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Article de méthode

Une approche de clonage sans couture pour la construction de vecteurs d’expression du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin

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DOI :

10.3791/66320

⸱

17 mai 2024

 ,  , 
1College of Life Sciences, China West Normal University, 2Sichuan Sports College, 3Pathology Department, Suining Central Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV en introduisant des sites de restriction appropriés à l’extrémité 3' des inserts. Nous pouvons linéariser le vecteur et joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un grâce à la technologie de recombinaison homologue.

Résumé

La construction de vecteurs d’expression génique est une composante importante des travaux de laboratoire en biologie expérimentale. Avec les progrès techniques tels que l’assemblage Gibson, la construction vectorielle devient relativement simple et efficace. Cependant, lorsque le génome complet du virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) ne peut pas être facilement amplifié par une seule réaction en chaîne par polymérase (PCR) à partir de l’ADNc, ou qu’il est difficile d’acquérir un vecteur d’expression génique complet par recombinaison homologue de plusieurs inserts in vitro, la technique actuelle d’assemblage de Gibson ne parvient pas à atteindre cet objectif.

Par conséquent, nous avons cherché à diviser le génome du SDRP en plusieurs fragments et à introduire des sites de restriction appropriés dans l’amorce inverse pour obtenir des fragments amplifiés par PCR. Après avoir joint le fragment d’ADN précédent dans le vecteur par la technologie de recombinaison homologue, le nouveau vecteur a acquis le site de clivage de l’enzyme de restriction. Ainsi, nous pouvons linéariser le vecteur en utilisant le site de clivage enzymatique nouvellement ajouté et introduire le fragment d’ADN suivant en aval du fragment d’ADN en amont.

Le site de clivage de l’enzyme de restriction introduit à l’extrémité 3' du fragment d’ADN en amont sera éliminé, et un nouveau site de clivage sera introduit à l’extrémité 3' du fragment d’ADN en aval. De cette façon, nous pouvons joindre des fragments d’ADN au vecteur un par un. Cette méthode est applicable pour construire avec succès le vecteur d’expression du SDRP et constitue une méthode efficace pour assembler un grand nombre de fragments dans le vecteur d’expression.

Introduction

En tant que technique essentielle pour construire des outils expérimentaux basés sur l’ADN pour l’expression dans les cellules procaryotes et eucaryotes, le clonage moléculaire est une composante très importante de la biologie expérimentale. Le clonage moléculaire implique quatre processus : l’acquisition de l’ADN de l’insert, la ligature de l’insert dans le vecteur approprié, la transformation du vecteur recombinant en Escherichia coli (E. coli) et l’identification des clones positifs1. Jusqu’à présent, plusieurs méthodes ont été adoptées pour assembler des molécules d’ADN en utilisant des enzymes de restriction 2,3 et une recombinaison médiée par PCR 4,5,6. La recombinaison homologue, connue sous le nom de technologie de clonage sans soudure, est le groupe de méthodes de clonage, qui permet l’insertion indépendante de la séquence et sans cicatrice d’un ou plusieurs fragments d’ADN dans un vecteur. Cette technologie comprend le clonage indépendant de la séquence et de la ligature (SLIC), l’extrait de clonage de ligature sans couture (SLiCE), l’infusion et l’assemblage Gibson. Il utilise une exonucléase pour dégrader un brin de l’insert et un vecteur pour générer des extrémités cohésives, et soit une réparation in vivo, soit une recombinaison in vitro pour joindre de manière covalente l’insert au vecteur en formant des liaisons phosphodiester. La possibilité de joindre un seul insert à un vecteur à n’importe quelle séquence sans aucune cicatrice est très attrayante. De plus, la technologie a la capacité de joindre 5 à 10 fragments dans un ordre prédéterminé sans restriction de séquence.

En tant que l’une des nombreuses techniques d’ADN recombinant, la technique d’assemblage Gibson, actuellement la méthode de clonage la plus efficace 7,8, est une méthode robuste et élégante basée sur l’exonucléase pour assembler un ou plusieurs fragments d’ADN linéarisés de manière transparente. La réaction d’assemblage de Gibson est réalisée dans des conditions isothermes à l’aide d’un mélange de trois enzymes, à savoir l’exonucléase 5', la polymérase haute fidélité et une ADN ligase thermostable. Les surplombs monobrins de 3' créés par l’exonucléase de 5'-3' contribuent au recuit de fragments qui partagent la complémentarité à une extrémité. La polymérase haute fidélité comble efficacement les lacunes dans les régions monocaténaires recuites en ajoutant des dNTP, et l’ADN ligase thermostable scelle les entailles pour former des molécules d’ADN articulaires8. Par conséquent, cette méthode technique a été largement utilisée pour la construction de vecteurs d’expression génique.

Le syndrome dysgénésique et respiratoire porcin (SDRP) est une maladie virale qui entraîne des troubles de la reproduction et une insuffisance respiratoire chez les porcs causée par le SDRP à l’âge de9 ans. Le syndrome se manifeste par de la fièvre, de l’anorexie, une pneumonie, une léthargie, une dépression et une détresse respiratoire. De plus, des signes cliniques, notamment une décoloration rouge/bleue des oreilles, ont été observés dans certaines épidémies. En tant que membre de la famille des artérivirus, le SDRP est largement transmis aux pays producteurs de porc par contact direct et échange de liquides, notamment l’urine, le colostrum et la salive. En raison de la propagation du SDRP aux États-Unis, les pertes économiques totales de l’industrie porcine ont été estimées à environ 664 millions de dollars par an, sur la base de l’échelle de reproduction de 5,8 millions de truies et de 110 millions de porcs10,11. Le rapport du Service d’inspection de la santé animale et végétale montre que 49,8 % des porcs non vaccinés présentent la présence du SDRP dans le sérum12 et que de faibles niveaux de SDRP chez les porcs infectés sont excrétés par la salive, les sécrétions nasales, l’urine et les matières fécales13. De multiples stratégies ont été mises en œuvre pour contrôler la propagation du SDRP 14,15,16. En plus des procédures d’élimination visant à créer des populations complètement négatives pour le virus ou à améliorer la biosécurité et la gestion, l’administration de vaccins est un moyen efficace de contrôler le SDRP.

Le SDRP est un virus à ARN monocaténaire enveloppé de polarité positive d’une longueur d’environ 15 kilobases (kb). Le génome du SDRP se compose d’au moins 10 cadres de lecture ouverts (ORF), d’une courte région non traduite de 5' (5' UTR) et d’une queue poly(A) à l’extrémité 3' (Figure 1A)17. Le génome d’un virus à ARN à brin négatif n’est pas infectieux, tandis que le génome d’un virus à ARN à brin positif est infectieux. Il existe deux stratégies principales pour la transfection de l’ARN et de l’ADN afin de générer la descendance du virus18. Cependant, le clonage du fragment complet correspondant au génome de l’ARN est crucial pour la construction de clones infectieux. En raison de la nature longue et complexe du génome du SDRP, il n’est pas facile d’obtenir le génome complet par PCR en une seule fois. De plus, bien que la synthèse artificielle des gènes du SDRP soit une solution efficace, la synthèse de longs fragments est souvent coûteuse. Par conséquent, pour obtenir le vecteur d’expression PRRSV pleine longueur, nous avons tenté de le créer par la méthode de recombinaison homologue à inserts multiples19,20. Malheureusement, nous n’avons pas été en mesure d’obtenir le vecteur d’expression génique complet. Par conséquent, dans cette étude, nous avons ajouté des sites de restriction appropriés à l’amorce inverse et avons réussi à obtenir le vecteur d’expression pVAX1-PRRSV par plusieurs séries de réactions de recombinaison homologues. De plus, cette méthode peut également réaliser la suppression ou la mutation de gènes cibles et joindre efficacement un grand nombre de fragments d’ADN au vecteur d’expression.

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Protocole

1. Préparation du modèle du gène du SDRP

  1. Décongeler le stock viral dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN (voir le tableau des matières).
  2. Ajouter 0,2 mL de chloroforme et bien mélanger. Incuber pendant 3 min.
  3. Centrifuger le mélange pendant 15 min à 12 000 × g à 4 °C.
    REMARQUE : Le mélange est divisé en trois phases, à savoir, une phase aqueuse incolore, une interphase et une phase phénol-chloroforme rouge.
  4. Pipetez la phase aqueuse incolore et transférez-la dans un nouveau tube.
  5. Bien mélanger la phase aqueuse avec 0,5 mL d’isopropanol et incuber pendant 10 min à 4 °C.
  6. Centrifuger pendant 10 min à 12 000 × g à 4 °C.
    REMARQUE : Le fond du tube a un précipité d’ARN blanc.
  7. À l’aide d’une micropipette, jette le surnageant du tube.
  8. Ajoutez 1 ml d’éthanol à 75 % pour remettre la pastille en suspension et agitez brièvement.
  9. Centrifuger pendant 5 min à 7 500 × g à 4 °C. À l’aide d’une micropipette, jette le surnageant du tube.
  10. Faites sécher l’ARN pendant 5 min, ajoutez 20 à 50 μL d’eau exempte de RNase pour remettre l’ARN en suspension et mélangez soigneusement.
  11. Procédez à la transcription inverse ; configurez les réactions pour effectuer la transcription inverse comme indiqué dans le tableau 1.
    REMARQUE : Pour assurer une transcription inverse réussie, utilisez des matrices d’ARN de haute qualité.
  12. Utilisez l’ADNc obtenu pour la PCR ou stockez-le à -20 °C.

2. Conception de l’amorce PCR

  1. Conception de l’amorce avant
    1. Ouvrez le logiciel et choisissez Nouveau fichier ADN.
    2. Collez la séquence du gène PRRSV (GenBank : FJ548852.1) de NCBI dans le logiciel. Cliquez sur OK pour générer les fichiers de séquence.
    3. Analysez la séquence et marquez les jonctions de fragments. Concevez l’amorce de séquence spécifique des fragments. Dans la plupart des cas, la température de fusion préférable (Tm) est comprise entre 55 °C et 62 °C, et la teneur en GC est de 40 à 60 %.
    4. Cliquez sur Primers et choisissez Add Primer.
    5. Collez la séquence spécifique et ajoutez des séquences de chevauchement du vecteur au premier nucléotide 5' de l’amorce de la séquence spécifique. Près de chaque jonction, choisissez 20-40 pb pour servir de région de chevauchement entre les deux fragments adjacents.
    6. Nommez l’amorce avant contenant les porte-à-faux et la séquence spécifique (voir la figure supplémentaire S1).
    7. Cliquez sur Ajouter une introduction au modèle.
  2. Conception de l’amorce inversée
    1. Analysez la séquence et marquez les jonctions de fragments dans le logiciel. Concevez l’amorce de séquence spécifique inverse des fragments.
    2. Cliquez sur Primers et choisissez Add Primer.
    3. Collez la séquence spécifique et ajoutez le site de restriction au premier nucléotide 5' de l’amorce de séquence spécifique.
      REMARQUE : Les sites de restriction ajoutés doivent être absents du fragment d’insertion et du vecteur, à l’exception des sites de clonage multiples.
    4. Ajoutez des séquences de vecteurs en surplomb de 20 à 40 pb au premier nucléotide 5' du site de restriction.
    5. Nommez l’amorce inverse contenant les surplombs et la séquence spécifique (voir la figure supplémentaire S1).
    6. Cliquez sur Ajouter une introduction au modèle.

3. La PCR pour amplifier les fragments

  1. Mettre en place six réactions PCR individuelles (tableau 2) : pour le fragment 1, utiliser les amorces P1 et P2 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 2, utiliser les amorces P3 et P4 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 3, utiliser les amorces P5 et P6 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 4, utiliser les amorces P7 et P8 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 5, utilisez les amorces P9 et P10 ; et utiliser les amorces P11 et P12 pour amplifier le fragment 6 (voir la figure supplémentaire S2).
    REMARQUE : Décongelez, mélangez et centrifugez brièvement chaque composant avant utilisation.
  2. Exécutez la PCR à l’aide du protocole en trois étapes du Tableau 2.
  3. Ajoutez 1 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 5 μL de produit PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu.
  4. Analysez les échantillons à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.

4. Purification des fragments de PCR

REMARQUE : La purification des produits PCR à partir d’un gel à l’aide d’un kit d’extraction de gel (voir le tableau des matériaux) est importante pour la construction vectorielle.

  1. Ajoutez 9 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 45 μL de produits PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu.
  2. Effectuez une électrophorèse sur gel d’agarose à 1 % pour séparer les fragments d’ADN.
    REMARQUE : Ne réutilisez pas le tampon de fonctionnement TAE car sa valeur de pH affectera la récupération des fragments d’ADN.
  3. Une fois les bandes correctement séparées, utilisez un scalpel bien aiguisé pour exciser soigneusement les bandes d’ADN.
    REMARQUE : Minimisez la taille de la tranche de gel en coupant l’excès d’agarose.
  4. Pesez la tranche de gel dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml, ajoutez un volume égal de tampon de liaison à la tranche de gel (p. ex., de 0,3 mL à une tranche de 0,3 g) et laissez incuber à 60 °C pendant 7 min.
  5. Insérez une mini-colonne dans un tube de prélèvement de 2 ml. Ajouter 700 μL de solution d’ADN/agarose de l’étape 4.4 dans la mini-colonne.
  6. Centrifuger à 10 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement.
  7. Ajouter 300 μL de tampon de liaison et centrifuger à 13 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement.
  8. Ajouter 700 μL de tampon de lavage et centrifuger à 13 000 × g pendant 1 min à température ambiante. Jetez le filtrat et réutilisez le tube de prélèvement.
  9. Faites tourner la mini-colonne vide pendant 2 min à vitesse maximale pour sécher la matrice de la colonne. Placez la mini-colonne dans un tube de microcentrifugation propre de 1,5 ml.
  10. Ajouter 20 μL d’eau déminéralisée directement au centre de la membrane de la colonne et laisser reposer à température ambiante pendant 2 min. Centrifugeuse à 13 000 × g pendant 1 min.
  11. Stockez l’ADN à -20 °C.

5. Préparation d’un vecteur linéarisé

REMARQUE : Après avoir préparé le plasmide, les enzymes sélectionnées peuvent être utilisées pour le couper. La digestion longue ou la digestion à double enzyme est cruciale pour assurer la digestion de tout l’ADN. Cela réduira le nombre de clones faussement positifs dans les expériences ultérieures.

  1. Linéarisation pVAX1
    1. Préparez le mélange réactionnel à température ambiante dans l’ordre indiqué (tableau 3).
      REMARQUE : Le volume d’eau doit être ajouté pour conserver le volume total de réaction indiqué. Ici, 1 μg du plasmide a été digéré avec des enzymes dans le mélange réactionnel. En fonction de la concentration du plasmide, le volume du plasmide peut être ajusté dans le mélange réactionnel.
    2. Mélanger délicatement ; puis tournez. Incuber à 37 °C dans un bloc chauffant ou un thermostat d’eau pendant 60 min.
    3. Effectuer une purification sur gel similaire à la purification des fragments de PCR dans la section 4 à l’aide du kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux).
  2. Linéarisation pVAX1-F1
    NOTE : pVAX1-F1 est le vecteur obtenu à partir du premier tour de recombinaison de pVAX1 (NdeI et HindIII) et du fragment 1. pVAX1-F2 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F1 (NdeI) et du fragment 2. pVAX1-F3 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F2 (NdeI) et du fragment 3. pVAX1-F4 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F3 (NdeI) et du fragment 4. pVAX1-F5 est le vecteur obtenu à partir de la recombinaison du cycle de pVAX1-F4 (EcoRV et NtoI) et du fragment 5.
    1. Pour chaque vecteur, préparer le mélange réactionnel séparément à température ambiante dans l’ordre indiqué (tableau 3).
    2. Mélanger délicatement ; puis tournez. Incuber à 37 °C dans un bloc chauffant ou un thermostat d’eau pendant 60 min.
    3. Effectuer une purification sur gel similaire à la purification des fragments de PCR dans la section 4 à l’aide du kit d’extraction de gel (voir Tableau des matériaux).

6. Sous-clonage vers un nouveau vecteur

REMARQUE : Une bonne efficacité de clonage peut être obtenue en utilisant 50 à 200 ng de vecteur et d’inserts.

  1. Configurez la réaction de clonage et d’assemblage sans couture ExonArt (Tableau 4). Ajustez le volume total de réaction à 10 μL à l’aide deH2O désionisé stérilisé et mélangez.
  2. Incuber la réaction dans un thermocycleur pendant 15 à 60 min à 50 °C. Conservez les échantillons sur de la glace.
    REMARQUE : Prolonger l’incubation jusqu’à 60 min peut améliorer l’efficacité de l’assemblage.
  3. Décongeler des cellules DH5α chimiquement compétentes sur de la glace.
  4. Ajouter 10 μL du produit d’assemblage dans les cellules compétentes ; Ensuite, mélangez doucement en pipetant de haut en bas.
  5. Placez le mélange sur de la glace pendant 30 min.
  6. Choc thermique à 45 °C pendant 45 s et transfert des tubes sur de la glace pendant 3 min.
  7. Ajouter 900 μL de fluide SOC dans le tube.
  8. Agitez le tube à 225 tr/min pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.
  9. Centrifuger la réaction de transformation à 6 000 × g pendant 2 min. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de milieu SOC frais.
  10. Étalez la suspension cellulaire transformée sur une plaque LB séparée avec 50 μg/mL de kanamycine.
  11. Incuber toutes les assiettes pendant la nuit à 37 °C. Choisissez des colonies isolées individuelles dans chaque plaque expérimentale.

7. Analyse des transformants

  1. Prélever huit colonies dans 20 μL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine.
  2. Configurez la réaction PCR de la colonie et exécutez la PCR (Tableau 5).
    REMARQUE : Pour la réaction de PCR de la colonie pour le fragment 1, utilisez les amorces P1 et P2 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 2, utilisez les amorces P3 et P4 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 3, utilisez les amorces P5 et P6 (voir le fichier supplémentaire 1) ; pour le fragment 4, utiliser les amorces P7 et P8 (voir la figure supplémentaire S2) ; pour le fragment 5, utilisez les amorces P9 et P10 ; et utiliser les amorces P11 et P12 pour détecter le fragment 6 (voir la figure supplémentaire S2).
  3. Ajoutez 1 μL de tampon de charge d’ADN 6x à 5 μL de produit PCR, mélangez et centrifugez brièvement le contenu.
  4. Analysez les résultats à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.
  5. Sélectionner une colonie positive dans 5 mL de milieu LB contenant 50 μg/mL de kanamycine et faire pousser toute la nuit à 37 °C.
  6. Obtenez le plasmide à l’aide d’une mini-trousse d’ADN plasmidique (voir le tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant.
  7. Visualisez les résultats à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %.

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Résultats

Dans cet article, nous présentons un système de recombinaison in vitro permettant d’assembler et de réparer des molécules d’ADN qui se chevauchent à l’aide de l’amorce inverse via des sites de restriction introduits en permanence (Figure 1B). Ce système est une procédure simple et efficace comprenant la préparation du vecteur linéaire et des fragments d’insert contenant des surplombs introduits par PCR avec des amorces ayant des séquences d’extension 5' appropriées et des sites de r...

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Discussion

La technique d’assemblage Gibson est une méthode de clonage moléculaire basée sur la recombinaison in vitro pour l’assemblage de fragments d’ADN8. Cette méthode permet d’assembler plusieurs fragments d’ADN en un plasmide circulaire dans une réaction isotherme à tube unique. Cependant, l’un des obstacles à la technique d’assemblage Gibson est l’acquisition de longs fragments à partir d’ADNc. Les longs fragments sont difficiles à amplifier avec précision pour de nombreuses raisons. Par exem...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le soutien financier des fonds d’initiation à la recherche doctorale fournis par l’Université normale de Chine Ouest (n° 20E059).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 kb plus Échelle d’ADNTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Microcentrifugeuse de paillasseThermo Fisher Scientific  ; Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  ; Co., LtdVD-650-U
Équipement d’électrophorèse de l’ADNCleaver Scientific  ; Co., Ltd170905117
Tampon de chargement d’ADN (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Kit d’extraction de gelOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Mini kit d’ADN plasmidique IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Cultivateur à température debout électro-chauffantShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
Kit de clonage et d’assemblage sans couture ExonArtRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix avec dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  ; Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  ; Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  ; Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  ; Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
machine à glaçonsShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II ADN polyméraseThermo Fisher Scientific  ; Co., Ltd12361010
LB Plaque de gélose (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB Milieu liquide stérile (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettesThermo Fisher Scientific  ; Co., Ltd&mdash ;
Four à micro-ondesPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Agitateurs orbitauxShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University&mdash ;
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1Pour concevoir des amorces
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  ; Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
Réactif TRIzolThermo Fisher Scientific  ; Co., LtdRéactif d’extraction d’ARN15596026

Références

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