Modèle expérimental de péri-implantite induite par ligature chez la souris

Les implants dentaires sont de plus en plus répandus comme un choix souhaitable pour remplacer les dents manquantes¹. La prévalence des implants dentaires dans la population adulte américaine devrait augmenter jusqu’à 23 % d’ici 2026². Sur la base d’un rapport d’analyse de marché de Grand View Research (2022), la taille du marché mondial des implants dentaires devrait atteindre environ 4,6 milliards de dollars américains en 2022. En outre, il devrait afficher un taux de croissance annuel régulier d’environ 10 % jusqu’en 2030³. Malheureusement, l’utilisation d’implants dentaires peut entraîner des complications, telles que la péri-implantite. La péri-implantite a été définie comme une affection induite par un biofilm caractérisée par une inflammation de la muqueuse péri-implantaire et une perte progressive ultérieure de l’os de soutien⁴.

Une revue systématique a révélé que la prévalence moyenne de la péri-implantite était de 19,53 % (intervalle de confiance [IC] à 95 %, 12,87 à 26,19 %) au niveau du patient et de 12,53 % (IC à 95 % : 11,67 à 13,39 %) au niveau de l’implant⁵. La péri-implantite représente une santé publique croissante, en raison d’une augmentation des échecs implantaires et, par conséquent, des coûts de traitement importants⁶.

Comprendre la pathogenèse de la péri-implantite est crucial pour développer une approche systématique visant à prévenir son apparition et sa progression et à maximiser la longévité des implants dentaires en termes d’esthétique et de fonction ^7,8. En ce sens, l’utilisation de modèles murins dans la recherche dentaire s’est avérée avantageuse, étant donné que les souris partagent plus de 95 % de leurs gènes avec les humains ^9,10, le nombre de bases de données génétiques disponibles en ligne et la capacité de reproduire des scénarios cliniques¹¹. Tous les avantages décrits permettent la dissection des mécanismes génétiques dans différentes maladies¹², un hébergement et une prise en charge accessibles, et des anticorps largement disponibles sous forme de panels humains, au-delà de la disponibilité des modifications génétiques (par exemple, knock-out et surexpression) pour l’évaluation des tissus inflammatoires et la cartographie des maladies¹³. Bien qu’avantageux, il existe peu de publications traitant de la péri-implantite chez la souris. Cela est dû à des défis méthodologiques, entre autres, notamment la difficulté d’obtenir des mini-implants ou de les installer.

Pour développer la péri-implantite chez la souris, de nombreux protocoles ont été décrits, tels que la péri-implantite induite par ligature, la péri-implantite induite par les bactéries¹⁴, la péri-implantite induite par le lipopolysaccharide (LPS)¹⁵, ou la combinaison LPS + péri-implantite induite par la ligature¹⁶. Ici, nous nous concentrerons sur le modèle de ligature car c’est la méthode la plus largement acceptée pour induire la parodontite 17,18,19 et, plus récemment, la péri-implantite ^20,21. La ligature placée autour des implants en position sous-muqueuse stimule l’accumulation de plaque et, par conséquent, l’inflammation des tissus. Ainsi, le développement de cette approche est basé sur l’indication d’une technique coût-bénéfice viable pour les investigations précliniques sur les maladies péri-implantaires. Cette étude vise à décrire un modèle expérimental de péri-implantite induite par ligature chez la souris et à déterminer s’il y a une efficacité dans l’induction de cette maladie compte tenu des changements osseux et tissulaires observés.

L’objectif général de cet article est de rapporter le protocole appliqué pour induire une péri-implantite chez la souris par ligature et d’observer son efficacité par évaluation tissulaire et perte osseuse autour des implants.

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Chancellor’s Animal Research Committee de l’Université de Californie à Los Angeles (numéro de protocole ARC 2002-125) et l’Animal Research : Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE)²². Pour cette méthode, dix-huit souris mâles C57BL/6J âgées de 3 semaines ont été utilisées et ont subi des extractions dentaires, la pose d’implants et l’induction de la péri-implantite. Toutes les procédures dentaires ont été effectuées sous un grossissement microscopique de 10 × et effectuées par des opérateurs formés et calibrés (Figure 1A).

1. Étapes de pré-extraction

1. Effectuer l’intervention dans une salle d’opération conforme à toutes les normes de biosécurité et de protection.
2. Effectuer l’asepsie de toutes les surfaces avec triple friction à l’aide d’une solution d’alcool isopropylique à 70 %.
3. Anesthésier des souris mâles C57BL/6J âgées de 3 semaines avec 3 % d’isoflurane. Vérifiez l’absence de réponse au retrait de la patte au toucher pour vous assurer d’obtenir une profondeur anesthésique suffisante.
4. Pour éviter d’interférer avec les procédures dans la bouche, utilisez un cône de nez pour maintenir l’anesthésie à l’isoflurane.
5. Avoir un opérateur auxiliaire pour stabiliser l’animal et maintenir l’ouverture de la bouche (figure 1B).
6. Appliquez un lubrifiant ophtalmique pour éviter l’irritation des yeux avant de commencer l’extraction.

Figure 1 : Adaptations opératoires : (A) Grossissement microscopique. (B) Système d’anesthésie par inhalation adapté et stabilisation pour l’ouverture de la bouche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Extraction dentaire

1. Pour les extractions dentaires, introduire un explorateur dentaire #5 entre la première et la deuxième molaire pour commencer les procédures d’élévation et de luxation en déplaçant l’instrument dans le sens mésio-distal jusqu’à ce que la dent se déplace dans l’alvéole (Figures 2A).
2. Ensuite, introduisez l’explorateur dentaire #5 dans le site mésial de la première molaire. Pour ce faire, déplacez l’instrument dans le sens mésio-distal jusqu’à ce que la dent se déplace dans l’alvéole.
3. Après l’élévation, utilisez la pince à pointe et la pince à suture pour retirer la 1^ère molaire.
4. Ensuite, introduisez l’explorateur dentaire entre la 2^e et la 3^e molaire pour élever et luxer la 2^e molaire (Figure 2B).
5. Ensuite, utilisez la pince à pointe et/ou la pince à suture pour retirer la dent à l’aide des instruments pour la maintenir et la retirer de la bouche. (Figure 2C).
6. Après les extractions dentaires, assurez-vous de l’obtention d’une hémostase complète en utilisant un coton stérile (Figure 2D) pendant 1 min (Figure 2E,F).
7. Immédiatement après l’extraction, fournir à tous les animaux des analgésiques (Carprofène/Rimadyl 5 mg/kg) toutes les 24 h. Administrer le médicament par injection sous-cutanée.
8. De plus, remplacez les aliments réguliers par une alimentation molle. Administrer l’antibiotique (Amoxil 0,25 mg/mL) par voie orale en incorporant le médicament dans l’eau de boisson. Faites-le pendant quatre semaines après les extractions.

Figure 2 : Séquence d’extraction initiale : (A, B) Région maxillaire avec 1re et 2e molaires et utilisation de l’explorateur dentaire pour l’élévation et la luxation. (C) Utilisation de la pince à pointe et de l’explorateur pour la luxation et l’extraction des dents. (D) Hémostase. (E, F) Aspect alvéolaire après extractions. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Pose d’implants

1. À l’aide d’une lame 15c, créer une incision mésio-distale à travers le tissu kératinisé dans la zone correspondant aux dents précédemment présentes. Utilisez les molaires maxillaires droites comme référence spatiale (Figure 3A).
2. Soulevez les lambeaux buccaux et palatins de pleine épaisseur à l’aide d’un explorateur dentaire #5, en assurant une élévation complète du lambeau (Figure 3B).
3. Effectuez l’ostéotomie à l’aide d’une micro-perceuse à main en carbure de 0,3 mm de diamètre fixée à un étau à goupille (perceuse à main) et activez-la dans le sens des aiguilles d’une montre. Créez des sites d’ostéotomie avec environ 1 mm de profondeur dans les alvéoles d’extraction cicatrisées (Figure 3C).
4. Placez les implants en forme de vis conçus sur mesure avec une surface usinée lisse (1,0 mm de long et 0,5 mm de diamètre) fabriqués à partir de tiges en titane 6AL4V (figure 3D), une par animal, en autotaraudant dans la région des première et deuxième molaires maxillaires gauches en utilisant un mouvement de vissage dans le sens des aiguilles d’une montre (figure 3E-I).
5. Immédiatement après la pose de l’implant, administrer des analgésiques (Carprofène/Rimadyl 5mg/kg toutes les 24 h) par injection sous-cutanée.
6. Laissez les implants guérir pendant quatre semaines, pendant lesquelles administrez des antibiotiques et nourrissez-les comme décrit précédemment.
7. À la fin de la période de cicatrisation, assurez-vous que la plaie muqueuse est complètement fermée et a un aspect rose clair.

Figure 3 : Séquence de pose de l’implant : (A) Incision à l’aide d’une lame 15c fixée à la poignée. (B) Lamelles pleine épaisseur utilisant l’explorateur dentaire #5. (C) Ostéotomie à l’aide d’une micro-perceuse à main en carbure de 0,3 mm fixée à un étau à épingle. (D) Implant dentaire en titane. (E, F) Support d’implant et porte-implant. (G-I) Pose de l’implant en utilisant un mouvement de vissage dans le sens des aiguilles d’une montre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Induction de la péri-implantite

1. Placez une ligature de soie (6-0) autour de chaque fixation immédiatement apicale à la tête de l’implant en contournant la surface de l’implant et en la fixant avec un double nœud. Conservez la ligature pendant deux semaines pour permettre le développement de la péri-implantite.
2. Vérifiez les ligatures tous les deux jours pour vous assurer qu’elles sont toujours présentes. S’il manque, placez une nouvelle ligature.

Figure 4 : Séquence de péri-implantite induite par la ligature. (A-D) Ligature en soie (6.0) placée autour de la tête de l’implant. (E-G) Fermeture du nœud. (H) Coupe de ligature. (I) Comparution finale. Images cliniques obtenues à partir d’animaux vivants sous sédation. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

5. Sacrifice

1. Après la période d’induction de la péri-implantite (deux semaines), sacrifier tous les animaux avec une forte concentration d’isoflurane inhalée, suivie d’une méthode secondaire de luxation cervicale avec une tige enfoncée dans la base du crâne et tirant rapidement les membres postérieurs, provoquant la séparation des vertèbres cervicales du crâne.
2. Séparez les maxillaires à l’aide d’instruments tranchants, tels que des ciseaux chirurgicaux, qui sépareront toute la mâchoire de l’animal du reste du corps.
3. Photographier les maxillaires à l’aide d’un microscope optique, les fixer dans du formol à 10 % pendant 24 h, puis les stocker dans de l’éthanol à 70 %.

6. Micro-tomodensitométrie (μCT )

1. Scanner les maxillaires comme décrit précédemment^18,19 à l’aide d’une micro-tomodensitométrie (micro-TDM).
2. Allumez le scanner et l’ordinateur, puis ouvrez le logiciel de numérisation, cliquez sur le signe de rayonnement et attendez 15 minutes pour le préchauffer.
3. Ouvrez la porte de l’équipement en cliquant sur l’icône de la porte.
4. Utilisez une table rotative de taille quart de taille. Placez le maxillaire sur un tube conique de 15 ml. Fixez le tube dans la base de la table rotative. Placez la table rotative dans la vis de l’équipement.
5. Fermez la porte de l’équipement en cliquant sur l’icône de la porte.
6. Allumez la source de rayons X.
7. Cliquez sur l’icône de capture d’image et assurez-vous que l’os est sur le terrain.
8. Ajustez une résolution de 10 μm de taille de pixel, une énergie de rayons X de 55 KVp et 181 μA, un filtre d’AI 0,5 mm, un pas de rotation de 0,4, une image moyenne de 10. Ces paramètres génèrent une durée d’analyse estimée à 24 minutes.
9. Commencez l’acquisition.
10. Pour la reconstruction, ouvrez le logiciel de reconstruction. Utilisez un durcissement de la poutre de 20 %. Utilisez un artefact annulaire de 5 %. Utilisez une plage dynamique de 0 à 0,13. Désélectionnez l’étiquette ON. Cliquez sur Aperçu. Choisissez la vue adéquate pour la région d’intérêt et enregistrez-la au format TIFF.
11. Orientez les images obtenues à l’aide d’un logiciel de visualisation et d’analyse des données. Rendre l’axe long de la tête d’implant parallèle aux axes sagittal et coronal et perpendiculaire à l’axe axial.
12. Enregistrez l’image sagittale en tant qu’image unique pour une analyse osseuse linéaire.
13. Enregistrez l’image transaxiale en tant qu’ensemble de données pour l’analyse volumétrique de l’os.
14. Effectuez une analyse osseuse linéaire à l’aide du logiciel d’analyse de données. Mesurez les distances en millimètres entre la tête de l’implant et l’os alvéolaire dans les plans sagittal et coronal, y compris les sites mésial, distal, buccal et palatin.
15. Effectuer une analyse osseuse volumétrique à l’aide d’un logiciel d’analyse de données. Suivez la perte osseuse autour des implants en dessinant la région d’intérêt dans toutes les lames correspondant à la perte osseuse.

7. Analyse statistique

1. Mesurer la perte osseuse par microtomographie linéaire et volumétrique et normaliser ces valeurs en divisant chaque valeur par la moyenne du groupe témoin. Présenter une moyenne pour tous les groupes, sous forme de moyenne ± d’erreur-type de la moyenne (SEM).
2. Comparez la signification à l’aide d’une analyse de variance à deux facteurs (ANOVA) suivie d’un test de Tukey avec un intervalle de confiance de 95 %. (Prisme 5). Appliquez les niveaux de signification suivants : p≤0,01**, p≤0,001****.

Pour cette méthode, dix-huit souris mâles C57BL/6J âgées de 3 semaines ont été utilisées et ont subi des extractions dentaires, la pose d’implants et l’induction de la péri-implantite. Il y avait neuf animaux par groupe, ce qui était statistiquement significatif, compte tenu de la perte osseuse linéaire atteignant 80 % de puissance, 15 % d’écart-type (σ) et un intervalle de confiance à 95 % (α = 0,05). Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire à volonté pendant l’expérience. Neuf souris ont reçu une ligature (groupe expérimental de péri-implantite induite par la ligature) et neuf souris n’ont pas reçu de ligature (groupe témoin).

Le taux de réussite de l’ostéointégration implantaire
En respectant la période de guérison de quatre semaines et en observant la stabilité clinique, les implants de notre étude ont eu une survie élevée et des taux de réussite de 100% car aucun des implants posés n’a été perdu. Aucun autre effet indésirable n’a été observé.

Évaluation clinique
À l’aide de la microscopie optique, l’évaluation clinique a été effectuée par inspection visuelle et photos cliniques immédiatement après le sacrifice des souris (Figure 5). Par rapport au groupe témoin, une inflammation, la formation de poches et une augmentation de l’œdème des tissus mous ont été observées autour de l’implant dans le groupe péri-implantite. Aucune preuve de complications phénotypiques cliniques graves n’a été observée.

Figure 5 : Images cliniques représentatives des groupes (A) sans ligature (NL) et (B) ligature (L) 2 semaines après la ligature. Une augmentation de l’œdème des tissus mous a été observée autour de l’implant dans le groupe péri-implantite par rapport à l’autre groupe. Grossissement 20X. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse par microtomodensitométrie (μCT)
Deux semaines après la mise en place de la ligature, lors de la comparaison des groupes sans ligature et ligature, il y avait des différences significatives dans la hauteur des os observée par analyse linéaire (Figure 6A, B et C) et le volume de perte osseuse observé par analyse volumétrique (Figure 6D). La perte osseuse linéaire dans le groupe PI induit par la ligature a été significativement augmentée par rapport au groupe témoin. De même, en comparant la perte osseuse volumétrique, le groupe PI a montré une perte osseuse circonférentielle plus importante que le groupe témoin.

Figure 6 : Analyse par micro-tomodensitométrie. (A) Coupes microtomographiques représentatives des groupes contrôle (non-ligature - NL) et (B) péri-implantite (ligature - L). (C) Le graphique représente la distance moyenne entre la tête de l’implant et l’os alvéolaire 2 semaines après la ligature. (D) Le graphique représente la perte osseuse volumétrique circonférentielle moyenne 2 semaines après la ligature. Données représentées sous forme de SEM moyen. *p<0,05 (n≥5 pour tous les groupes/points temporels). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Évaluation histologique
Pour déterminer les changements cellulaires, y compris la perte osseuse autour de l’implant, des échantillons décalcifiés ont été sectionnés et colorés à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) (Figure 7). Le processus de décalcification a été effectué en immergeant les échantillons dans de l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 15 %, pH 7,4, pendant quatre semaines, en changeant la solution tous les trois jours. Une fois les implants retirés, les échantillons ont été intégrés dans de la paraffine. Ainsi, des coupes de paraffine dimensionnées sagittales de 5 μm d’épaisseur ont été colorées avec HE, selon les protocoles standard. En conséquence, une migration épithéliale apicale plus importante, une infiltration cellulaire modérée et une perte osseuse ont été observées dans les échantillons de péri-implantite par rapport au groupe témoin.

Figure 7 : Images sagittales H&E représentatives des groupes de ligature (NL) (A) et (B) ligature (L). Augmentation de la migration épithéliale apicale et de la perte osseuse dans le groupe ligature par rapport au groupe témoin. Grossissement 20x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Selon le consensus le plus récent sur la classification des maladies et affections péri-implantaires, le diagnostic de la péri-implantite nécessite une perte osseuse au-delà des changements au niveau de l’os crestal résultant d’un remodelage osseux initial22. Par conséquent, notre étude présente des paramètres de diagnostic de péri-implantite bien établis et validés. Et offrir une évaluation complète de la condition étudiée.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.