Utilisation d’un système de perfusion tissulaire in vitro pour détecter en temps réel les activités fonctionnelles de tubes intestinaux isolés

Summary

Nous présentons une méthode pour isoler des tubes intestinaux de rat et évaluer l’impact des médicaments sur leur tension, leur fréquence et leur amplitude in vitro. Cette méthode offre une approche précieuse pour les chercheurs qui étudient les tubes intestinaux.

Abstract

Les maladies gastro-intestinales, qui ont une incidence élevée, posent des défis considérables pour les humains. L’intestin grêle fait partie intégrante de la digestion et de l’absorption des aliments et des médicaments et joue un rôle crucial dans le traitement de ces maladies. L’expérience de mouvement du tube intestinal, une méthode in vitro courante et essentielle, est utilisée pour étudier la dynamique gastro-intestinale. Cela comprend la préparation du tube intestinal isolé, ainsi que la suspension du tube intestinal préparé dans le bain et sa connexion à un détecteur de signaux. S’ensuit l’enregistrement et l’analyse d’une série de paramètres, tels que la tension, qui peuvent être utilisés pour évaluer la fonction motrice intestinale, ainsi que des considérations pour maintenir le tube intestinal actif in vitro. Le programme standardisé de l’échantillonnage à la collecte des données améliore considérablement la répétabilité des données expérimentales et garantit l’authenticité de l’enregistrement de la tension intestinale après une intervention physiologique, pathologique et médicamenteuse. Nous présentons ici les principaux problèmes du fonctionnement expérimental et un protocole expérimental de référence précieux pour l’étude des médicaments qui régulent la motilité gastro-intestinale.

Introduction

Les maladies gastro-intestinales, une affection répandue, ont un impact grave sur la vie et la santé humaines¹. Le trouble de la motilité gastro-intestinale est une partie importante des maladies gastro-intestinales fonctionnelles, se manifestant principalement par des symptômes débilitants, une vidange gastrique retardée et des problèmes gastriques graves². Il peut perturber la coordination gastro-intestinale, entraver la vidange gastrique, avoir un impact sur l’intolérance alimentaire intestinale et même provoquer une obstruction fonctionnelle de l’intestin grêle ou du gros^intestin3. Pour les patients subissant une chirurgie gastro-intestinale, ce trouble peut conduire directement à une insuffisance intestinale. De plus, les troubles intestinaux ne sont pas seulement liés aux maladies gastro-intestinales, mais également aux facteurs pathogènes de diverses autres maladies, telles que l’hépatite et les maladies du système nerveux central. Les communautés microbiennes intestinales jouent un rôle régulateur crucial dans la physiologie intestinale, y compris la motilité, qui influence par la suite la colonisation au sein de l’écosystème microbien⁴. À mesure que l’infection par le virus de l’hépatite B évolue vers l’hépatite B chronique, la flore intestinale subit des changements à des degrés divers. La modulation de la flore intestinale a démontré des avantages dans le traitement du virus de l’hépatite B⁵. De plus, le système nerveux central peut influencer l’intestin et modifier sa composition microbienne. Les progrès récents de la technologie de séquençage de la microflore ont mis au jour des interactions bidirectionnelles entre la microflore intestinale et le fonctionnement du système nerveux central, étroitement associées à l’apparition et à la progression des maladies du système nerveux central ^6,7.

Avec le vieillissement de la société, l’incidence des troubles de la motilité gastro-intestinale augmente, liée au déclin ou à la perte de la fonction neuronale dans le système nerveux entérique et l’innervation intrinsèque de l’intestin⁸. Au fur et à mesure que notre compréhension des maladies gastro-intestinales s’élargit, de nombreuses idées et approches novatrices émergent, ce qui pourrait mener au développement de nouveaux médicaments. Cependant, bon nombre de ces idées sont encore hypothétiques ou attendent des résultats positifs des essais cliniques pour se concrétiser ^9,10. Des méthodes de recherche efficaces sont cruciales pour surmonter les maladies gastro-intestinales. Ces dernières années, des recherches approfondies se sont concentrées sur les médicaments gastro-intestinaux et la régulation de la motilité. Les médicaments gastro-intestinaux et la dynamique gastro-intestinale sont indissociables, et de nombreux autres médicaments systémiques ont des effets variables sur la dynamique gastro-intestinale. Par exemple, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) sont utilisés pour la douleur et l’inflammation et ralentissent les mouvements gastro-intestinaux, augmentant le risque d’ulcère gastroduodénal¹¹. D’autre part, certains antidépresseurs peuvent affecter la motilité gastro-intestinale¹². À l’heure actuelle, la principale expérience pharmacologique in vitro étudiant les effets des médicaments gastro-intestinaux et d’autres médicaments systémiques sur la motilité gastro-intestinale est le test de mouvement intestinal in vitro ¹³. En simulant des conditions physiologiques, ils observent l’impact direct des médicaments sur la contraction et la relaxation des muscles lisses intestinaux, en évaluant leurs effets gastro-intestinaux. Cependant, la cause précise des troubles de la motilité gastro-intestinale reste incertaine, probablement en raison d’une interaction complexe de facteurs génétiques, environnementaux, diététiques et neuroendocriniens. Par conséquent, le traitement des troubles de la motilité gastro-intestinale continue de poser des défis importants.

L’intestin grêle, étant un site crucial pour la digestion, l’absorption et le métabolisme des médicaments, joue un rôle important dans la fonction gastro-intestinale. Par conséquent, le test de mouvement isolé du tube intestinal est un outil essentiel pour étudier les maladies gastro-intestinales. Cela implique de préparer et de placer le tube intestinal isolé de l’animal dans un bain, de le connecter à un échangeur d’énergie, d’utiliser un transducteur pour convertir les mouvements mécaniques en signaux électriques d’amplification et d’enregistrer par un enregistreur physiologique. Divers paramètres tels que la fréquence, l’amplitude moyenne des vibrations, la tension et l’aire sous la courbe peuvent être mesurés pour évaluer la fonction motrice du tube intestinal. Cette méthode offre des avantages tels que la simplicité, la faisabilité économique, le contrôle facile des conditions expérimentales, des facteurs d’influence minimaux, une reproductibilité élevée et des résultats précis et fiables. De plus, il est particulièrement utile pour étudier le mécanisme d’action des médicaments. Cependant, il existe des défis notables dans le fonctionnement de l’expérience du tube intestinal isolé, par exemple, l’activité intestinale est difficile à maintenir pendant une longue période. Pour aborder ces questions et s’appuyer sur les expériences in vitro , cet article fournira une introduction détaillée aux principaux problèmes du fonctionnement expérimental et présentera un protocole expérimental de référence précieux pour l’étude des médicaments qui régulent la motilité gastro-intestinale.

Protocol

Ce protocole est dérivé de la littérature précédemment publiée 14,15,16,17. Des rats Sprague Dawley mâles (SD) (260-300 g, âgés de 8 à 10 semaines) ont été utilisés pour la présente étude. Le protocole animal a été examiné et approuvé par le comité de gestion de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (enregistrement n° 2023017). Avant l’expérience, les rats ont reçu l’ordre de jeûner pendant 24 heures. Au cours de l’expérience, les rats ont été gardés dans une chambre d’animal et avaient libre accès à de la nourriture et à de l’eau.

1. Préparation de la solution

1. Préparez une solution saline physiologique (PSS) contenant 118 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 2,5 mM de CaCl₂, 1,2 mM de KH₂PO₄, 1,2 mM de MgCl₂∙6H₂O, 25 mM de NaHCO₃, 11 mM de D-glucose et 5 mM de HEPES (voir le tableau des matériaux).
2. Saturez les solutions et les bulles avec un gaz mélangé de 95% d’O₂ et 5% de CO₂. Pendant ce temps, maintenez les valeurs de pH de la solution entre 7,38 et 7,42 avec 2 mM de NaOH.
3. Prérefroidissez 1/3 du PSS à 4 °C et préchauffez le reste à 37 °C pour les expériences ultérieures.
   REMARQUE : le PSS a été préparé à l’origine à température ambiante aux étapes 1.1-1.2

2. Dissection du canal intestinal chez le rat

1. Rassemblez des boîtes de Pétri remplies de PSS à 4 °C, d’une pince à épiler chirurgicale et de ciseaux. Administrer de l’isoflurane à 2 % pour anesthésier le rat par inhalation pendant environ 5 min. Vérifiez que le rat est profondément anesthésié en effectuant un test de pincement des orteils. Si nécessaire, administrez des anesthésiques supplémentaires. Ensuite, exposez le canal intestinal en ouvrant la cavité abdominale sur une table d’opération.
2. Placez rapidement les tubes gastriques et intestinaux dans une boîte de Pétri remplie de PSS à 4 °C (pH 7,40) avec 95 % d’O₂ et 5 % de CO₂ saturés. Localisez le duodénum, qui est le début de l’intestin grêle, dans le pylore de l’estomac. À l’aide d’une pince à épiler, soulevez délicatement le tissu adjacent et coupez-le soigneusement pour l’éloigner du bord de l’intestin avec des ciseaux. Par la suite, divisez l’intestin en segments de 1 à 2 cm ; l’ensemble de ce processus est illustré à la figure 1.

3. Suspension et fixation du canal intestinal (Figure 2)

1. Allumez le système de perfusion tissulaire in vitro et réglez la température du bain dans l’instrument à 37 °C. Placez le PSS (37 °C) dans le bain.
2. Préparez une suture chirurgicale de 15 cm (voir le tableau des matériaux) et trempez-la dans un PSS à 4 °C saturé de 95 % d’O₂ + 5 % de CO₂. À l’aide de la suture, fixez une extrémité du canal intestinal et utilisez un crochet à aiguille en acier pour fixer l’autre extrémité.
3. Installez le tube intestinal. Montez le segment avec le crochet à aiguille en acier au fond de la baignoire et fixez l’autre extrémité de la ligne chirurgicale au transducteur. Allumez l’interrupteur à gaz pour permettre aux bulles de sortir dans le bain.
4. Ouvrez le logiciel d’acquisition de données (voir le tableau des matériaux) et cliquez sur Démarrer pour vous assurer que le signal de trajectoire correspondant est enregistré.

4. Normalisation

1. Tournez l’axe en spirale du bain dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour détendre les tubes intestinaux à leur état naturel. Cliquez sur Setup-Zero All Inputs pour vous assurer que la tension initiale du tube intestinal est réglée sur 0 g dans le logiciel.
2. Tournez l’axe en spirale du bain dans le sens inverse des aiguilles d’une montre pour ramener la valeur de tension à 1 g et la stabiliser dans le pH = 7,40, 95 % O₂ + 5 % CO₂ saturé 37 °C PSS pendant 30 min.
   REMARQUE : La normalisation du tube intestinal consiste à ajuster sa précharge à un état optimal. Pour les échantillons en cavité, une précharge optimale était nécessaire pour maintenir une activité in vitro exceptionnelle. La précharge optimale de la sonde intestinale du rat était de 1 g¹⁸.

5. Détection de la réactivité

1. Observez les ondes de contraction spontanées rythmiques dans le logiciel et passez à l’expérience suivante car cela indique une réponse suffisante.

6. Observation expérimentale

1. Ajoutez le médicament testé (comme l’acétylcholine, etc.) dans le bain pour étudier l’effet du médicament sur la fonction du tube intestinal.
   REMARQUE : L’effet du médicament a été évalué en comparant les changements avant et après l’administration de la courbe de constriction intestinale. Lorsque le médicament est ajouté, il convient d’augmenter la bulle pour mélanger le médicament, puis d’ajuster la bulle à la normale après le mélange.

7. Analyse des données

REMARQUE : Le système de perfusion tissulaire in vitro comporte quatre canaux qui permettent d’effectuer simultanément des tests sur les effets de quatre médicaments identiques ou différents sur quatre tubes intestinaux. Étant donné que les paramètres expérimentaux et les méthodes d’analyse sont les mêmes pour toutes les voies, une voie est sélectionnée comme exemple pour l’analyse des données.

1. Arrêtez le logiciel d’acquisition de données et effectuez une analyse des données sur ce logiciel d’acquisition de données. Éditez la carte de données et sélectionnez les paramètres d’analyse comme suit : Cliquez sur Window-Data Pad et choisissez la tension moyenne du canal.
2. Sélectionnez la courbe de contraction avant l’administration et cliquez sur Ajouter au Data pad ; sélectionnez la courbe de contraction après l’administration et cliquez sur Ajouter au bloc de données. La valeur moyenne de tension avant et après l’administration apparaîtra à tour de rôle sur le bloc de données.
3. Cliquez sur Window-Data Pad pour copier les données vers d’autres logiciels d’analyse statistique (voir la Table des matériaux) pour l’analyse statistique.
4. Analysez d’autres paramètres, tels que l’amplitude moyenne, la fréquence moyenne et l’intégrale (aire sous la courbe), remplacez simplement la tension moyenne par le paramètre respectif, et le fonctionnement est le même que les étapes 6.1 à 6.3.
5. Enregistrer la courbe de contraction : Sélectionnez la courbe de contraction, cliquez sur Modifier-Copier les données du Labchart pour copier les données dans le logiciel de dessin (voir la Table des matériaux) pour dessiner la courbe de contraction.

8. Traitement post-chirurgical

1. Après l’opération, euthanasier les animaux en suivant les protocoles approuvés par l’établissement.
   REMARQUE : Pour la présente étude, les animaux ont été euthanasiés en inhalant un excès d’isoflurane.

Results

La première partie de l’étude se concentre sur le processus de séparation des tubes intestinaux isolés du corps et de leur conversion en tubes de 2 cm in vitro. Ce processus est illustré en détail à la figure 1. La deuxième partie implique la suspension et la standardisation de l’anneau isolé du tube intestinal. Le succès de ce processus est démontré par la figure 2, qui montre la contraction rythmique automatique d’un tube normal. Enfin, l’étude examine les effets d’agents contractiles représentatifs et de relaxants sur l’anneau isolé du tube intestinal. Il a été constaté que l’acétylcholine (0,3 μmol/L) et le chlorure de baryum (1,2 mmol/L) augmentaient la tension dans ces tubes, tandis que l’atropine (300 μmol/L), l’épinéphrine (1 μmol/L) et la nifédipine (10 μmol/L) inhibaient leur tension, comme l’illustre la figure 3.

Cette méthode introduit principalement la détermination de la fonction motrice du tube intestinal isolé. Les mouvements intestinaux sont affectés par un certain nombre de facteurs, et la plupart des effets sont exercés par les récepteurs de l’intestin. Dans le tractus gastro-intestinal, il existe divers récepteurs, notamment les récepteurs cholinergiques M, les récepteurs α et β adrénergiques, les récepteurs 5-HT, les récepteurs de l’histamine et les récepteurs des hormones gastro-intestinales¹⁹. Le spasme dans l’intestin isolé peut être causé par l’action de l’acétylcholine sur les récepteurs M. Cet effet peut être bloqué par l’atropine, qui agit comme un agent bloquant pour les récepteurs M (Figure 3A). Cependant, le spasme dans le muscle lisse du segment intestinal, qui est causé par l’entrée d’ions baryum dans le chlorure de baryum et leur liaison avec la calmoduline, ne peut pas être bloqué par l’atropine (Figure 3B). L’épinéphrine agit comme un agoniste des récepteurs α et β (Figure 3C). Il excite le récepteur α et β_{récepteur 2} de l’intestin grêle, ce qui entraîne la relaxation du muscle lisse et une contraction affaiblie de l’intestin grêle. En conséquence, le péristaltisme est ralenti et le taux d’absorption est réduit. En revanche, la nifédipine empêche le flux interne de Ca²⁺ et favorise la relaxation intestinale (Figure 3D). Cela aide à soulager les spasmes intestinaux, à diminuer la pression intestinale et à faciliter l’absorption de l’eau dans l’intestin.

Figure 1 : L’isolement des tubes intestinaux. (A) les tubes intestinaux chez le rat ; (B) Les tubes intestinaux ont été retirés du corps et placés dans une boîte de Pétri contenant une solution saline physiologique à 4 °C ; (C) tube intestinal après l’ablation des tissus environnants ; (D) Tube intestinal de 2 cm de long utilisé dans l’expérience. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Le processus de suspension et de standardisation d’anneaux de sonde intestinale isolés. (A) Système de perfusion tissulaire in vitro (voir le tableau des matériaux) ; (B) en fixant les deux extrémités du tube intestinal à l’aide d’un crochet en fer et d’un cordillon chirurgical dans une boîte de Pétri contenant une solution saline physiologique à 4 °C ; (C) fixation du tube intestinal dans l’un des bains contenant une solution saline physiologique à 37 °C ; (D) donner la précharge et enregistrer la forme d’onde normale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Effets des médicaments sur les tubes intestinaux isolés. Effets de (A) l’acétylcholine (0,3 μmol/L) et de l’atropine (300 μmol/L), (B) du chlorure de baryum (1,2 μmol/L), (C) de l’épinéphrine (1 μmol/L) et (D) de la nifédipine (10 μmol/L) sur des tubes intestinaux isolés. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La motilité gastro-intestinale est accomplie par une série de contractions et de relaxations des muscles lisses coordonnées avec précision. Ce processus implique la contraction rythmique d’un groupe de groupes musculaires, la contraction coordonnée de plusieurs groupes et une contraction propulsive spéciale^20,21. L’apparition de troubles de la motilité gastro-intestinale peut être associée à des dysfonctionnements à différents niveaux, tels que le système nerveux central, le système nerveux autonome, le système nerveux entérique et le muscle lisse gastro-intestinal. Ces structures tissulaires fonctionnent ensemble grâce à la libération de divers neurotransmetteurs et facteurs humoraux, qui se lient aux récepteurs correspondants pour remplir différentes fonctions physiologiques²². Par conséquent, l’étude du mécanisme local d’action des médicaments est essentielle, et la réalisation d’expériences in vitro sur l’intestin grêle peut fournir des informations plus précises en excluant l’interférence des substances étrangères et la régulation du système nerveux central.

Des échantillons isolés de tube intestinal d’iléon de cobaye, de jéjunum de lapin et de duodénum sont couramment utilisés chez les animaux de laboratoire. De plus, l’iléon, le duodénum et le jéjunum des rats et des chats peuvent également être utilisés pour des expériences in vitro . Cette méthode convient aux tissus isolés. Le muscle lisse intestinal a les caractéristiques d’une contraction rythmique automatique et est affecté par le plexus nerveux de la paroi intestinale. Les tubes intestinaux isolés de nombreux animaux peuvent maintenir leur fonction motrice spontanée dans un environnement de survie approprié. L’expérience in vitro en tube intestinal présente les avantages d’un fonctionnement simple, d’un contrôle facile des conditions expérimentales, de peu de facteurs d’influence, d’une bonne reproductibilité, de résultats précis et fiables, et elle est plus propice à la discussion du mécanisme d’action du médicament. De plus, cette méthode est considérée comme économique et réalisable.

L’expérience du tube intestinal in vitro a également ses limites, telles que l’utilisation de préparations de médecine chinoise brutes non purifiées contenant des impuretés, des ions inorganiques, des saponines et des tanins, ce qui peut affecter la fiabilité de l’expérience. Par conséquent, il est nécessaire d’évaluer pleinement l’influence des impuretés et des facteurs physicochimiques sur les résultats expérimentaux, y compris le pH du liquide et diverses particules électrolytiques et d’impuretés. En outre, il est nécessaire d’améliorer la stabilité de l’instrument expérimental in vitro et la technique de conservation du tube intestinal in vitro. Lors de la conception d’expériences in vitro, il est essentiel de déterminer si les médicaments ou les préparations utilisés répondent aux exigences de ces expériences (par exemple, les niveaux d’impuretés).

Dans cette méthode, plusieurs précautions doivent être observées. Pour commencer, le tube intestinal doit être retiré de la cavité abdominale du rat et trempé dans un PSS froid avant l’expérience. De plus, il est important de couper tout le tube en plusieurs morceaux et de les conserver au réfrigérateur, en minimisant toute stimulation des intestins. Pendant le processus de dosage, il est crucial de s’assurer que le tube de dosage n’entre pas en contact avec la ligne sur laquelle le tube intestinal est suspendu. De plus, la quantité de médicament ajoutée au bain doit être précise et le médicament ne doit pas être ajouté à la paroi du bain ou directement au tube intestinal pour éviter d’influencer les résultats. Lors du rinçage du tube intestinal, une approche douce doit être utilisée et le rinçage à haute pression doit être évité pour éviter la contracture des tissus. Il est recommandé de manipuler le tube intestinal à l’aide d’une pince à épiler et d’éviter de l’exposer à l’air pendant de longues périodes afin d’éviter toute perte d’activité.

Cet article présente une démonstration de la méthodologie expérimentale pour les expériences isolées sur les tubes intestinaux, en utilisant les effets de divers médicaments traditionnels agissant sur les récepteurs intestinaux pour illustrer leur impact sur le mouvement des tubes intestinaux, ce qui fournit une approche efficace pour étudier le mécanisme d’action des médicaments qui régulent la motilité gastro-intestinale sur le tractus gastro-intestinal.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acétylcholine  ;	Sigma, États-Unis	A6625
atropine	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	IA06501
Chlorure de baryum	Macklin Biochemical Co., Ltd., Shanghai, Chine	B861682
CaCl2	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	A501330
D-glucose	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	A610219
logiciel de dessin	GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis	&mdash ;
Epinephrine	Sigma, États-Unis	E4642
HEPES	Xiya Reagent Co., Ltd., Shandong, Chine	S3872
Système de perfusion tissulaire in vitro	PowerLab, ADInstruments, Australie	ML0146
KCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	A100395
KH2PO4	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	A100781
LabChart Professional version 8.3  ;	ADInstruments, Australie	&mdash ;
MgCl2· ; 6H2O	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	A100288
NaCl	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	A100241
NaHCO3	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chine	A100865
nifédipine	Macklin Biochemical Co.,Ltd.,Shanghai, Chine	N5087
analyse statistique logiciel	GraphPad Software, San Diego, Californie, États-Unis	&mdash ;
Sutures chirurgicales	Johnson, États-Unis	&mdash ;