Quantification rapide des formes oxydées et réduites de glutathion à l’aide de l’ortho-phtalaldéhyde dans des cellules de mammifères en culture in vitro

Résumé

La quantification des formes oxydées et réduites du glutathion (GSSG et GSH, respectivement) a été réalisée grâce à l’utilisation d’ortho-phtalaldéhyde (OPA). L’OPA devient très fluorescent une fois conjugué au GSH, mais il est incapable de conjuguer le GSSG jusqu’à ce qu’il soit réduit. Ici, nous décrivons un test multiparamétrique pour quantifier les deux en utilisant la quantification des protéines pour la normalisation.

Résumé

Le glutathion a longtemps été considéré comme un biomarqueur clé pour déterminer la réponse antioxydante de la cellule. Par conséquent, il s’agit d’un marqueur primaire pour l’étude des espèces réactives de l’oxygène. La méthode utilise l’ortho-phtalaldéhyde (OPA) pour quantifier la concentration cellulaire du ou des glutathion(s). Les conjugués de l’OPA avec du glutathion réduit (GSH) par liaison au sulfhydryle forment ensuite un isoindole, ce qui donne un conjugué hautement fluorescent. Pour obtenir un résultat précis à la fois pour le glutathion oxydé (GSSG) et le GSH, une combinaison d’agents masquants et d’agents réducteurs, qui ont été mis en œuvre dans ce protocole, est nécessaire. Les traitements peuvent également avoir un impact sur la viabilité cellulaire. Par conséquent, la normalisation par dosage des protéines est présentée dans ce test multiparamétrique. Le dosage démontre une plage de détection pseudo-linéaire de 0,234 à 30 μM (R² = 0,9932±0,007 (N = 12)) spécifique au GSH. L’essai proposé permet également de déterminer la présence de glutathion oxydé à l’aide de l’agent masquant N-éthylmaléimide pour lier le glutathion réduit, et l’introduction de l’agent réducteur tris(2-carboxyéthyl) phosphine pour cliver la liaison disulfure dans le GSSG afin de produire deux molécules de GSH. Le test est utilisé en combinaison avec un test validé d’acide bicinchoninique pour la quantification des protéines et un test d’adénylate kinase pour l’évaluation de la cytotoxicité.

Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont l’un des principaux inducteurs du stress oxydatif. Le stress oxydatif a été bien établi dans la génération de mutations de l’ADN, le vieillissement / la mort cellulaire, divers cancers, le diabète, les maladies neurologiques (telles que Parkinson et Alzheimer) et plusieurs autres conditions débilitantes de la vie 1,2,3,4,5. Les antioxydants thioliques non enzymatiques, capables de réduire les oxydants ou les radicaux en agissant comme donneurs de protons, constituent une défense clé contre les ROS ^6,7. Le glutathion (GSH) et la cystéine sont les deux thiols les plus répandus chez les mammifères⁸, tandis qu’il existe divers autres thiols de faible poids moléculaire (tels que l’ergothionéine), le GSH et la cystéine sont les antioxydants non enzymatiques les plus couramment mesurés dans la littérature ^9,10,11 et sont les plus pertinents pour lutter contre les ROS ^8,12,13,14.

Lorsque le GSH est utilisé comme antioxydant, deux molécules de GSH sont liées de manière covalente par une liaison disulfure pour former du disulfure de glutathion (GSSG). L’épuisement du GSH est souvent utilisé comme indicateur de stress oxydatif ^15,16. Cette évaluation peut également être combinée à la détection du GSSG, bien que les augmentations du GSSG dans les cellules soient souvent limitées par des processus d’exportation actifs, car le GSSG peut être relativement réactif dans les cellules, conduisant à la formation de liaisons disulfure avec d’autres thiols protéiques¹⁶.

Les méthodes traditionnelles de mesure du GSH et du GSSG ne sont pas des processus simples et nécessitent de nombreuses étapes, y compris l’extraction cellulaire à l’aide de réactifs lytiques^17,18. Le protocole décrit ici simplifie ces méthodes et permet la mesure précise des thiols non enzymatiques et la normalisation à l’aide de la teneur en protéines cellulaires ou de la libération d’adénylate kinase. De plus, il est possible de mesurer la viabilité cellulaire avant l’extraction du GSH/GSSG. Plusieurs méthodes ont déjà tenté de cibler et de quantifier efficacement les thiols non enzymatiques réduits et oxydés ; méthodes comprenant l’utilisation de la HPLC ^19,20,21, le dosage sur plaque (biochimique)^22,23,24,25, et qui utilisent des réactifs courants pour la conjugaison des thiols, tels que le 5,5-dithio-bis-(acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB/réactif d’Ellman)¹⁹, le monochlorobimane (mBCI)26,27,28. Plusieurs entreprises ont également préparé des kits exclusifs pour la détection du glutathion ; Cependant, ils ne publient pas les incompatibilités de réactifs, ce qui pose des problèmes dépendants des traitements utilisés²⁹.

Ce protocole décrit un test multiparamétrique qui détecte les thiols réduits (tels que le GSH) via la conjugaison ortho-phtalaldéhyde (OPA) pour produire un signal fluorescent détectable à 340/450 Ex/Em, respectivement. Ce dosage facilite la détection simultanée du GSH et du GSSG (dans la plaque), grâce à l’utilisation d’agents masquants (N-éthylmaléimide) et d’agents réducteurs du GSSG (tris(2-carboxyéthyl)phosphine). Ce protocole multi-biomarqueurs offre également l’opportunité, au cours de l’étape de lyse cellulaire, de quantifier les protéines via un dosage de l’acide bicinchoninique pour la normalisation des échantillons à la fin de la mesure finale ou via un dosage de l’adénylate kinase à partir du milieu cellulaire. Ce test peut être effectué à l’aide de plusieurs réactifs facilement disponibles dans la plupart des laboratoires et ne nécessite que quelques produits chimiques supplémentaires peu courants. Le processus est simple, accessible et peut être réalisé sans étapes laborieuses en moins de 2 h.

Dans ce protocole, divers nanomatériaux ont été choisis qui induisaient auparavant des ROS ou qui étaient soupçonnés d’induire un stress oxydatif^30,31. Une gamme de concentration a été explorée pour voir les effets de l’exposition à ces nanomatériaux sur diverses lignées cellulaires et l’efficacité du test pour quantifier les thiols antioxydants.

Protocole

REMARQUE : Le protocole suivant a été conçu pour pouvoir être utilisé conjointement avec un dosage de la protéine de l’acide bicinchoninique (BCA) et un dosage de l’adénylate kinase (AK) pour normaliser les échantillons aux traitements. Assurez-vous que l’opérateur porte une tenue appropriée et l’équipement de sécurité nécessaire, comme une blouse de laboratoire Howie, des gants en nitrile et des lunettes de sécurité de classe I, tout au long de la préparation et de l’utilisation des matériaux. Le protocole est divisé en plusieurs étapes.

1. Préparation des stocks et des solutions de travail

1. Préparer des solutions mères d’étalon de 100 mM de GSH dans 1 mM de HCl (préparées à partir de 37 % de HCl dans de l’eau doublement distillée (ddH₂O)).
   REMARQUE : En cas de dilution à partir d’un acide hautement concentré, tel que 37% HCl, assurez-vous du processus correct d’ajout d’acide à l’eau dans une hotte de classe I.
2. Préparer un stock de 22,35 mM d’OPA en éthanol absolu. Effectuez cette étape dans une hotte de classe I. Préparez 25 mM de N-éthylmaléimide (NEM) dans du ddH₂O. Effectuez cette étape dans une hotte de classe I.
   REMARQUE : Ces trois solutions peuvent être conservées à -20 °C jusqu’à 3 mois.
3. Préparer 0,01 M de tris(2-carboxyéthyl) phosphine (PTCE) jusqu’à un volume total de 500 μL, nécessaire pour 100 puits. Préparer 100 μL d’étalon de 1 mM de GSH, dilué à partir d’un échantillon de 100 mM à l’aide de jdH_2O.
4. Utiliser soit un tampon de lyse par immunoprécipitation (IP), soit la formulation suivante : 394 mg de Tris-HCl (concentration finale de 25 mM), 877 mg de NaCl (concentration finale de 150 mM), 29 mg d’EDTA (concentration finale de 1 mM), soit 1 mL de NP-40 à 100 % ou d’IGEPAL CA-630 (concentration finale de 1 % V/V), 5 mL de glycérol (concentration finale de 5 % V/V), 84 mL de ddH₂O. Mélanger les composants en agitant doucement et ajuster le pH à 7,4. Transvaser dans une fiole jaugée de 100 mL et ajouter le volume restant de ddH₂O pour atteindre un volume final de 100 mL. Filtrer stérilement à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à une température de 2 à 8 °C jusqu’à 6 mois.
   REMARQUE : Les solutions de lyse agissent comme un contaminant/interférent dans cet essai ; Par conséquent, les formulations ci-dessus sont spécifiées.
5. Préparez 1 L de solution saline tamponnée au phosphate 0,1 M complétée par de l’acide éthylènediamine tétraacétique (PBS-EDTA) à 3 valeurs de pH différentes, à savoir 7,2, 8,5 et 9,0. Utiliser un tampon PBS commercial de 0,1 M complété par 1 mM d’EDTA (292,24 mg/L) ou la formulation 10x (1 L) suivante : 80 g de NaCl, 2,0 g de KCl, 14,4 g de Na₂HPO₄, 2,4 g de KH₂PO₄, 800 mL de ddH₂O. Ajouter et mélanger ; Complétez jusqu’à 1 L. Autoclavez la solution pour la stérilité et conservez-la pendant 12 mois à température ambiante. À partir de la solution mère 10x, préparez une solution de travail de PBS et complétez-la avec de l’EDTA (concentration comme indiqué précédemment).
   REMARQUE : Le pH est d’une importance cruciale ; assurez-vous que le pH est précis avant de commencer le protocole.
6. Effectuer une dilution en série 1:2 de 1 mM de GSH à l’aide de ddH₂O (1 mM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62,5 μM, 31,25 μM, 15,625 μM et 7,8125 μM). Ajouter 10 μL de chaque concentration dans les puits étalons (effectué en double). Les échantillons seront dilués dans un tampon de lyse ; par conséquent, les concentrations seront de 1/5^e de leur concentration initiale par la suite (200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125, 1,5625 μM).
   REMARQUE : Les concentrations finales pour l’étalonnage seront de 30 μm, 15 μm, 7,5 μm, 3,75 μm, 1,875 μm, 937,5 nm, 468,8 nm et 234,4 nm.

2. Préparation du dosage

REMARQUE : Ce protocole utilise des lignées cellulaires humaines HepG2, A549 et J774, qui ont été achetées commercialement auprès de l’ATCC. Ces lignées cellulaires ont été utilisées conformément aux lignes directrices approuvées décrites dans les lois et règlements sur la culture animale et tissulaire de l’Université.

1. 24 h avant le début de l’essai, les cellules de semence aux concentrations indiquées au tableau 1 ; Cependant, en fonction de la lignée cellulaire/du type de cellule et du traitement utilisé, ajustez la densité au besoin. Cultivez des cellules dans un milieu de croissance complet (milieu essentiel modifié Eagles (EMEM) avec 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (HIFS), 1 % de Penstrep (10 000 U/mL de pénicilline/10 mg/mL de streptomycine) et 1 % d’acides aminés non essentiels.
2. Cellules d’ensemencement à l’aide de méthodes d’ensemencement cellulaire conventionnelles³². Cellules germées dans des plaques entièrement noires si elles n’utilisent pas la microscopie post-essai. Évaluer la confluence et l’état général des cellules dans le ballon T75 avant de les utiliser par microscopie.
3. Dans une enceinte de sécurité biologique propre et stérile de classe II et en suivant une technique d’asepsie stricte, jeter les milieux cellulaires, laver délicatement les cellules avec ~15 mL de PBS stérile à température ambiante (RT) et jeter.
4. Dans la fiole cellulaire, ajouter 5 mL de trypsine 1x stérile, secouer doucement pour assurer la couverture de la monocouche cellulaire et placer dans un incubateur à 37 °C pendant 5 minutes pour faciliter le détachement des cellules.
5. Arrêter la trypsinisation par l’ajout d’un milieu de croissance contenant du sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (10 %), environ 10 mL.
6. Transférer les cellules dans un tube à centrifuger de 50 mL et granuler à 200 x g pendant 5 min. Jetez le support et remplacez-le par 5 mL du même support. Remettre les cellules en suspension dans le tube jusqu’à ce qu’elles soient homogènes et qu’il n’y ait plus d’agglutination.
7. Retirer 20 μL de suspension cellulaire et les placer dans un hémocytomètre pour le comptage. Une fois que le nombre de cellules nécessaires a été calculé, effectuez une dilution pour obtenir une solution avec la bonne densité cellulaire.
8. Supports de pipette contenant des cellules en plaques de 96 puits (capacité de 350 μL), avec un volume maximal de 200 μL par puits. Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 24 h pour qu’elles adhèrent à la surface de la plaque.
9. Pour évaluer à la fois le glutathion total et le GSSG, traitez des échantillons pour les deux affections. Ensemencer et traiter 6 puits pour fournir 2 ensembles de GSH et de GSSG avec 3 répétitions techniques (la figure 1 montre la disposition).
10. S’assurer que tous les réactifs sont préparés de manière appropriée avant le début de l’essai ; s’assurer que tous les composants et réactifs du tampon sont à la RT avant de commencer la construction des tampons ou l’utilisation dans l’essai, à l’exception du PBS à pH 7,4 (sans EDTA), qui doit être conservé sur de la glace ou réfrigéré jusqu’à l’utilisation.
    REMARQUE : Il est d’une importance cruciale que la formation de bulles soit limitée au minimum pour permettre aux réactions souhaitées de se produire dans le test et permettre une quantification précise via le lecteur de plaques.

Lignée cellulaire	Densité de semis (plaque de 96 puits)
HepG2	10 000 cellules / puits
A549	5 000 cellules / puits
J774	10 000 cellules / puits

Tableau 1 : Densités d’ensemencement suggérées pour les lignées cellulaires choisies. Des densités d’ensemencement différentes ont été démontrées pour trois lignées cellulaires différentes utilisées dans les données représentées, à savoir A549, J774 et HepG2.

Figure 1 : Schéma proposé pour l’ensemencement de 96 plaques de puits pour la détermination simultanée du glutathion total et du disulfure de glutathion. Des puits pour l’étalonnage et les contrôles sont également présentés. Les puits qui ne sont pas utilisés sont représentés par une croix. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Traitement des nanomatériaux

1. Pesez les nanomatériaux (en particulier le ZnO, le TiO₂, le CuO et l’Ag) dans une balance capable de μg. Effectuer un calcul pour atteindre une concentration initiale de 1 mg/mL par nanomatériau.
2. Transférer des solutions de nanomatériaux dans un sonicateur et du sonicate pendant 16 min à l’aide d’un bain de sonication (38 W) pour produire une solution homogène. Effectuer une série de dilutions pour chaque nanomatériau à 125, 62,5, 31,25, 15,625 μg/mL.
3. Retirez les cellules de l’incubateur et lavez-les légèrement avec RT PBS. Après s’être assuré que tout le PBS a été éliminé, ajouter 100 μL de traitements dans la plaque, avec des témoins (milieux de culture sans HIFS). Après l’application du traitement sur les cellules, incuber avec les nanomatériaux dans un incubateur à 37^{°C (5% de CO}₂) pendant 4 h ; ensuite, utilisez le protocole ci-dessous pour quantifier le GSH : GSSG, concentration en protéines et libération d’AK.

4. Protocole d’analyse

1. Après l’exposition au traitement (Figure 2A), évaluer la viabilité par l’activité de l’adénylate kinase (AK) (facultatif). Utilisez un kit commercial pour ce test en suivant les instructions du fabricant.
2. Tourner les plaques dans une centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min pour granuler légèrement le traitement et les débris cellulaires (figure 2B).
3. Retirer doucement 20 μL de surnageant de milieu de chaque échantillon et puits témoin (comme indiqué ci-dessus) et pipeter dans une plaque blanche adjacente à 96 puits dans le même format de disposition (figure 2C).
4. Ajoutez 100 μL de solution de travail du kit AK dans chaque puits, protégez la plaque de la lumière et laissez agir pendant 10 min à température ambiante. Enregistrez la luminescence à l’aide d’un lecteur de plaques à 1000 comptes/s.
5. Pour les étalons de GSH, ajouter 40 μL de tampon de glutathion total dans chaque puits (figure 2D ; facultatif, requis pour la quantification).
6. Aspirer le reste du milieu de la plaque et laver 3 fois avec du PBS 0,1 M glacé, pH 7,2, en jetant chaque lavage (figure 2E) à l’exception des étalons. Laissez le lavage final dans la plaque jusqu’à ce que l’étalonnage GSH ait été chargé dans la plaque.
7. Ajouter 10 μL de chaque concentration de glutathion et blanc (ddH₂O) dans les puits en trois exemplaires.
8. Retirer le lavage final du PBS et ajouter les mélanges dans chaque puits conformément au tableau 2 pour la quantification cible souhaitée (figure 2E). Calculez les volumes requis avant de commencer cette étape en raison d’une perte d’activité urgente avec des tampons complets. Assurez-vous que ces mélanges de réactifs sont préparés avant de commencer le processus de test, mais ne les laissez pas reposer plus de 30 minutes avant de les utiliser.
9. Placez-le sur un agitateur de plaque orbitale et laissez la plaque trembler à 300 tr/min pendant 2 min (Figure 2F).
10. Retirer de l’agitateur et ajouter 5 μL de solution de PTCE 0,01 M dans chaque puits, à l’exclusion du puits de contrôle NEM. Remettez la plaque dans l’agitateur et laissez incuber pendant 10 min (Figure 2F).
11. Transférer la plaque dans la centrifugeuse et tourner à 200 x g pendant 5 min. Transférer 25 μL de chaque puits d’échantillon dans une autre plaque de 96 puits (transparente) ; Celui-ci sera utilisé pour la concentration en protéines (voir étape 4.15 ; Figure 2G). Ne transférez pas d’étalons ou de contrôles d’essai.
12. S’assurer que le volume final de chaque puits est de 30 μL ; retirer le volume des contrôles et des normes pour répondre à cette exigence (figure 2H).
13. Ajouter 170 μL de solution d’OPA fonctionnelle dans chaque puits, protéger la plaque de la lumière et placer sur un agitateur pendant 15 minutes (figure 2I).
14. Lire la fluorescence à l’aide d’un lecteur de plaques à Ex340/Em450 (Figure 2J). S’assurer qu’il n’y a pas de bulles pendant l’étape de mesure ; Ils auront un impact néfaste à la fois sur la réaction et sur la quantification via le lecteur de plaques.
15. Pour quantifier la teneur en protéines des cellules lysées, utilisez un kit de dosage BCA commercial. Transférez les échantillons prélevés à l’étape 4.12 sur une nouvelle plaque de 96 puits (transparente) à 25 μL par puits.
16. Utiliser un étalon d’albumine sérique bovine (BSA) dilué dans un tampon de lyse IP et l’ajouter à la plaque en trois exemplaires à raison de 25 μL par puits. Les concentrations exactes sont définies dans le protocole du kit BCA.
17. Préparez une solution de travail composée d’un rapport de 50:1 des réactifs A et B de la trousse BCA et ajoutez 200 μL à chaque puits contenant l’échantillon, l’étalon et le témoin. Protégez les plaques de la lumière et incubez à 37 ^{°C pendant 30 min} (Figure 2K).
18. Retirer les échantillons de l’incubateur, laisser équilibrer à température ambiante pendant 5 min, puis lire l’absorbance via un lecteur de plaque à 562 nm (Figure 2L).

Concentration totale de glutathion mélange de réactifs de lyse
Composant	Volume
Tampon de lyse	50μL
Volume total / puits	50μL
Mélange de réactifs de lyse de concentration de glutathion oxydé
Composant	Volume
Tampon de lyse	49,5 μL
NEM (25 mM)	0,5 μL
Volume total / puits	50μL
UTILISEZ LES DEUX SOLUTIONS DANS LES 30 MINUTES SUIVANT LA COMPOSITION DU MÉLANGE
Composant de la solution de détection OPA	Volume
OPA 3mg/mL	5μL
PBS (pH 9,0)	165μL
Volume total / puits	170μL

Tableau 2 : Volumes de réactifs nécessaires à l’exécution du protocole. Volumes requis par puits pour la détermination du glutathion total, du disulfure de glutathion et du réactif de travail. Assurez-vous que les volumes requis sont calculés et qu’un excédent est inclus pour tenir compte de la perte de volume par transfert.

Figure 2 : Représentation schématique du protocole. (A) Ensemencement initial, incubation et traitement des cellules. (B) Centrifugation pour séparer les fluides des solides en suspension. (C) Transfert de milieu pour le dosage de l’adénylate kinase. (D) Ajout des concentrations de glutathion pour la plage d’étalonnage. (E) Étapes de lavage et ajout de réactifs de lyse. (F) Ajout de tampon et ajout de tris(2-carboxyéthyl) phosphine avec étape d’agitation. (G) Centrifugation de cellules lysées pour l’élimination des milieux pour l’analyse des protéines. (H) Retrait du support pour égaliser le volume sur la plaque. (I) Addition d’une solution de travail d’ortho-phtalaldéhyde avec incubation par agitation. (J) Mesure de la fluorescence de l’ortho-phtalaldéhyde par lecteur de plaques. (K) Étapes d’incubation pour le dosage de l’acide bicinchoninique pour la détermination des protéines. (L) Mesure de la concentration protéique, permettant la normalisation des valeurs de glutathion : disulfure de glutathion. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Selon ce protocole, les lignées cellulaires A549 et J774 ont été ensemencées à des densités de 5 000 cellules/puits et 10 000 cellules/puits, respectivement, et cultivées à 37 °C dans 5 % de CO₂ pendant 48 h. L’analyse de l’AK après traitement des nanomatériaux est présentée dans le tableau supplémentaire 1, et la concentration en protéines est indiquée dans le tableau supplémentaire 2.

Graphique d’étalonnage
La figure 3 montre trois étalonnages utilisant la plage de concentration indiquée (0,234 à 30 μM de concentration finale) à partir de trois plaques distinctes de trois types de cellules différents (bien que cela ne devrait pas avoir d’impact sur l’étalonnage) sur trois jours différents, non consécutifs. Bien que 3 échantillons soient présentés, un N de 12 a été observé et a démontré des régressions linéaires similaires avec une valeur moyenne de R² de 0,9932 ± 0,007.

Figure 3 : Graphiques d’étalonnage du glutathion pour le dosage. Trois graphiques d’étalonnage provenant de plages d’étalonnage distinctes du glutathion dans la plaque, chacun effectué à une semaine d’intervalle ; barres d’erreur ± SD (n = 3, N = 12), n = répétitions techniques, N = répétitions biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats de l’échantillon
Les cellules HepG2, A549 et J774 ont été utilisées dans l’évaluation de divers nanomatériaux soupçonnés d’induire des modifications des mécanismes cellulaires via le stress oxydatif. Le protocole de détection et de quantification décrit a été utilisé.

Les données reçues des 3 mesures (AK, BCA et GSH/GSSG) ont été traitées comme suit. Les tests AK et BCA ont été mis en œuvre pour la normalisation ; le test AK, à l’aide du kit recommandé, fournira les données les plus rapides et les plus simples sur la quantité d’AK libérée dans le milieu cellulaire. Une augmentation des valeurs AK est attendue pour augmenter la mort cellulaire. Par conséquent, un contrôle -ve (Vivant) et +ve (Mort) est requis. Cela permettra une normalisation basée sur le pourcentage.

Le dosage des BCA est un processus plus long, mais il permet d’obtenir des résultats quantifiables par quantification des protéines (mg/mL). Cela ne nécessite pas de contrôle -ve ou +ve comme dans l’AK, mais nécessitera tout de même un contrôle -ve général (cellules non traitées) pour permettre la normalisation des valeurs à réaliser.

Dans cette section de résultats représentatifs, il a été constaté que le traitement (nanomatériaux) avait le potentiel de causer des interférences avec le test AK. Par conséquent, toute la normalisation a été effectuée à l’aide des données de l’ACB. Par conséquent, l’information est présentée sous forme de concentration des espèces détectées (GSH ou GSH+GSSG (cependant, une soustraction de la concentration de GSH de la concentration totale de GSH+GSSG est effectuée pour obtenir la concentration de GSSG) par mg/mL de protéine (au moyen d’un test BCA). Si vous le souhaitez, cela peut ensuite être converti en un rapport pour évaluer la variation de GSH :GSSG par rapport au traitement souhaité.

La figure 4 montre les données sur le rapport GSH :GSSG de trois lignées cellulaires différentes (A549, J774 et HepG2) acquises à l’aide du protocole OPA et normalisées à l’expression des protéines via BCA (μg/mL), d’autres données spécifiant des valeurs supplémentaires de GSH et de GSSG se trouvent dans la figure supplémentaire 1.

Figure 4 : Rapport glutathion : disulfure de glutathion lors de la réalisation du dosage. On y voit les rapports glutathion/disulfure de glutathion de 3 lignées cellulaires, à savoir (A) A549, (B) J774 et (C) HepG2. Les cellules ont été incubées avec des traitements (divers nanomatériaux dans des milieux sans sérum) pendant 4 h. Les cellules ont été traitées à l’aide de ce protocole pour quantifier les changements dans le glutathion et le disulfure de glutathion et normalisées par la quantification des protéines, les barres d’erreur ± SE (n = 3, N = 3) Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La plaque contient également une série de contrôles pour s’assurer que le test s’est déroulé correctement. NEM est ajouté en tant que composant individuel pour démontrer un manque d’interaction avec les supports de détection OPA. L’étalon d’étalonnage démontre une augmentation linéaire de la concentration de GSH, ce qui démontre la capacité effective du réactif de détection OPA à se lier efficacement à des concentrations croissantes de GSH.

Il convient de noter que ce test cible spécifiquement les groupes sulfhydryles libres couramment trouvés dans les thiols (tels que le GSH, qui sont généralement considérés comme des antioxydants). Une interaction potentielle est la liaison de l’OPA aux thiols protéiques, ce qui entraînerait une collecte de données inexacte. Par conséquent, le dosage des BCA est une étape cruciale pour normaliser les données en protéines et permettre une réflexion précise du GSH libre.

Figure supplémentaire 1 : Figures démontrant le glutathion, le disulfure de glutathion et le rapport glutathion : disulfure de glutathion de 3 lignées cellulaires, à savoir (A) A549, (B) J774 et (C) HepG2. Les cellules ont été incubées avec des traitements (divers nanomatériaux dans des milieux sans sérum) pendant 4 h. Les cellules ont été traitées à l’aide de ce protocole pour quantifier les changements dans le glutathion et le disulfure de glutathion et normalisées par la quantification des protéines, les barres d’erreur ± SE (n = 3, N = 3) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Métadonnées des valeurs d’adénylate kinase pour les cellules A549 et J774. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Métadonnées des valeurs d’acide bicinchoninique avec étalonnage pour les cellules A549, J774 et HepG2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Comme indiqué, la nécessité de comprendre l’oxydoréduction cellulaire, de surveiller les états de stress oxydatif et la réponse antioxydante a toujours été cruciale pour comprendre et prévenir une myriade de maladies, telles que les cancers et la neurodégénérescence^33,34. Il s’agit d’un moyen d’améliorer le paysage translationnel en augmentant l’accessibilité d’une détection précise de GSH : GSSG avec une préparation rapide et minimale.

Ce protocole démontre une séquence multiparamétrique de tests pour la détermination des espèces intracellulaires de glutathion/thiol (réduites et oxydées), avec 2 moyens de normalisation par dosage des protéines BCA et/ou dosage AK. Ce test peut également être modifié pour détecter divers autres marqueurs lors de l’étape initiale d’extraction du médiateur et peut être simplifié de manière à donner simplement un rapport thiol oxydé/réduit à l’exclusion de la plage d’étalonnage.

Lors de l’évaluation des analytes, les mBCI et les OPA ont été explorés et comparés pour leur utilisation. Bien que le mBCl ait initialement démontré un bon potentiel de signal, des limites importantes dans son utilisation ont été découvertes. Principalement, l’utilisation de cellules vivantes démontre la meilleure utilisation du mBCl ; cependant, après la lyse cellulaire, le signal s’est avéré éteint et est généralement diminué dans un format multipuits par rapport à l’OPA³⁵. Un autre problème est la mesure du GSSG via mBCl, la littérature est rare à ce sujet, et grâce à l’optimisation / exploration du protocole, la détection précise du GSSG à travers mBCl n’a pas été obtenue.

Nous avons démontré que le test OPA présente des plages d’étalonnage significativement fiables, avec une moyenne R² de 0,9932 ± 0,007 (N = 12) sur une plage de concentration de GSH de 0,234 à 30 μM. Cette fourchette a été choisie en raison des fourchettes de référence précédentes trouvées dans la littérature³⁵. Il est théoriquement possible de détecter le glutathion en dehors de ces plages, mais il faudra modifier la concentration des réactifs, le temps d’incubation et éventuellement l’équipement utilisé pour la détection. Il convient de noter que chaque plaque nécessite sa propre plage standard pour la quantification ; La moindre variation de temps entre les plaques effectuée à des jours différents peut avoir un effet significatif sur les valeurs obtenues lors de la mesure.

L’obtention de données précises et fiables à partir de ce protocole dépend du strict respect de plusieurs étapes cruciales. Lors de la construction des différents tampons requis dans le protocole, il est crucial que le pH soit précis. Par conséquent, les tampons nécessitant un pH de 9 ne doivent pas présenter d’écart supérieur à ± 0,1 de cette valeur. Cela est dû au fait que les composants tampons peuvent précipiter hors de la solution dans un pH incorrect ; En suivant exactement ce protocole, vous éviterez ce problème.

L’élimination complète du traitement et un lavage précis avant la lyse sont également essentiels pour éviter les artefacts et l’acquisition de données inexactes pendant l’étape de lecture des plaques. Une fois que les cellules ont été lysées (étape 4.8), l’élimination du traitement n’est pas possible et la plaque ne sera pas récupérable. En raison des volumes de tampons/réactifs ajoutés tout au long du protocole variant entre les échantillons et les étalons, il est essentiel que l’utilisateur soit conscient des volumes variés, aux étapes 4.12 et 4.13. L’opérateur de test est également informé de ces volumes variés et doit s’assurer que tous les volumes sont identiques afin de permettre une mesure précise. Comme les volumes entre les échantillons et les étalons ne sont pas visiblement significatifs, il peut être facile de commettre une erreur en ce qui concerne la présence d’un excès de solution dans le puits de l’échantillon.

Ce protocole comporte des limites qui reposent sur des étapes cruciales, qui sont essentielles à l’acquisition de données précises et fiables. Les utilisateurs qui effectuent ce test doivent posséder un niveau raisonnable de compétences en laboratoire pour éviter des problèmes indésirables, tels que la formation de bulles. La formation de bulles a un impact drastique à la fois sur la capacité des réactions à se produire dans la microplaque et sur la mesure de la fluorescence. L’agent de lyse utilisé dans ce protocole contient un détergent, ce qui présente des difficultés pour un chercheur novice qui peut avoir du mal à empêcher la formation de bulles. Une centrifugation immédiate peut sauver cette erreur. Le protocole est également potentiellement limité en ce qui concerne le type de cellule ; les lignées cellulaires A549, J774 et HepG2 ont été utilisées pour optimiser et produire des données pour ce protocole. D’autres lignées cellulaires peuvent nécessiter des densités d’ensemencement différentes et une optimisation du protocole pour obtenir des données précises.

Ce protocole offre de nombreux avantages par rapport à plusieurs tests existants. Bien que la détection des thiols à l’aide de phtalaldéhyde ne soit pas un concept nouveau, l’utilisation dans un format d’essai combiné comme celui-ci, dans une microplaque, avec des matériaux et un équipement limités requis, offre un grand potentiel pour tous les laboratoires d’accéder à ce protocole. La plupart des kits Thiol/GSH des fournisseurs commerciaux ne divulguent pas la composition de leurs réactifs. Par conséquent, il peut être difficile de prévoir le potentiel d’incompatibilités/interférences. Ici, nous présentons chaque composant de tous les réactifs utilisés pour limiter ce potentiel.

Ce protocole est également exécuté assez rapidement à la fin de la période de traitement initiale. En tenant compte du traitement par l’utilisateur entre les étapes d’incubation, l’aspect quantification des thiols de ce protocole peut être effectué en moins de 1 h. Les échantillons sont simultanément lysés et liés pour empêcher l’auto-oxydation des échantillons, ce qui est optimal pour ces espèces réactionnelles. Bien que cela ne soit pas spécifié dans le protocole, les échantillons peuvent techniquement être lysés dans une plaque et scellés, ce qui permet de les congeler pour une analyse future. Cependant, cette modification du protocole n’a pas été explorée.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 et micro ; m filtre (en option-Pour tampon de lyse)	Fisher scientific	12561259
Fiole jaugée de 100 ml	scientific	15290866
1 L Fiole jaugée  ;	scientific	15230876
bécher de 250 ml (en option-Pour tampon de lyse)	Fisher scientific	15409083
Micropipette à 8 canaux (20-200µ ; L)	SLS	FA10011D2
micropipette à 8 canaux (2-20µ ; L)	Plaques SLS	B2B06492
96 puits - noires avec fond transparent, traitées TC		Fisher scientific 10000631	Plaque préférée pour l’ensemencement et la fluorescence, utiliser TC traitée transparente si indisponible
Plaques 96 puits - transparentes (traitées TC et non traitées)	Fisher scientific	10141161	Si les plaques noires avec fond transparent ne sont pas disponibles / utilisation appropriée Plaques transparentes 96 puits traitées TC
- blanches, Non traité TC	Fisher scientific	11457009
A549 (carcinome pulmonaire) lignée cellulaire	ATCC	CCL-185
Éthanol absolu	Merck (Sigma-Aldrich)	1.08543
Feuille d’aluminium	Fisher	scientific 11779408	Pour protéger les plaques de la lumière
BCA Kit de dosage	Thermo	23225
Centrifugeuse de paillasse ( avec rotor à 96 plaques)	Eppendorf	5804
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Merck (Sigma-Aldrich)	E9884
Glutathion (GSH)	Merck (Sigma-Aldrich)	G6013
Disulfure de glutathion (GSSG)	Merck (Sigma-Aldrich)	G4501
Glycérol	Merck (Sigma-Aldrich)	G5516
HCl, 37 %	Merck (Sigma-Aldrich)	258148	Diluer à 1mM pour le stock de GSH, ajustement du pH également
HepG2 (Hepatocarcinoma) lignée cellulaire	ATCC	HB-8065
IGEPAL  ; CA-630  ;	Merck (Sigma-Aldrich)	18896	Utilisez IGEPAL CA-630 ou NP-40 pour la solution, et non les deux
tampons de lyse IP  ;	Fisher scientific	11825135
J774 (monocytes, macrophages) lignée cellulaire	ATCC	TIB-67
KCl	Merck (Sigma-Aldrich)	P3911
KH2PO4  ;	Merck (Sigma-Aldrich)	P0662
Micropipette (20-200µ ; L)	SLS	B2B06482
Micropipette (2-20µ ; L)	SLS	B2B06478
Agitateur de microplaques	VWR	444-0041
Na2HPO4	Merck (Sigma-Aldrich)	S9763
NaCl	Merck (Sigma-Aldrich)	S9888
NaOH, 10M	Merck (Sigma-Aldrich)	72068	Pour l’ajustement du pH uniquement
N-Ethylmaleimide (NEM)& nbsp ;	Merck (Sigma-Aldrich)	E3876
NP-40	Merck (Sigma-Aldrich)	492016	Utilisez IGEPAL CA-630 ou NP-40 pour la solution, mais pas les deux.
Ortho-phtalididéhyde (OPA)	Merck (Sigma-Aldrich)	P1378
PBS 0.1M	Merck (Sigma-Aldrich)	P2272	Le PBS peut être acquis préfabriqué ou fabriqué en interne, voir notes
Lecteur de plaques (avec capacité de fluorescence)	Tecan	SPARK
Barre d’agitation (en option-Pour tampon de lyse)		Fisher scientific 16265731
Kit de biodosage Toxilight (AK assay)	Lonza	LT17-217
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) 0,5 M  ; en H2O	Alfa Aesar	H51864	Peut également être acheté cristallisé et en suspension
TRIS-HCl	Merck (Sigma-Aldrich)	93363
X100 cocktail de phosphatase et de protéase  ;	Fisher 10025743		scientifique