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Collecte simultanée de cerveau et de sérum de souris fœtales pour évaluer les effets de l’alimentation maternelle sur la nutrition et le développement neurologique dans la neurofibromatose de type 1

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DOI :

10.3791/66226

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17 mai 2024

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1Department of Pediatrics, Washington University in St. Louis

Dans cet article

Résumé

Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de collecte simultanée de tissu cérébral fœtal ainsi que de sérum non hémolysé de haute qualité à partir du même embryon de souris. Nous avons utilisé cette technique pour interroger comment l’exposition alimentaire maternelle affecte les profils de macronutriments et le développement neurologique fœtal chez des souris hétérozygotes pour Nf1 (neurofibromatose de type 1).

Résumé

Il a été démontré que l’obésité induite par l’alimentation maternelle modifie le développement neurologique de la progéniture, ce qui peut entraîner une réduction des capacités cognitives, une hyperactivité et des altérations du comportement social. Les patients atteints de la maladie génétique cliniquement hétérogène Neurofibromatose de type 1 (NF1) peuvent présenter des déficits similaires, mais il n’est actuellement pas clair si des facteurs environnementaux tels que l’alimentation maternelle influencent le développement de ces phénotypes, et si oui, le mécanisme par lequel un tel effet se produirait. Pour permettre d’évaluer comment l’exposition maternelle au régime obésogène affecte les facteurs systémiques pertinents pour le développement neurologique dans la NF1, nous avons mis au point une méthode pour collecter simultanément du sérum non hémolysé et des cerveaux entiers ou micro-disséqués régionalement à partir de progénitures fœtales de mères murines nourries avec un régime témoin par rapport à un régime riche en graisses et en saccharose. Les cerveaux ont été traités pour la cryosection ou la congélation instantanée afin d’être utilisés pour l’isolement ultérieur de l’ARN ou des protéines ; La qualité du tissu collecté a été vérifiée par immunomarquage. La qualité du sérum a été vérifiée en analysant les profils de macronutriments. En utilisant cette technique, nous avons identifié que le régime obésogène maternel augmente le cholestérol sérique fœtal de la même manière entre les chiots WT et Nf1-hétérozygotes.

Introduction

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est considérée comme une RASopathie, un groupe de troubles caractérisés par des mutations génétiques germinales entraînant l’activation de la voie de signalisation RAS/MAPK (RAt Sarcoma virus/Mitogen-activated Protein Kinase). Les patients atteints de la RASopathie NF1 sont à risque de développer de nombreuses manifestations différentes, y compris des tumeurs bénignes et malignes du système nerveux central (gliome de la voie optique 1,2, gliome de haut grade 3,4) et périphérique (neurofibrome plexiforme 5,6, tumeur maligne de la gaine nerveuse périphérique 7,8) ainsi que des dysplasies osseuses9 et des anomalies pigmentaires cutanées10 (taches de rousseur axillaires, macles café-au-lait). L’effet de ce trouble sur la cognition et le développement neurologique est de plus en plus reconnu, les patients atteints de NF1 présentant une incidence accrue de déficits d’apprentissage, d’hyperactivité et de troubles du spectre autistique 11,12,13. Cependant, il existe une hétérogénéité significative dans le développement de ces phénotypes entre les patients 13,14,15,16,17, et il n’est pas clair pourquoi certains patients présentent des troubles cognitifs significatifs alors que d’autres ne sont pas affectés. Il a été démontré que l’obésité induite par l’alimentation maternelle affecte de la même manière l’apprentissage et le comportement dans la population générale 18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28, ce qui suggère que les expositions alimentaires maternelles différentielles à NF1 pourraient être l’une des sources de cette hétérogénéité clinique. En particulier, les enfants de mères obèses présentent un risque accru de développer une hyperactivité 18,19,20,23,25,26, un autisme 19,24,27, des déficits des fonctions exécutives 21,23 et des scores de QI à grande échelleplus faibles 22,28. Cependant, les patients atteints de NF1 ont des phénotypes métaboliques modifiés par rapport à la population générale, y compris une diminution de l’incidence de l’obésité et du diabète 29,30,31, ce qui fait qu’il n’est pas clair s’ils répondraient de la même manière aux stimuli diététiques.

Pour répondre à ces questions, nous avons souhaité déterminer si les changements induits par le régime obésogène du profil macronutritionnel chez la progéniture fœtale avec Nf1 contribuaient aux changements neurodéveloppementaux. Nous avons précédemment collecté des tissus entiers et micro-disséqués de haute qualité adaptés aux applications neurodéveloppementales dans le cerveau fœtal32. Cependant, la collecte de sang fœtal est difficile en raison de la petite taille du corps et du faible volume sanguin33. La collecte de sang par drainage assisté par gravité après la décapitation a conduit à de faibles volumes de collecte et à une hémolyse importante dans nos échantillons, ce qui peut affecter l’interprétation de l’application en aval. Le prélèvement par aspiration à partir du cœur fœtal ou des vaisseaux thoraciques, comme cela a été signalé précédemment33, était techniquement difficile et entraînait également une hémolyse fréquente. Nous avons donc développé une méthode de collecte de sérum fœtal, qui utilise des tubes capillaires spécialisés pour permettre une collecte de volume plus élevé sans stress de cisaillement important.

Ici, nous présentons cette méthode pour collecter simultanément des cerveaux embryonnaires et du sérum fœtal de petits hétérozygotes Nf1 exposés à un régime riche en graisses et en sucre par rapport à un régime témoin in utero (Figure 1 et tableau supplémentaire S1). Les cerveaux ont été cryo-intégrés pour une analyse ultérieure par immunofluorescence ou micro-disséqués régionalement et congelés pour une utilisation ultérieure dans des applications de biologie moléculaire. Un sérum de haute qualité a été obtenu, adapté aux applications en aval telles que le profilage des macronutriments. En utilisant cette méthode, nous avons identifié que l’exposition alimentaire maternelle à haute teneur en graisses et en saccharose entraîne une élévation des taux de cholestérol sérique chez les petits hétérozygotes WT et Nf1.

Protocole

Toutes les procédures animales de cette étude ont suivi les directives du NIH et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université Washington à St. Louis. Les animaux ont été logés avec un cycle standard de 12 h lumière/obscurité et un accès libre à la nourriture et à l’eau.

1. Alimentation maternelle

  1. Placez les souris femelles sous régime alimentaire témoin (CD) ou obésogène (Ob) à l’âge de 4 semaines.
  2. À l’âge de 8 à 12 semaines, établissez un accouplement chronométré en surveillant le bouchon muqueux du barrage tôt le matin pour déterminer l’âge de collecte correct. Pour vérifier l’obésité induite par l’alimentation, pesez les femelles lors de l’accouplement.
    REMARQUE : Une plage de 8 à 12 semaines a été utilisée pour la configuration d’accouplement initiale afin de s’assurer que les femelles obésogènes nourries au régime étaient en surpoids par rapport à leurs homologues, ce qui ne se produisait pas toujours à l’âge de 8 semaines. Le jour de la prise est considéré comme le jour embryonnaire 1 (E1), et tous les animaux utilisés dans cette étude ont été collectés à E19. Le point temporel tardif du fœtus a été choisi en raison des changements neurodéveloppementaux précédemment observés à ce moment-là chez les animaux obésogènes exposés au régime alimentaire (données non présentées).

2. Retrait du fœtus du barrage

  1. Tout d’abord, assurez-vous que la digue semble gravide (forme et plénitude de l’abdomen, palpation abdominale ou mouvement du fœtus). En cas de doute, pesez à nouveau la femelle pour mesurer la prise de poids.
    REMARQUE : Les souris enceintes tardives devraient présenter un gain de poids d’au moins 3 à 4 g. Pour augmenter la probabilité de conception dans le délai souhaité, de la sciure de bois sale (contenant de l’urine et des phéromones) de la cage d’un mâle peut être ajoutée à la cage de la femelle tous les jours pendant 3 jours avant l’accouplement pour induire l’œstrus34.
  2. Euthanasier le barrage en le plaçant dans une chambre avec un essuie-tout contenant 3 mL d’isoflurane, en prenant soin d’éviter tout contact direct entre le barrage et l’essuie-tout imbibé d’anesthésique. Une fois que l’animal est sous sédation, placez-le sur une serviette en papier, tenez-le par la queue, placez des ciseaux de dissection sur le cou, puis forcez les ciseaux vers le haut vers la tête pour effectuer une luxation cervicale. Alternativement, effectuez la décapitation après la sédation à l’isoflurane.
    REMARQUE : Le sérum peut être prélevé de la mère à cette étape, en utilisant une méthodologie similaire à celle décrite ci-dessous, mais avec des tubes capillaires plus grands. Si cela est souhaité, une décapitation plutôt qu’une luxation cervicale doit être effectuée. Il faut veiller à ce que le phénotype d’intérêt ne soit pas altéré par l’administration d’isoflurane immédiatement avant l’euthanasie.
  3. Placez la digue ventrale vers le haut dans un plat de 100 mm. Pincez la peau recouvrant l’abdomen et faites une incision médiane avec des ciseaux de dissection. Faites des incisions supplémentaires perpendiculaires à l’incision médiane pour créer des lambeaux cutanés afin d’exposer l’utérus contenant les embryons.
  4. Retirez l’utérus de la cavité abdominale. À l’aide de ciseaux, déconnectez l’utérus de la digre. Placez le sac embryonnaire intact (« perles sur un fil ») contenant les embryons dans une boîte contenant une solution saline froide stérile tamponnée au phosphate (PBS). Placez le plat de fœtus sur de la glace.
    REMARQUE : Comme chaque portée contient généralement 6 à 10 petits qui seront récoltés pour le cerveau et le sérum, les fœtus sont maintenus sur de la glace pour éviter la dégradation des tissus. Placer les chiots sur de la glace garantit en outre une euthanasie adéquate des petits, car l’euthanasie maternelle seule n’est pas toujours suffisante. Si seule la collecte de sérum est souhaitée, la collecte à température ambiante peut être préférée.

3. Prélèvement de sérum fœtal

  1. Retirez le fœtus du sac embryonnaire en le disséquant soigneusement avec une pince #5. Transférez l’embryon dans une boîte à l’aide d’une pince incurvée avec du PBS frais et froid stérile.
  2. Épongez doucement l’animal sur une serviette en papier pour éliminer le liquide amniotique résiduel et le PBS de l’échantillon.
  3. Tenez l’animal par l’abdomen. Décapitez partiellement l’animal avec des micro-ciseaux en faisant une incision au niveau du cou ventral. Assurez-vous que les vaisseaux sanguins sont coupés, mais que la peau qui maintient la tête est toujours attachée.
    REMARQUE : La tête doit rester attachée afin que le sang puisse être collecté simultanément du corps et de la tête.
  4. Tenez le corps à un angle de 45° avec l’incision vers le bas. Tenez la minivette (tube capillaire) de 50 μL parallèlement au site d’incision de la digue où le sang forme une gouttelette. Laissez soigneusement le tube capillaire de 50 μL se remplir de sang.
    REMARQUE : Le tube capillaire x2 ou 100 μL peut être utilisé pour collecter jusqu’à ~75 μL de sang.
  5. Placez la tête dans un plat frais de 60 mm contenant du PBS froid et stérile pour un prélèvement ultérieur de tissus (section 4).
  6. Une fois que le sang se trouve dans le tube capillaire, appuyez rapidement sur le piston dans un tube de 1,5 ml. Agitez le tube ou faites-le tourner rapidement pour vous assurer que le sang se trouve au fond du tube.
  7. Répétez l’opération pour le reste de la portée.
    REMARQUE : Il est essentiel de garder les petits sur de la glace et de se déplacer rapidement entre eux pour réduire le risque de coagulation post-mortem qui limitera le volume de collecte.
  8. Faites coaguler le sang à température ambiante pendant 30 min.
  9. Centrifuger les échantillons de sang à 4 °C, 16 000 × g pendant 20 min.
  10. Transférez le sérum dans des tubes frais de 500 μL à l’aide d’une pipette de 200 μL, sans perturber la pastille de cellules sanguines au fond du tube.
    REMARQUE : Le sérum doit être de couleur paille sans débris rouges. Chaque fœtus doit produire 15 à 30 μL de sérum.
  11. Conservez le sérum recueilli à -80 °C.

4. Prélèvement de cerveau fœtal

  1. En regardant à travers le microscope de dissection, tenez le museau à l’aide d’une pince incurvée et utilisez la pince #5 pour décoller soigneusement la peau de la calotte crânienne, en la maintenant attachée au museau pour faciliter la tenue. Inclinez la pince #5 à 45° par rapport au crâne, percez soigneusement la membrane transparente qui est le crâne en développement, déplacez la pince parallèlement au crâne, insérez-la sous la calotte crânienne, puis pincez et pelez d’un côté. Une fois qu’un côté est retiré, saisissez le côté restant avec une pince #5 et pelez-le de l’autre côté.
  2. Retirez délicatement le cerveau du crâne à l’aide d’une micro-cuillère et transférez le cerveau dans un plat frais de 60 mm contenant 1x PBS froid.
    REMARQUE : À ce stade, des cerveaux entiers peuvent être fixés et intégrés pour l’immunomarquage. Voir méthodologie32, publiée précédemment.
  3. Si le tissu doit être congelé pour d’autres applications moléculaires, sous-disséquez la zone d’intérêt. L’isolement du tissu périventriculaire autour des ventricules latéraux, troisième et quatrième est décrit ci-dessous.
    1. À l’aide de la pince incurvée, tenez le cerveau à la jonction du cerveau postérieur et du cerveau antérieur avec la main non dominante. Avec la main dominante, tenez le scalpel avec la lame parallèle à la surface du cerveau. Appuyez fermement sur la région médio-corticale (Figure 1).
    2. Toujours en tenant le cerveau postérieur, faites une deuxième incision devant le cerveau postérieur pour le séparer du cerveau antérieur (Figure 1). Dans la section la plus antérieure, recherchez deux petits espaces semi-circulaires situés dans le plan horizontal, qui sont les ventricules latéraux. Utilisez la pince incurvée placée au centre de chaque ventricule pour maintenir le cerveau en place, disséquez soigneusement la muqueuse à l’aide de la pince #5 et retirez-la dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml fraîchement nettoyé.
    3. Dans la section médiane, recherchez un petit espace linéaire sur la surface ventrale, qui est le troisième ventricule. À l’aide de la pince #5, pincez soigneusement la muqueuse de chaque côté de la surface ventriculaire, puis retirez-la dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml fraîchement nettoyé.
    4. Dans la section la plus postérieure, recherchez un petit espace linéaire central dans le cerveau postérieur, qui est le quatrième ventricule. Disséquez la muqueuse des deux côtés à l’aide d’une pince #5, puis retirez-la dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml fraîchement et propre.
      REMARQUE : Si le tranchage du cerveau postérieur n’est pas une coupure nette, le quatrième tissu du ventricule peut être obscurci et/ou détruit.
    5. Pour les étapes 4.3.2 à 4.3.4, immédiatement après que le tissu a été placé dans des tubes de microcentrifugation, placez rapidement les tubes dans un récipient cryo-étanche contenant de l’azote liquide.
      REMARQUE : Les tubes peuvent être conservés dans de l’azote liquide jusqu’à ce que les échantillons restants aient été disséqués. ATTENTION : L’azote liquide peut provoquer de graves engelures. Ne mettez pas les mains directement dans l’azote liquide et évitez les éclaboussures.
    6. Placez le(s) tube(s) congelé(s) sur de la glace sèche et transférez les mouchoirs congelés dans un congélateur à -80 °C jusqu’à utilisation.

Résultats

Pour illustrer la qualité du tissu cérébral obtenu par cette technique, nous montrons des échantillons de cerveaux fœtaux de souris Nestin-CFPnuc35, immunomarqués pour la GFAP selon une technique précédemment rapportée32. Des cellules Nestin+ tapissent le ventricule latéral (Figure 2A), avec des filaments GFAP+ s’étendant à partir de la surface. Nous n’avons pas observé de différences entre l’expression de Nestin ou de GFAP dans le ventricule latéral des souris MC par rapport aux souris exposées à l’Ob dans les souches hétérozygotes WT ou Nf1 (Figure 2A,B). Nous avons ensuite évalué la qualité des tissus microdisséqués. Nous avons d’abord effectué le western blot36 pour la protéine d’entretien β-actine sur le tissu microdisséqué isolé des ventricules latéraux de souris atteintes de la maladie de Crohn par rapport à des souris exposées à l’Ob. Tous les échantillons ont montré une forte expression de la β-actine (figure 2C), comme prévu. Nous avons ensuite isolé l’ARN du tissu microdisséqué selon la méthodologie précédemment rapportée32. L’ARN isolé présentait à la fois une pureté (260/280 ≥ 2) et une intégrité élevées (valeurs RIN ≥ 9), ce qui indique un ARN de haute pureté et non dégradé (Figure 2D).

Nous avons ensuite comparé les différentes méthodes d’isolement sérique. En utilisant notre méthode de minivette, nous avons régulièrement collecté de plus grands volumes de sérum non hémolysé, tandis que le drainage par gravité et la ponction thoracique ont entraîné une collecte de volume très variable et une hémolyse dans de nombreux échantillons (Figure 3A,B). Pour illustrer la qualité du sérum obtenu grâce à cette technique, nous avons mesuré le taux de cholestérol sérique total à l’aide du réactif de cholestérol total conformément aux instructions du fabricant. Le taux de cholestérol fœtal se situait dans la fourchette attendue chez les petits en fin de gestation, d’après des études antérieures chez des fœtus humains37. Les concentrations ont augmenté chez les souris exposées à l’Ob par rapport aux souris exposées à la CD chez les petits de type sauvage (figure 3C, à gauche) et hétérozygotes Nf1 (figure 3C, à droite). Notez que le panneau de droite représente les données combinées de deux souches hétérozygotes Nf1 différentes avec des mutations germinales identifiées par le patient (R681X, C383X)32,38,39 car des profils similaires ont été observés dans les deux souches.

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Figure 1 : Résumé graphique du flux de travail. Les petits sont d’abord isolés des mères gestantes. Le sérum est ensuite récolté sur les chiots. Enfin, des cerveaux entiers sont isolés chez les petits et, si nécessaire, microdisséqués pour les régions d’intérêt. Graphique réalisé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Résultats illustratifs, tissu cérébral. (A) Des cerveaux cryosectionnés de souris Nestin-CFPnuc, qui expriment une protéine fluorescente cyan localisée nucléairement sous le contrôle du promoteur Nestin, ont été récoltés avec cette méthode et immunomarqués pour la GFAP (rouge) selon la méthodologie précédemment rapportée32. Les cellules positives à la nestine sont visualisées via l’expression endogène de Nestin-CFPnuc (vert). Les noyaux ont été contre-colorés avec du bis-benzimide (bleu). Il n’y avait pas de différences significatives entre les cerveaux atteints de la maladie de Crohn et ceux exposés à l’Ob. Barre d’échelle = 100 μm. (B) Nestin-CFPnuc ; Les petitsNf1 mut/+ ont été évalués de la même manière. La distribution de la GFAP et de Nestin-CFP semblait similaire à celle de la WT et ne variait pas selon les conditions alimentaires. Barre d’échelle = 100 μm. (C) La protéine a été isolée à partir de tissus microdisséqués du VG. Le transfert Western a été effectué selon la méthodologie précédemment rapportée36 avec 20 μg de protéines chargées par voie. Une forte expression de β-actine était détectable dans tous les échantillons. (D) L’ARN a été isolé à partir de tissus microdisséqués conformément à la méthodologie précédemment rapportée32. La qualité de l’ARN a été évaluée à l’aide de rapports 260/280 et de valeurs RIN. Tous les échantillons ont montré d’excellents rapports 260/280 (≥2) et des valeurs RIN (≥9), indiquant une bonne isolation de l’ARN non dégradé. Abréviations : CFP = protéine fluorescente cyan ; GFAP = protéine acide fibrillaire gliale ; WT = de type sauvage ; VG = ventricule latéral ; RIN = Numéro d’intégrité de l’ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Résultats illustratifs et sérum. (A) Le sérum a été prélevé à partir de chacune des méthodes décrites. Le prélèvement à l’aide de la minivette a permis le prélèvement régulier de sérum non hémolysé par rapport au drainage assisté par gravité et à la ponction thoracique. (B) Les volumes typiques de collection de sérum sont indiqués. La collection Minivette a permis une collection plus reproductible de plus grands volumes de sérum. Signification statistique déterminée par ANOVA à un facteur avec comparaisons multiples. (C) Le cholestérol sérique total a été mesuré à partir de la CD par rapport au WT (à gauche) et au sérum fœtal hétérozygote Nf1 (à droite) ; Les animaux exposés à l’obologie présentaient un taux de cholestérol sérique plus élevé dans les deux génotypes. Signification statistique déterminée par le test t. Barres d’erreur : SEM. Abréviations : WT = type wild ; CD = régime témoin ; Ob = régime obésogène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau supplémentaire S1 : Compositions alimentaires. La composition des régimes témoins et obésogènes utilisés dans ce manuscrit est présentée. REMARQUE : Pour un régime faible en gras et sans saccharose qui contrôle mieux les composants alimentaires individuels de D12331, le régime D12328 (researchdiets.com) peut être préféré. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Les méthodes traditionnelles de prélèvement de sang chez la souris comprennent le rétrobulbaire, la veine caudale, la veine saphène, la veine faciale et le saignement de la veine jugulaire 40,41,42. Malheureusement, ces méthodes ne sont pas idéales pour la collecte de sang embryonnaire en raison de la taille de l’animal et de la petite et délicate vascularisation. La collecte de sang par drainage par gravité après la décapitation a conduit à la fois à de faibles volumes de collecte et à une hémolyse significative dans nos échantillons. Les protocoles précédents ont signalé une amélioration des volumes en utilisant une aiguille modifiée de 20 G pour drainer le sang des vaisseaux sanguins thoraciques33 ; Cependant, nous avons trouvé cette technique techniquement difficile et avons observé des taux élevés d’hémolyse, ce qui la rend inadaptée à de nombreuses applications en aval. Notre méthode présente l’avantage d’être collectée par flux sanguin passif, ce qui réduit le risque d’hémolyse due au stress induit par aspiration. Le piston sur le tube capillaire offre également un moyen rapide et efficace d’administrer du sang dans le tube de collecte, minimisant ainsi l’exposition à l’air et limitant la fragmentation des caillots sanguins. Il est important de noter que des tissus cérébraux microdisséqués entiers ou régionaux peuvent ensuite être prélevés sur le même animal, ce qui réduit les besoins totaux d’animaux de laboratoire.

Ce protocole n’est pas sans ajustements pour optimiser la qualité et l’efficacité de la collecte. Pour le prélèvement de sérum, il est crucial de retirer délicatement le liquide embryonnaire et le PBS supplémentaire de l’animal avant le prélèvement sanguin, car un excès de liquide peut rendre l’animal glissant et augmenter la probabilité d’un positionnement médiocre ou instable affectant négativement la qualité du prélèvement sanguin. De plus, le positionnement des doigts tout en tenant l’embryon est essentiel, car le sang collera à un doigt ganté pendant le prélèvement si le doigt est adjacent au tube capillaire. Il est également important de tenir l’ouverture du tube capillaire adjacente au sang qui circule, plutôt que de l’immerger dans celui-ci ; La collecte capillaire sera perturbée si le tube est immergé. Enfin, il faut examiner attentivement l’application en aval pour optimiser la collecte du sérum. Par exemple, le glucose se dégrade avec le temps dans des tubes non traités à température ambiante, de sorte qu’il peut être nécessaire de le collecter dans des tubes contenant du fluorure de sodium ou de l’EDTA pour quantifier avec précision les niveaux de glucose43,44.

Pour le prélèvement de tissu cérébral, l’ablation soigneuse de la peau et du crâne transparent des deux côtés de la tête est essentielle pour une extraction propre. Si un seul côté est disséqué, le cerveau peut coller au crâne lors d’une tentative de retrait, ce qui entraîne une déchirure et une distorsion du tissu. Pour sectionner le cerveau, il est important de faire des tranches simples et nettes pour séparer le cortex antérieur du cortex moyen et le cortex moyen du cerveau postérieur. Avoir plusieurs coupures peut perturber l’intégrité structurelle du tissu ou obscurcir votre point de référence pour la microdissection ultérieure. Enfin, il est crucial de conserver les échantillons sur de la glace jusqu’à leur fixation ou leur congélation instantanée pour éviter la dégradation de l’échantillon.

Bien que nous préférions cette méthode en raison de la collecte régulière de sérum non hémolysé de plus grand volume, elle n’est pas sans inconvénients. Bien que l’hémolyse soit réduite par rapport à d’autres techniques, cette méthode n’élimine pas le risque. Le tube capillaire peut également être obstrué par un caillot sanguin une fois que le sang cesse de couler, il est donc important de travailler rapidement après la décapitation pour atténuer le risque d’échec de la collecte en raison de la coagulation. Le fait de garder les échantillons sur de la glace, ce qui est fait pour préserver l’intégrité de l’échantillon dans ce protocole, peut également nuire à certains phénotypes et peut ne pas convenir à toutes les applications.

En conclusion, cette méthodologie peut être utilisée pour isoler simultanément le sérum ainsi que des cerveaux entiers ou microdisséqués au niveau régional du même fœtus. Cette technique peut être utilisée pour déterminer comment des facteurs systémiques, tels qu’un changement du profil de macronutriments induit par l’alimentation maternelle, pourraient affecter le développement neurologique dans la NF1 ou d’autres troubles.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

N Brossier est soutenu par le Francis S. Collins Scholars Program in Neurofibromatosis Clinical and Translational Research financé par le Neurofibromatosis Therapeutic Acceleration Program (NTAP, Grant # 210112). Cette publication a été financée en partie par le NTAP de la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles de la faculté de médecine de l’Université Johns Hopkins. Soutien supplémentaire de l’Hôpital pour enfants de Saint-Louis (FDN-2022-1082 au NMB) et du Centre de recherche sur le diabète de l’Université de Washington à Saint-Louis (NIH P30 DK020579). La microscopie a été réalisée à l’aide du Centre d’imagerie cellulaire de l’Université de Washington (WUCCI), soutenu par la faculté de médecine de l’Université de Washington, le Children’s Discovery Institute de l’Université de Washington et l’hôpital pour enfants de Saint-Louis (CDI-CORE-2015-505 et CDI-CORE-2019-813) et la Fondation de l’hôpital juif Barnes (3770 et 4642). Les souris Nestin-CFPnuc35 ont été généreusement fournies par Grigori Enikolopov (Renaissance School of Medicine, Stony Brook University, NY), et les souris Nf1 hétérozygotes pour une mutation germinale R681X ou C383X 32,38,39 ont été généreusement fournies par David Gutmann (Washington University School of Medicine, St. Louis, MO). La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
#5/45 PinceDumont  ;11251-35 Forme dela pointe : inclinée 45° ;
4200 TapestationAgilentG2991BAVérifier l’intégrité et la qualité de l’ARN, mesure des valeurs RIN Récipient d’azote
liquide de paillasseThermo Fisher2122Ou un autre récipient cryo-safe
Contrôle ChowPicoLab5053Les régimes de recherche D12328 (faible en gras, faible en sucre) peuvent également être utilisés.
Pince incurvéeCole ParmerUX-10818-25pointe : incurvée 90° ;
Manche de lame de dissectionCole-Parmer Essentials10822-20SS Siegel-Type, lames #10 à #15 EMS
SuperCut Dissection CiseauxMicroscope électronique sciences72996-015½ ; " (139,7 mm), Anticorps GFAP droit
Abcamab7260Dilué 1:350. Bloc avec 10 % de sérum contenant 0,3 M de glycine.
Lames chirurgicales en acier au carbone Glassvan, taille 11Les lames MYCO medical2001T-11#11 permettent une coupe droite et plate
Micro cuillère de laboratoireAz ScilabA2Z-VL001en acier inoxydable, autoclavable
Micro ciseauxRubis78180-1C3modèle 1C300
Minivette  ; POCT neutreSarstedt17.2111.050volume nominal : 50 & micro ; L, sans préparation
NanoropThermo Fisher13-400-519Mesure de la concentration en ARN, rapports 260/280
Régime obésogèneResearchdiets.comD12331riche en graisses et riche en saccharose
Thermo FisherTR13421Détection colorimétrique
&bêta ;-actineanticorps Signalisation cellulaire8457Diluer 1:1 000.
Forme de la Réactif de cholestérol total

Références

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