral est limité par la nécessité de maintenir son intégrité, de sorte que les régions superficielles du cerveau sont plus facilement prises en compte. Isoler des cibles spécifiques dans le tissu intact est souvent une tâche ardue et parfois impossible. Bien que les cultures neuronales homogènes dissociées offrent un accès pratique aux propriétés moléculaires, biochimiques et biophysiques des composants (sub)cellulaires individuels d’un circuit neuronal, une connectivité réaliste et une organisation anatomique du cerveau intact sont perdues. Ces contraintes fondamentales ont inspiré les efforts de recherche pour parvenir à un terrain d’entente, où la complexité in vivo est évitée tandis que la structure peut être construite in vitro, ce qui est à la demande 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . En particulier, les cultures neuronales modulaires ont fait l’objet de recherches approfondies au cours des dernières décennies, visant à aborder des questions clés de physiologie cérébrale décrites ci-dessous.

Organisation : Des études in vivo montrent que le cerveau est structuré anatomiquement en couches avec des types de cellules précis et des réseaux de projections. Des tests fonctionnels ont révélé l’organisation des réseaux neuronaux en assemblages de nœuds et en modules, avec des schémas de connectivité précis^10,11. Le rôle de la connectivité et des motifs de microcircuits ne peut cependant pas être étudié de manière adéquate in vivo en raison du grand nombre de synapses impliquées, ainsi que des effets imbriqués du développement et de la plasticité dépendante de l’activité.

Transfert de signal : Dans les cultures in vivo ou in vitro aléatoires, il est difficile d’évaluer le transfert de signaux. L’examen de la conduction axonale et du potentiel d’action sur toute sa longueur nécessite de guider la croissance des neurites par fonctionnalisation de surface ou par structuration chimique, fournissant un rapport signal/bruit élevé dans les lectures extracellulaires de l’activité électrique¹².

Pertinence translationnelle : Déchiffrer le rôle exclusif des éléments pré- et post-synaptiques dans des conditions pathologiques nécessite d’avoir accès à ces éléments individuellement. Les cultures modulaires à connectivité limitée, séparant efficacement les éléments pré et post-synaptiques, sont des outils indispensables à cette fin¹³.

Plusieurs méthodes existent pour obtenir une certaine forme de structure dans la culture neuronale. Ils peuvent être classés dans la catégorie des manipulations chimiques et physiques de surface⁹. Les premières méthodes ^14,15 reposent sur la propension des cellules neuronales à se fixer à certains composés (bio)chimiques. Cela nécessite de déposer des molécules adhésives ou attrayantes sur une surface avec une précision microscopique et en suivant un motif détaillé. Bien que cela permette une couverture partielle de la surface des cellules, suivant le modèle souhaité, les méthodes chimiques sont intrinsèquement limitées et ont un taux de réussite relativement faible dans le guidage de la croissance des neurites¹⁶. Le contrôle total de la directionnalité axonale nécessite l’établissement d’un gradient spatial de produits chimiques ad hoc pour façonner le guidage axonal¹⁷. Ces dernières méthodes impliquent une manipulation physique de surface et sont plus couramment utilisées pour structurer les réseaux neuronaux in vitro. Les cellules neuronales sont physiquement contraintes aux endroits souhaités par des confinements géométriques, tels que des chambres microscopiques, des parois, des canaux, etc., façonnant un polymère biocompatible tel que le polydiméthylsiloxane (PDMS)3,5,6,7,18,19,20 durci et solidifié dans un dispositif microfluidique. La méthode de facto pour la fabrication microfluidique PDMS est la photolithographie douce²¹, où un masque bidimensionnel est modelé à une échelle microscopique et utilisé pour graver sélectivement un matériau à base de silicium lors d’une exposition aux UV. En un mot, une résine durcissable aux UV (c’est-à-dire la résine photosensible) est appliquée sur une plaquette de silicium par spin-coating, atteignant une hauteur spécifique déterminée par sa viscosité et sa vitesse de rotation. Ensuite, le masque à motifs est positionné sur la résine photosensible et exposé à la lumière UV. Les zones transparentes à l’intérieur du masque, correspondant aux régions d’intérêt, permettront à la lumière UV d’induire une réticulation localisée des molécules de photorésine. Les zones de résine photosensible non exposées sont lavées à l’aide d’un solvant, ce qui entraîne la formation d’un moule maître. Ceci est utilisé à plusieurs reprises pour cuire un élastomère de votre choix (c’est-à-dire PDMS), qui est ensuite gravé avec les géométries souhaitées dans autant de répliques que souhaité. Une telle méthode de fabrication est la méthode la plus courante pour fabriquer des dispositifs microfluidiques²². Les principales limites de la photolithographie douce sont peut-être la condition préalable à un investissement en capital notable et la méconnaissance des laboratoires biologiques avec les techniques et l’expertise requises. La préparation du masque et les étapes de photolithographie douce nécessaires à la conception de géométries complexes à hauteur multiple et à haut rapport d’aspect ne sont pas triviales²³ et nécessitent souvent une sous-traitance. Même si des méthodes alternatives et peu coûteuses ont été proposées, elles ne répondent pas toujours aux exigences de haute précision du prototypage biologique²⁴.

Ici, une méthode de fabrication alternative est présentée, reposant sur la polymérisation à deux photons (2PP) et la fabrication additive. Il est simple et ne nécessite pas en soi une expertise avancée en microfabrication et en microphotolographie. Le domaine de recherche de la microfabrication 2PP a émergé à la fin des années 90²⁵, et depuis lors, il a connu une croissance exponentielle²⁶. Vous trouverez plus d’informations sur les principes fondamentaux de cette technique ailleurs²⁶. En bref, en concentrant l’impulsion lumineuse d’excitation dans un espace tridimensionnel, le 2PP exploite la dépendance non linéaire de l’absorption multiphotonique à l’intensité. Cela confère la capacité d’absorption confinée, assurant une excitation précise et sélective dans des régions très localisées. En substance, une résine photosensible à tons négatifs, un matériau dont la solubilité diminue lors de l’exposition à la lumière, est soumise à un faisceau focalisé d’impulsions laser femtosecondes à un faible facteur de service²⁷. Cela permet des impulsions de haute intensité à de faibles puissances moyennes, permettant la polymérisation sans endommager le matériau. L’interaction des monomères radicaux photo-induits donne naissance à des oligomères radicaux, initiant une polymérisation qui s’étend dans toute la résine jusqu’à un volume distinct, c’est-à-dire un voxel, dont la taille dépend de l’intensité et de la durée des impulsions laser²⁸.

Dans ce travail, deux composantes sont présentées : A) la conception et la fabrication rapide d’un moule imprimé en 3D, réutilisable plusieurs fois pour produire des dispositifs de culture cellulaire neuronale polymère jetables (Figure 1), et B) leur couplage mécanique à la surface de substrats de culture cellulaire neuronale plane, ou encore de réseaux de microélectrodes intégrés au substrat capables d’enregistrements multisites de signaux bioélectriques.

La conception assistée par ordinateur d’un modèle mécanique 3D est très brièvement décrite ici et accompagnée des étapes menant à un moule imprimé en 3D et à la fabrication de dispositifs PDMS est également détaillée.

Une variété d’applications logicielles de conception assistée par ordinateur peuvent être utilisées pour générer le modèle d’objet 3D de départ et produire un fichier STL pour contrôler le processus d’impression 2PP. Dans la table des matières, la première et la dernière application répertoriées sont gratuites ou fournies avec une licence gratuite. La construction d’un modèle 3D nécessite toujours la création d’une esquisse 2D, qui est ensuite extrudée lors des étapes de modélisation suivantes. Pour démontrer ce concept, un processus de conception générique de logiciel de CAO 3D est mis en évidence dans la section protocole, conduisant à une structure faite de cubes superposés. Pour des informations plus complètes, un certain nombre de tutoriels en ligne et de ressources de formation gratuites sont disponibles, comme indiqué dans le tableau des matériaux.

Le fichier STL résultant est ensuite traduit en une série de commandes à exécuter par l’imprimante 3D (c’est-à-dire la procédure de découpage). Pour l’imprimante 3D 2PP spécifique utilisée, le logiciel DeScribe est utilisé pour importer le fichier STL et le convertir au format propriétaire General Writing Language (GWL). Le succès du processus d’impression 2PP dépend de divers paramètres, notamment la puissance du laser et sa vitesse de numérisation, ses distances d’assemblage et de hachures-tranchage. Le choix de ces paramètres, ainsi que la sélection de l’objectif et de la résine photosensible, dépendent des plus petites caractéristiques de la conception, ainsi que de l’application prévue. Ainsi, l’optimisation des paramètres devient essentielle pour répondre aux exigences des différents scénarios de conception et cas d’utilisation. Pour ce travail, la recette recommandée IP-S 25x ITO Shell (3D MF) a été considérée comme une configuration pour les paramètres d’impression. En fin de compte, une pièce imprimée mécaniquement stable est imprimée avec la résolution nécessaire tout en minimisant son temps d’impression 3D.

La conception du moule et le fichier STL associé, démontrés dans ce travail, comprennent un cadre carré pour séparer l’espace d’une culture cellulaire en deux compartiments : une zone externe (c’est-à-dire appelée Source par la suite) et une zone intérieure (c’est-à-dire appelée Cible par la suite). Ces deux compartiments sont reliés par des ensembles de microcanaux, chacun caractérisé par des bordures à angle aigu, conçus pour entraver spécifiquement la croissance des neurites de la cible à la source, mais pas l’inverse, et en tant que tels favoriser une connectivité synaptique directionnelle entre les neurones se développant sur les deux zones.

Des études antérieures utilisaient différentes géométries de microcanaux pour encourager la croissance directionnelle des neurites. Les exemples incluent les formes triangulaires¹⁸, les structures barbelées^{de canal 19} et les canaux effilés²⁰. Ici, une conception comportant des barrières à angle vif sur les bords du microcanal est utilisée, caractérisée également par des entrées asymétriques. Ces microcanaux servent à établir une continuité entre un intérieur fermé, le compartiment Cible, et la zone externe, le compartiment Source. La forme en entonnoir de la partie initiale des microcanaux, du côté de la Source, est conçue pour favoriser la formation de faisceaux axonaux et leur croissance le long du chemin le plus court, c’est-à-dire en ligne droite, reliant la Source à la Cible. L’espace triangulaire réalisé en faisant face à des angles vifs a un volume plus important du côté de la cible pour viser à retarder efficacement la recherche de chemin des neurites tout en favorisant la prise de vue rapide des faisceaux provenant de la Source et l’occupation de l’espace disponible. Le choix de 540 μm pour la longueur des microcanaux filtre efficacement l’excroissance dendritique généralement plus courte³⁹. De plus, leur hauteur de 5 μm empêche les somates cellulaires de pénétrer à travers les microcanaux. Dans l’ensemble, cette configuration s’est avérée favoriser la connectivité unidirectionnelle entre les modules Target externe et Target et elle est présentée ici comme une preuve de principe parmi les nombreux choix alternatifs.

Alors que les dispositifs PDMS, fabriqués par le moule 2PP, peuvent être fixés à la surface de substrats de culture cellulaire courants, tels que des lamelles de verre ou des boîtes de Pétri, dans ce travail, des réseaux de microélectrodes intégrés au substrat disponibles dans le commerce ont été utilisés. Aucun effort n’a été fait pour optimiser la conception 3D à la disposition du réseau de microélectrodes, et le couplage mécanique a été effectué sous guidage de stéréomicroscopie visant uniquement à positionner le dispositif sur le réseau, laissant une partie de la microélectrode découverte des deux côtés, la source et la cible. Cela permet d’évaluer de manière préliminaire les conséquences fonctionnelles de la connectivité contrainte dans les cultures de cellules neuronales.

Toutes les procédures impliquant la manipulation d’animaux ont été effectuées conformément aux lois européennes et italiennes (directive du Parlement européen et du Conseil du 22 septembre 2010 [2010/63/UE] ; Décret gouvernemental italien du 4 mars 2014, n° 26), ont été explicitement approuvés par l’OPBA (Comité pour la protection des animaux) de la Scuola Internazionale Superiore di Studi Avanzati et ont été officiellement autorisés par le ministère italien de la Santé (Auth. n° 22DAB. N.UVD). Celles-ci ont conduit à la disponibilité de matériel non sensible à partir du tissu cérébral de rat explanté, à utiliser pour la validation expérimentale de la méthode présentée dans ce travail.

1. 3D fabrication de moules par polymérisation à deux photons

1. Génération des fichiers CAO
   REMARQUE : Les étapes suivantes illustrent un flux de travail de conception 3D générique, à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (c’est-à-dire SolidWorks). L’exemple de fichier de conception STL décrit dans ce travail (Figure 2) est disponible en tant que fichier de codage supplémentaire 1, ainsi que via Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8222110).
   1. Lancez l’application de bureau du logiciel de conception assistée par ordinateur. Dans la barre de menus supérieure, sélectionnez Nouveau.
   2. Dans les options, choisissez Pièce : représentation 3D d’un composant de conception unique. Appuyez sur la combinaison de touches Ctrl + 5 pour établir la vue de dessus de l’esquisse.
   3. Dans le panneau latéral, sélectionnez Esquisse , puis Rectangle d’angle. Sélectionnez un bord du rectangle en cliquant dessus. Lorsqu’un panneau de paramètres apparaît, définissez la longueur sur 100 unités.
   4. Répétez l’étape 1.1.3 pour l’arête perpendiculaire à la précédente : réglez sa longueur sur 50 unités. Sélectionnez le rectangle en le faisant glisser dessus tout en maintenant le bouton gauche de la souris enfoncé.
   5. Dans le menu Ajouter une relation , sélectionnez Corriger pour contraindre les relations entre les lignes.
   6. Quittez l’esquisse et répétez les étapes 1.1.3 à 1.1.5, en créant un nouveau rectangle (plus petit) qui chevauche l’esquisse précédente.
   7. Dans le panneau latéral, sélectionnez Fonctions, puis choisissez Bossage/Base extrudé : définissez la profondeur du grand et du petit rectangle sur 5 et 10 unités, respectivement.
   8. Dans le menu Fichier , enregistrez l’article au format STL (c’est-à-dire Standard Tessellation Language).
2. Traitement des fichiers CAO
   1. Transférez le fichier STL sur un ordinateur personnel, équipé du logiciel d’application DeScribe.
   2. Lancez Describe et dans son menu Fichier , ouvrez le fichier STL. Une représentation 3D du modèle apparaîtra.
   3. Dans la section d’orientation du menu de droite, faites pivoter le modèle pour l’orienter correctement dans l’espace et centrez-le dans le plan.
   4. Ajustez la mise à l’échelle globale en sélectionnant la section Mise à l’échelle du menu de droite.
   5. Dans le menu déroulant en haut, sélectionnez la recette IP-S 25x ITO Shell (3D MF). Celle-ci spécifie IP-S comme photorésine, 25x pour la puissance de grossissement de l’objectif, le substrat revêtu d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) comme substrat d’impression et l’impression de coque et d’échafaudage comme mode de fonctionnement avec des caractéristiques de taille moyenne (MF).
   6. Naviguez dans l’assistant, en sélectionnant et en définissant la distance de tranchage à 1 μm et la distance de hachures à 0,5 μm pour la coque et l’échafaudage.
   7. Dans l’étape de sortie de l’assistant d’importation, sous Fractionnement, définissez la taille du bloc comme X = 200 μm, Y = 200 μm et Z = 265 μm et le décalage du bloc comme X = 133 μm, Y = 133 μm et Z = 0, en veillant à ce que les structures délicates des microcanaux ne soient pas affectées par les lignes d’assemblage.
   8. En mode de balayage, utilisez la valeur par défaut : Galvo pour le plan X-Y et Piezo pour l’axe Z.
   9. Appuyez sur Enregistrer et, dans le menu textuel suivant, remplacez la ligne var $baseLaserPower = $shellLaserPower par var $baseLaserPower = 75, pour réduire à 75 % la puissance laser à la couche la plus basse de l’impression.
   10. Transférez les fichiers GWL obtenus par les étapes ci-dessus sur le poste de travail dédié à l’impression 3D 2PP.
3. Impression 3D et développement d’échantillons
   1. Lancez le logiciel d’application NanoWrite . Après l’initialisation de l’imprimante, cliquez sur Exchange Holder sur l’interface logicielle, pour insérer le support de substrat et monter l’objectif.
   2. Montez l’objectif 25x dans la position appropriée sur la tourelle porte-objectifs. Identifiez quel côté du substrat de verre est recouvert d’ITO, à l’aide d’un multimètre électronique réglé pour mesurer les résistances : la lecture doit être faible, comme 100-300 Ω, mais uniquement pour le côté revêtu d’ITO.
   3. Positionnez le substrat de verre sur le support, en orientant le côté revêtu d’ITO vers le haut. Utilisez du ruban adhésif pour le maintenir fermement en place.
   4. Sous la hotte chimique, appliquez une goutte de résine photosensible IP-S au centre du substrat de verre.
   5. Insérez le support dans l’imprimante 3D, avec la goutte de résine face à l’objectif (c’est-à-dire vers le bas).
   6. Dans le menu Fichier du logiciel, chargez les fichiers GWL. Sélectionnez Échantillon d’approche pour rapprocher l’objectif de la goutte de résine.
   7. Sélectionnez Rechercher l’interface pour permettre la détection de l’interface d’impression ITO-photorésine, en fonction de la différence d’indice de réfraction des deux matériaux.
   8. Sélectionnez Démarrer la tâche pour lancer l’impression. Une fois l’impression terminée, appuyez sur Exchange Holder pour récupérer le support.
   9. Récupérez le support et retirez délicatement le substrat avec la pièce imprimée. Immerger le substrat de verre dans de l’acétate d’éther méthylique de propylène glycol (PGMEA) pendant 20 min sous la hotte, pour développer la pièce imprimée.
   10. Retirez le substrat des PGMEA et plongez-le dans l’isopropanol pendant 5 min. Laissez sécher la pièce imprimée à l’air libre, sous la hotte chimique.
4. Traitement post-impression et montage du moule
   1. Durcissez la pièce imprimée par exposition à la lumière UV (c’est-à-dire 365-405 nm) avec une puissance suffisante pendant 5 à 20 min (voir la discussion pour plus de détails sur la puissance).
   2. Sous une hotte à flux laminaire, retirez délicatement la pièce imprimée du substrat en verre. Déposez ~2 μL de résine au fond d’une boîte de Pétri de 35 mm x 10 mm.
   3. Positionnez soigneusement la pièce imprimée sur la goutte et laissez la résine couler sous la pièce. Durcissez ensuite la pièce imprimée en l’exposant à la lumière UV, pendant 5 min.
   4. Couvrir la boîte de Pétri avec son bouchon et la transférer au four pour durcissement thermique, plus de 30 min à 80 °C. Ne préchauffez pas le four pour éviter la déformation ou la rupture de la pièce imprimée. Après durcissement, la pièce imprimée sera fixée de manière permanente au fond de la boîte de Pétri. Désormais, la partie imprimée et montée sera appelée moule.

2. Fabrication de dispositifs PDMS à partir des substrats de moisissure et de culture cellulaire

1. Fabrication de dispositifs PDMS
   1. Préparer 20 mL de mélange 10:1 (rapport en poids) de la base et del’agent de durcissement du PDMS non polymérisé. Pour chaque appareil, et en fonction de sa hauteur requise, 1 à 2 mL de mélange PDMS suffisent. Conservez l’excédent de PDMS non polymérisé à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
   2. Sous une hotte à flux laminaire, bien mélanger le mélange pendant 4 min. Comme le mélange emprisonne les bulles d’air uniformément, il deviendra opaque.
   3. Transvasez le mélange dans un tube de 50 μL et centrifugez-le à 168 x g pendant 5 min, pour éliminer les bulles d’air du mélange et obtenir un aspect clair.
   4. Traitez le moule avec 10 μL d’agent hydrophobe (c’est-à-dire Repel-silane ES) et laissez-le reposer pendant 7 min, en assurant un détachement en douceur du PDMS polymérisé du moule par la suite.
   5. Rincer le moule 1x avec 70% d’éthanol et 2x avec de l’eau désionisée (DI). Laissez le moule sécher à l’air libre sous la hotte à flux laminaire.
   6. Versez doucement le mélange PDMS sur le moule, jusqu’à ce que la hauteur finale prévue de l’appareil soit atteinte. Pour éviter la formation de bulles d’air, versez le mélange doucement et à proximité de la surface du moule.
   7. Couvrir le moule et le transférer pendant 18 min dans un four préchauffé et stabilisé à 80 °C, pour le durcissement. Pour les hauteurs d’appareil supérieures à 5 mm et jusqu’à 1 cm, prolongez le temps de durcissement de 18 à 25 min.
   8. Sous la hotte à flux laminaire, détachez délicatement le bloc PDMS durci du moule et plongez-le dans de l’isopropanol pendant au moins 10 min, à l’intérieur d’une boîte de Pétri en verre. L’isopropanol élimine le PDMS non réticulé. Gardez toujours le bloc PDMS couvert.
   9. Renouveler l’isopropanol et, sous un stéréomicroscope, découper soigneusement la section carrée centrale de l’appareil (identifiée comme la zone cible, dans ce travail) à l’aide d’un couteau ophtalmique. Ensuite, procédez à une nouvelle coupe le long des bords pour obtenir la forme finale de l’appareil.
   10. Récupérez l’appareil de l’isopropanol et plongez-le dans de l’éthanol pendant 30 minutes, puis rincez-le 3 fois avec de l’eau DI stérile. Maintenez la stérilité à partir de ce moment.
   11. Sous une hotte à flux laminaire, transférez l’appareil dans une nouvelle boîte de Pétri en laissant son capuchon légèrement ouvert. Laissez-le sécher complètement à l’air libre.
2. Montage de l’appareil et préparation des substrats de culture cellulaire.
   1. Stérilisez chaque réseau de microélectrodes (MEA) en l’immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 30 minutes, puis rincez-le 3 fois avec de l’eau DI stérile.
   2. À l’aide d’une pince fine stérile, sous une hotte à flux laminaire et un stéréomicroscope, montez le dispositif PDMS sur la zone interne d’un MEA. Alignez un côté du dispositif PDMS au centre de la zone MEA interne, avec des microélectrodes intégrées au substrat, de sorte que peu de microélectrodes soient laissées à découvert dans les zones source et cible (voir Figure 2).
      REMARQUE : Pour ce travail, il n’est pas nécessaire d’aligner les microélectrodes MEA sur le microcanal du dispositif PDMS. Une légère pression sur l’appareil peut être nécessaire pour obtenir une étanchéité entre l’appareil PDMS et la surface MEA. Évitez à tout prix de toucher les microélectrodes par la pointe de la pince à épiler.
   3. Insérez le MEA avec le dispositif PDMS dans la chambre de nettoyage du plasma, pour activer l’activation de surface par plasma d’air. Commencez le processus par une évacuation de la chambre par pompe à vide de 4 minutes. Ensuite, ouvrez légèrement la vanne d’air pour permettre une purge d’air contrôlée. Fermez la vanne d’air et allumez les inducteurs de plasma, en ajustant le niveau de puissance RF entre 10 W et 18 W.
   4. Une fois qu’une lumière rougeoyante apparaît, laissez le processus fonctionner pendant 80 s. Ensuite, éteignez l’inducteur de plasma, fermez la vanne de la pompe à vide et ouvrez doucement la vanne d’air. Ouvrez la chambre pour récupérer le MEA.
      REMARQUE : Si le traitement au plasma implique l’exposition d’AEM à un environnement non stérile, placez chaque AEM sous lumière UV dans une hotte à flux laminaire pendant 30 minutes, pour assurer la stérilité.
   5. Ajouter 1 mL de solution de polyéthylèneimine (PEI) à 0,1 % poids/vol dans l’AEM et l’incuber à 37 °C pendant la nuit. Aspirer la solution PEI et rincer à l’eau DI stérile 5x. Ajouter 1 mL du milieu de culture cellulaire à l’AEM et l’incuber avant l’ensemencement cellulaire.

3. Culture de cellules neuronales et électrophysiologie

1. Préparez à l’avance le milieu de dissection, la solution de digestion et les solutions 1 à 3 (voir tableau 1).
2. Culture de cellules neuronales dissociées.
   1. Saisissez doucement un ratot Wistar nouveau-né âgé de 0 à 1 jour par le museau et effectuez une décapitation rapide à l’aide d’une paire de ciseaux tranchants.
   2. Décollez la peau du cuir chevelu, faites une incision le long de la ligne médiane sagittale du crâne à l’aide de ciseaux fins, puis créez une coupe coronale à travers le crâne à la jonction du cervelet.
   3. Retirez le crâne, retirez le cerveau à l’aide d’une spatule fine et transférez-le dans un milieu de dissection froid (4 °C).
   4. Retirez le tissu sous-cortical, l’hippocampe et les méninges. Émincez le tissu en petits morceaux (c.-à-d. 1-2 mm³) et transférez-les dans un tube de 15 ml. Jetez la solution et rincez le tissu à l’aide d’un milieu de dissection frais, suivi d’un lavage avec un milieu de digestion.
   5. Jeter le milieu de digestion, puis ajouter 1 mL de la solution 1. Incuber le mélange à 37 °C pendant 5 min. Jeter la solution 1 et rincer le tissu avec un milieu de dissection frais. Ajouter ensuite 1 mL de solution 2 et conserver le mélange pendant 10 min à 4 °C.
   6. Jeter la solution 2 et rincer le tissu à l’aide d’un milieu de dissection frais. Ajouter ensuite 1 mL de solution 3. Dissocier mécaniquement les cellules en pipetant lentement la solution de haut en bas 20 à 30 fois. Lorsqu’un mélange uniformément trouble de cellules dissociées apparaît, augmentez son volume à 3 mL en ajoutant du milieu de dissection.
   7. Recueillir la pastille cellulaire en centrifugeant le mélange à 100 x g pendant 5 min. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture préchauffé.
   8. Comptez les cellules (c.-à-d. par une chambre de comptage cellulaire) et ajustez la densité de la solution d’ensemencement cellulaire en conséquence.
   9. Ensemencer chaque AEM avec 1 mL de solution d’ensemencement d’une densité cellulaire nominale de 1,8 x 10⁶ (~ 6500 cellules/mm²). Incuber les AEM ensemencés dans un incubateur humide à 37 °C et 5 % de CO₂. Remplacez le milieu par un milieu de culture frais (c.-à-d. fabriqué chaque semaine) tous les 2 jours.
3. Électrophysiologie extracellulaire
   REMARQUE : Les cultures de cellules neuronales dissociées atteignent un phénotype électrique complètement mature après 2-3 semaines in vitro. Les sections suivantes décrivent un protocole de stimulation extracellulaire utilisant un logiciel d’application MEA commercial (Experimenter) pour stimuler électriquement l’une ou l’autre des populations neuronales cultivées en modules, c’est-à-dire Source ou Cible, tout en enregistrant simultanément l’activité des deux populations, dans des réseaux matures.
   1. Montez délicatement un MEA à l’intérieur de la tête de l’amplificateur électronique multicanal, à l’intérieur d’un incubateur sec (37 °C, 5 % CO₂) et laissez-le s’adapter pendant 10 min. Un bouchon PDMS personnalisé peut être fabriqué séparément et utilisé comme couverture étanche pour chaque MEA, afin de réduire l’évaporation de l’eau et de maintenir la stérilité.
   2. Lancez le logiciel Experimenter. Réglez la fréquence d’échantillonnage sur 25 kHz et lancez l’acquisition des données en appuyant sur Start DAQ. Dans le panneau Affichage des données, les traces brutes de l’activité enregistrée extracellulaire pour chaque canal s’affichent.
   3. Surveillez l’activité spontanée et identifiez visuellement et sélectionnez 3 paires de microélectrodes voisines qui sont actives pendant les rafales d’activités synchronisées spontanées à l’échelle du réseau, soit à partir des microélectrodes côté source ou cible.
   4. Dans le panneau de stimulation du logiciel, configurez les paramètres de chacune des paires de microélectrodes stimulantes en configuration bipolaire : sélectionnez une forme d’onde d’impulsion biphasique et réglez les amplitudes de crête à ± 800 mV et la durée d’impulsion à 200 μs.
   5. Réglez l’enregistreur et enregistrez pendant une période de 300 ms avant à 1000 ms après la stimulation.
   6. Répétez les étapes 3.3.3 à 3.3.5 pour le côté source et le côté cible de manière entrelacée pour le nombre de répétitions requis.

La fabrication d’un dispositif de culture cellulaire polymère (neuronal) à 2 compartiments est rapportée ici, illustrant l’utilisation de l’impression 3D 2PP pour le prototypage rapide de dispositifs PDMS. Plus précisément, un dispositif est produit pour les réseaux neuronaux modulaires avec une connectivité synaptique unidirectionnelle et sa caractérisation fonctionnelle est présentée en termes d’électrophysiologie extracellulaire multisite. En bref, un moule à l’échelle micrométrique a été réalisé au moyen d’une écriture laser directe, à l’aide d’une imprimante 3D disponible dans le commerce. En particulier, l’imprimante délivre une puissance de 50 mW grâce à des impulsions laser avec une longueur d’onde centrale de 780 nm et une durée de 80 à 100 fs. Pendant le processus de fabrication, le faisceau laser est focalisé à travers l’objectif (25x, NA=0,8) de l’imprimante sur la résine photosensible à tons négatifs (IP-S) pour balayer le volume d’impression à l’aide du scanner galvo pour les axes x et y, et de la platine piézoélectrique pour l’axe z. Le volume d’impression a été convenablement divisé en blocs de 200 mm x 200 mm x 265 mm pour réaliser un moule de taille totale de 6500 mm x 6500 mm x 545 mm et un volume nominal de 12,423 ml. La figure 2A représente un croquis 2D du moule, mettant en évidence ses dimensions et la taille de ses caractéristiques, tandis que la figure 2B montre une photo en gros plan de l’appareil fini monté sur un MEA. Les moules préparés comme décrit dans la section précédente étaient durables et pouvaient être réutilisés plus de 50 fois pour fabriquer des dispositifs PDMS.

Le moule imprimé a été utilisé pour couler le dispositif PDMS, qui a ensuite été monté sur la zone interne des réseaux intégrés de microélectrodes (MEA) à substrat de verre, pour être utilisé pour les enregistrements extracellulaires multisites de l’activité électrique neuronale et comme preuve de principe. Des AEM commerciaux intégrés au substrat ont été utilisés pour surveiller l’activité des cultures modulaires en réponse à des stimuli électriques localisés dans l’espace délivrés extracellulairement par un sous-ensemble de microélécrodes situés dans chaque compartiment de culture. Chaque MEA contient 120 microélectrodes en nitrate de titane (TiN) d’un diamètre de 30 μm et d’un pas inter-électrode de 100 μm. La figure 2C-D montre l’emplacement du dispositif PDMS sur le dessus du MEA. Les caractéristiques géométriques des microcanaux individuels du dispositif ainsi que l’empreinte globale de la chambre montrée à la figure 2C, conduisent à une compartimentation des neurones en culture. Ceux-ci peuvent être distingués en fonction du compartiment auquel ils appartiennent, dans la zone extérieure (Source) de l’appareil ou dans la zone intérieure (Cible) de l’appareil. Le guidage axonal préféré, restreint de la source à la cible, est dicté par les bords à angle vif des microcanaux. La figure 2D montre l’emplacement du dispositif polymère sur le MEA et la zone de couverture relative des électrodes d’enregistrement situées dans les compartiments Source ou Cible. Notez qu’un alignement précis de l’intérieur des microcanaux du dispositif sur une ou plusieurs rangées de microélectrodes MEA n’était ni nécessaire pour notre étude de cas ni poursuivi.

Des preuves représentatives de la croissance asymétrique des neurites sont fournies dans la figure 3, au cours du développement ex vivo, montrant des neurites marqués par fluorescence en imagerie vivante, 6 jours (figure 3A) et 2 jours après le placage cellulaire (figure 3B-D). Alors que les neurites du côté cible de l’appareil rencontraient des barrières à angle aigu comme obstacles entravant leur progression dans l’espace, les neurites provenant du côté source se développaient sans interruption et traversaient les canaux. Cette asymétrie favorise une connexion axonale unidirectionnelle entre les neurones des deux compartiments, projetant de la source à la cible, comme explicitement prévu dans la conception. Ce résultat est en outre soutenu par une évaluation électrophysiologique (fonctionnelle) des réponses électriques évoquées par des stimuli délivrés alternativement dans chacun des deux compartiments.

Après 3-4 semaines in vitro, alors que les réseaux neuronaux atteignaient leur pleine maturité29,30, la connectivité fonctionnelle entre les deux compartiments a pu être sondée en délivrant de brefs stimuli électriques et en surveillant les réponses neuronales qu’ils évoquaient31. Des impulsions électriques biphasiques d’une amplitude de 800 mV ont ensuite été appliquées alternativement uniquement à la Source ou uniquement aux populations cibles (N répétitions = 150, N cultures modulaires = 6), délivrées par 3 paires juxtaposées de microélectrodes planes dans une configuration bipolaire, et de manière entrelacée. Par conséquent, les 3 paires d’électrodes peuvent être situées dans la zone Source de l’AEM ou dans la zone cible de l’AEM. Les réponses électriques évoquées par chaque stimulus pourraient ensuite être détectées par toutes les microélectrodes MEA après un délai de propagation. Les enregistrements ont été effectués avec une fréquence d’échantillonnage de 25 kHz/canal, et les signaux électriques bruts extracellulaires qui en ont résulté ont été numérisés à une résolution de conversion analogique-numérique de 16 bits. Un algorithme de détection de pic de franchissement de seuil32 a été utilisé hors ligne pour détecter le moment d’apparition des potentiels d’action extracellulaires, sans effectuer de tri des pointes. Les figures 4A-B dévoilent clairement une forte asymétrie des réponses évoquées, répétées 150 fois, en fonction de la localisation de la délivrance du stimulus, suggérant un impact fonctionnel significatif des contraintes géométriques sur la directionnalité préférée de la connectivité. En fait, en stimulant le côté Source, le taux de décharge de la population neuronale Source - estimé en calculant l’histogramme des temps de pic péri-stimulus - a augmenté comme prévu, générant une rafale complète de potentiels d’action 33,31,34 et il a été suivi, après un délai, d’une augmentation du taux de décharge de la population cible. Cependant, comme la stimulation était délivrée au sein de la population cible, seule la cadence de tir de la population cible augmentait, la population source restant principalement silencieuse. La figure 4C-D répète le même paradigme stimulus/réponse dans une culture témoin, sans dispositif polymère présent (c’est-à-dire une culture neuronale non structurée), les stimuli extracellulaires ont également été délivrés sur 4 répétitions. Pour de telles conditions de contrôle, aucune asymétrie ne s’est produite dans les réponses évoquées par l’un ou l’autre stimulus. Alors que le sous-ensemble de microélectrodes MEA utilisées pour délivrer les stimuli correspondait à celui utilisé dans les réseaux modulaires, l’emplacement de l’administration du stimulus a conduit à une réponse évoquée similaire de la part de l’ensemble de la population. Cela confirme que le dispositif PDMS favorisait la connectivité synaptique unidirectionnelle, à travers les deux compartiments. Dans l’ensemble, les réponses asymétriques évoquées dans les cultures modulaires (N = 6) et les réponses symétriques évoquées dans les cultures témoins (N = 4) indiquent fortement une connectivité anatomique contrainte d’un système in vitro compartimenté. Les données électrophysiologiques et les scripts utilisés pour générer la figure 4 sont disponibles via Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.8220990).

Figure 1 : Croquis de la fabrication du micro-moule 2PP et du moulage de répliques PDMS. (A) Un modèle 3D est conçu en CAO et exporté dans un fichier au format STL (Standard Tessellation Language), (B) instruisant son impression 3D à 2 photons par polymérisation induite par laser dans une goutte de résine (IP-S). (C) La structure résultante est utilisée comme moule pour la fabrication répétée de répliques PDMS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Exemple de prototypage rapide en interne d’un dispositif PDMS de culture cellulaire polymérique (neuronale). (A) En moins de 24 h, la fabrication additive à micro-échelle permet de passer d’un modèle CAO à un master imprimé en 3D, pour être utilisé immédiatement, et de manière répétée, comme une réplique de moule avec des élastomères biocompatibles, tels que PDMS. (B-C) Les dispositifs PDMS qui en résultent sont couplés à un substrat planaire de culture cellulaire neuronale, représenté ici par un réseau de microélectrodes. Pour le plan d’échantillonnage spécifique en (A), deux chambres sont définies : l’une appelée Source et indiquée par S, et l’autre appelée Cible et indiquée par T. (D) Les neurones plaqués dans chaque chambre ne peuvent développer leurs neurites que par une série de microcanaux. Lorsqu’ils sont alignés de manière appropriée sous guidage de stéréomicroscopie en (C), deux ensembles de microélectrodes intégrées au substrat sont laissés exposés, de sorte que l’activité bioélectrique des neurones voisins situés dans les deux compartiments peut être stimulée et enregistrée. Notez ici que l’alignement des microélectrodes dans des microcanaux individuels n’était pas la priorité de cette preuve de principe. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Imagerie en direct de molécules rapporteures fluorescentes imperméables aux cellules, identifie les neurites allongées par les neurones, quelques jours après le placage cellulaire. (A-D) Des micrographies confocales représentatives de la fluorescence des cultures neuronales modulaires du dispositif fabriquées à partir des figures 1 et 2 (N = 4, 128 microcanaux individuels) ont été acquises 2 et 6 jours après le placage des cellules. (B-D) Le grossissement 40x et une échelle de gris inversée des micrographies pour une visibilité accrue. Les terminaisons des microcanaux des compartiments Source et Cible sont désignées respectivement par S et T. (A) montre l’image à balayage large de la culture, où la source (c’est-à-dire la zone carrée interne) et la cible (c’est-à-dire la zone externe) sont pleines de cellules, 6 jours après le placage. (B) et (C) affichent, au point temporel antérieur de 2 jours après le placage, la croissance des neurites à la source et à la cible des microcanaux, respectivement. Les petits triangles noirs indiquent des exemples représentatifs de terminaisons de faisceaux axonaux présumés, provenant apparemment uniquement de la Source. Les limites des microcanaux en forme de flèche indiquent l’allongement des neurites le long du bord (B), où leur passage est ininterrompu et guidé vers la cible. Dans la direction opposée, et à côté de l’extrémité cible d’un microcanal (C), les neurites provenant de la cible et avançant vers le côté source sont piégés dans les angles vifs. (D) révèle en outre les détails de la croissance des neurites à l’intérieur d’un microcanal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Caractérisation fonctionnelle des réponses électriques neuronales, avec et sans le dispositif PDMS. Les AEM ont été utilisés comme substrats de culture cellulaire et utilisés pour mesurer les réponses de dopage à l’échelle du réseau évoquées par une très brève impulsion de stimulation électrique biphasique (c.-à-d. 200 μs, 0,8 V), délivrée dans une configuration bipolaire. Avec le dispositif PDMS de la figure 2, les réponses neuronales enregistrées à partir de la source (rouge) et de la cible (bleu) diffèrent selon l’endroit où le stimulus est délivré. Des retards axonaux, synaptiques et d’intégration présumés deviennent apparents en (A) mais pas en (B), suggérant l’existence d’une connectivité synaptique préférée (c’est-à-dire de la source à la cible). (C-D) Dans des conditions de contrôle (c’est-à-dire sans dispositif PDMS), les réponses évoquées détectées à deux ensembles distincts de microélectrodes MEA ne dépendent pas de l’emplacement d’administration du stimulus. L’ombrage de couleur pâle, enveloppant les lignes dans les graphiques, indique l’erreur-type instantanée de la moyenne (N stimuli = 150). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Tableau des solutions. Reportez-vous au tableau des matériaux pour les descriptions des produits.

Fichier de codage supplémentaire 1 : Le fichier de conception STL correspond à la structure représentée à la figure 2A. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.