Estimation de la sensibilité structurelle de régions intrinsèquement désordonnées en réponse à un stress hyperosmotique dans des cellules vivantes à l’aide de FRET

Résumé

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des domaines protéiques flexibles qui modifient leur conformation en réponse aux changements environnementaux. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence d’ensemble (FRET) peut estimer les dimensions des protéines dans différentes conditions. Nous présentons une approche FRET pour évaluer la sensibilité structurelle de l’IDR dans les cellules vivantes de Saccharomyces cerevisiae sous stress hyperosmotique.

Résumé

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des domaines protéiques qui participent à des processus cellulaires cruciaux. Dans des conditions de stress, les propriétés physico-chimiques de l’environnement cellulaire changent, ce qui a un impact direct sur l’ensemble conformationnel des IDR. Les bilans approfondis sont intrinsèquement sensibles aux perturbations environnementales. L’étude de la façon dont les propriétés physico-chimiques de la cellule régulent l’ensemble conformationnel des IDR est essentielle pour comprendre le contrôle environnemental de leur fonction. Ici, nous décrivons une méthode étape par étape pour mesurer la sensibilité structurelle des IDR dans les cellules vivantes de Saccharomyces cerevisiae en réponse à des conditions de stress hyperosmotique. Nous présentons l’utilisation du transfert d’énergie par résonance de fluorescence d’ensemble (FRET) pour estimer comment les dimensions globales des IDR changent lors d’une augmentation progressive du stress hyperosmotique imposé aux cellules avec n’importe quel osmolyte. De plus, nous fournissons un script pour traiter les mesures de fluorescence et comparer la sensibilité structurelle pour différents IDR. En suivant cette méthode, les chercheurs peuvent obtenir des informations précieuses sur les changements conformationnels que subissent les IDR dans le milieu intracellulaire complexe lors de changements d’environnement.

Introduction

Les régions intrinsèquement désordonnées (IDR) sont des composants essentiels des processus cellulaires¹. En combinaison avec des domaines structurés, les IDR sont essentiels pour les fonctions des protéines. La composition en acides aminés des IDR est biaisée, représentée principalement par des résidus chargés, hydrophiles et petits. En raison de cette propriété, les IDR sont considérés comme des domaines de faible complexité ^2,3. De nombreux IDR ont attiré l’attention, principalement parce que ces régions jouent un rôle crucial dans les conditions pathologiques, en particulier les mal....

Protocole

1. Construction plasmidique

1. Amplifiez le cadre de lecture ouvert (ORF) qui code pour l’IDR souhaité par réaction en chaîne par polymérase (PCR). N’incluez pas le codon stop car l’ORF sera flanqué des gènes qui codent pour les protéines fluorescentes. Pour l’amplification, concevez des amorces avec les sites de restriction SacI (5') et BglII (3').
   NOTE : Pour la section des résultats représentatifs, nous avons utilisé AtLEA4-5 comme IDR sélectionné. Nous avons amplifié l’ORF d’AtLEA4-5 à partir du plasmide pTrc99A-AtLEA4-5¹².
2. Digérer le produit de PCR ORF par restriction consécutive avec ....

Résultats

Après transformation de cellules de levure avec le plasmide pDRFLIP38-AtLEA4-5, la fluorescence des transformants positifs a été observée avec un transilluminateur à lumière bleue et un filtre (Figure 1). La préparation des différentes solutions pour induire un stress hyperosmotique prend du temps, nous vous suggérons donc de suivre le modèle à 96 puits de la figure 2. Immédiatement après le traitement de stress hyperosmotique avec des concentrations variables d.......

Discussion

La méthode présentée ici offre un moyen d’obtenir des informations sur la façon dont les dimensions globales de l’ensemble des IDR perçoivent et réagissent aux perturbations environnementales. Cette méthode repose sur une construction génétiquement codée et ne nécessite aucun composant supplémentaire au-delà d’une expression stable du plasmide dans les cellules de levure, ce qui la rend adaptable à des applications potentielles dans d’autres types de cellules. De plus, il est polyvalent pour explorer d’autres perturbatio.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaque 96 puits	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cellules	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB média	Sigma-Aldrich	L2897
Acétate de lithium 0,1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Agarose à bas point de fusion	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifugeuse	eppendorf	5452000010
Kit miniprep	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40 %	Sigma-Aldrich	1546547
plasmide pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Lecteur de plaques	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
ADN de spermatozoïde de saumon 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Cloure de sodium	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminateur	Accuris instruments	E4000
Spectrophotomètre UV-visible	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD média	Sigma-Aldrich	Y1500

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