AQRNA-seq pour la quantification de petits ARN

Résumé

Le séquençage de l’ARN par quantification absolue (AQRNA-seq) est une technologie développée pour quantifier le paysage de tous les petits ARN dans les mélanges biologiques. Ici, les étapes de préparation de la bibliothèque et de traitement des données d’AQRNA-seq sont démontrées, quantifiant les changements dans le pool d’ARN de transfert (ARNt) chez Mycobacterium bovis BCG pendant la dormance induite par la famine.

Résumé

AQRNA-seq fournit une relation linéaire directe entre le nombre de lectures de séquençage et le petit nombre de copies d’ARN dans un échantillon biologique, permettant ainsi une quantification précise du pool de petits ARN. La procédure de préparation de la banque AQRNA-seq décrite ici implique l’utilisation de liaisons de séquençage conçues sur mesure et une étape pour réduire les modifications de l’ARN de méthylation qui bloquent la processivité de la transcription inverse, ce qui entraîne une augmentation du rendement d’ADNc de pleine longueur. En outre, une mise en œuvre détaillée du pipeline bioinformatique qui l’accompagne est présentée. Cette démonstration de l’AQRNA-seq a été réalisée au moyen d’une analyse quantitative des 45 ARNt de Mycobacterium bovis BCG récoltés pendant 5 jours choisis au cours d’une période de 20 jours de privation de nutriments et de 6 jours de réanimation. Les efforts en cours pour améliorer l’efficacité et la rigueur d’AQRNA-seq seront également abordés ici. Il s’agit notamment d’explorer des méthodes permettant d’éviter la purification sur gel afin d’atténuer les problèmes de dimères d’amorce après l’amplification par PCR et d’augmenter la proportion de lectures sur toute la longueur afin de permettre une cartographie de lecture plus précise. Les améliorations futures d’AQRNA-seq seront axées sur la facilitation de l’automatisation et de la mise en œuvre à haut débit de cette technologie pour quantifier toutes les petites espèces d’ARN dans des échantillons de cellules et de tissus provenant de divers organismes.

Introduction

Le séquençage de nouvelle génération (NGS), également connu sous le nom de séquençage massivement parallèle, est une technologie de séquençage de l’ADN qui implique la fragmentation de l’ADN, la ligature d’oligonucléotides adaptateurs, l’amplification basée sur la réaction en chaîne par polymérase (PCR), le séquençage de l’ADN et le réassemblage des séquences de fragments dans un génome. L’adaptation du NGS à l’ARN séquencé (RNA-seq) est une approche puissante pour identifier et quantifier les transcrits d’ARN et leurs variants¹. Des développements innovants dans les flux de travail de préparation de banques d’ARN et les pipelines d’analyse bio....

Protocole

REMARQUE : La figure 1 fournit une illustration graphique des procédures impliquées dans la préparation de la bibliothèque AQRNA-seq. Des informations détaillées concernant les réactifs, les produits chimiques et les colonnes/kits utilisés dans la procédure se trouvent dans la table des matériaux. Il est recommandé d’effectuer une évaluation complète de la pureté, de l’intégrité et de la quantité des échantillons d’ARN d’entrée à l’aide (i) d’une électrophorèse sur gel d’agarose à 3 %, (ii) d’outils d’électrophorèse automatisés pour le contrôle de la qualité des échantillons de biomolécules (voir le tableau des ma....

Résultats

Mycobacterium bovis La souche 1173P2 du BCG (bacilles de Calmette et Guérin) subissant une croissance exponentielle a été soumise à une série chronologique (0, 4, 10 et 20 jours) de privation en nutriments, suivie d’une réanimation de 6 jours dans un milieu riche en nutriments, comme présenté précédemment dans Hu et ^al.7. De petits ARN ont été isolés à partir d’une culture bactérienne, avec trois réplicats biologiques, à chacun des cinq points temporels désignés. Les banques Illumina ont .......

Discussion

Le flux de travail de préparation de la banque AQRNA-seq est conçu pour maximiser la capture d’ARN dans un échantillon et minimiser la chute de polymérase lors de la transcription inverse⁷. Grâce à une ligature de liaison en deux étapes, de nouveaux oligonucléotides d’ADN (Linker 1 et Linker 2) sont ligaturés en excès pour compléter pleinement l’ARN de l’échantillon. Les agents de liaison en excès peuvent être éliminés efficacement avec RecJf, une exonucléase de 5' à 3' spécifique aux ADN monocaté.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-cétoglutarate  ;	Sigma-Aldrich	75890	Préparez une solution fonctionnelle (1 M) et stockez-la à -20º ; C
2100 Bioanalyseur Instrument	Agilent	G2938C
Adénosine 5'-Triphosphate (ATP)  ;	New England Biolabs	M0437M (composant # : N0437AVIAL)	NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM) ; préparer une solution de travail (10 mM) et la stocker à -20º ; C
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Stocker à température ambiante
d’ammonium, de fer(II) hexahydraté	Sigma-Aldrich	F2262	Préparer une solution de travail (0,25 M) et la conserver à -20 ° ; C
Bioanalyseur de petits ARN	Agilent	5067-1548  ;	L’analyse des petits ARN est utilisée pour vérifier la qualité des ARN d’entrée et l’efficacité des réactions enzymatiques (par exemple, la ligature Linker 1)
Albumine sérique bovine (BSA ; 10 mg/mL)  ;	New England Biolabs	B9000	Ce produit a été abandonné le 15/12/2022 et est remplacé par de l’albumine recombinante, qualité biologie moléculaire (NEB B9200).
Chloroforme  ;	Macron Chimie Fine	4441-10
Déméthylase  ;	ArrayStar	AS-FS-004	La déméthylase est livrée avec le prétraitement de l’ARNt rtStar Kit de synthèse d’ADNc premier brin (AS-FS-004)
Mélange de solutions de désoxynucléotide (dNTP)	New England Biolabs	N0447L (composant # : N0447LVIAL)	Ce mélange de solutions dNTP contient des concentrations équimolaires de dATP, dCTP, dGTP et dTTP (10 mM chacune)
Bloc chauffant double numérique	VWR Scientific Products	13259-052	Le bloc chauffant est utilisé avec le QIAquick  ; Kit d’extraction de gel  ;
DyeEx  ; Kit d’essorage 2.0	Qiagen	63204  ;	Efficace pour éliminer les restes courts (par exemple, les oligos de moins de 10 pb de longueur)
Alimentation par électrophorèse	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf Tubes PCR (0,5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0,5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1,5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Alcool éthylique (éthanol), pur	Sigma-Aldrich	E7023  ;	L’éthanol pur est utilisé avec le kit Oligo Clean and Concentrator de Zymo Research
Système d’imagerie sur gel	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Violet (6X), pas de SDS	New England Biolabs	N0556S (composant # : B7025SVIAL)	NEB N0556S contient une échelle d’ADN Quick-Load Purple 50 bp et un colorant de chargement de gel, Violet (6X), sans SDS
GENESYS 180 Spectrophotomètre UV-Vis	Thermo Fisher Scientific	840-309000	Le spectrophotomètre est utilisé pour mesurer les concentrations d’oligo-éléments à l’aide de la loi de Beer
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Préparez une solution de travail (1 M ; pH = 8 avec NaOH) et conservez-la à -20 ° ; C
Acide chlorhydrique (HCl)  ;	Produits scientifiques VWR	BDH3028	Préparez une solution de travail (5 M) et conservez-la à température ambiante
L’alcool isopropylique (isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	L’isopropanol est utilisé avec le QIAquick  ; Kit d’extraction de gel  ;
Acide L-ascorbique	Sigma-Aldrich	A5960	Préparez une solution de travail (0,5 M) et conservez-la à -20º ; C
Microcentrifugeuse	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotomètre	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (composant # : B7002SVIAL)	NEB M0264L contient RecJf (30 U/&mu ; L) et NEBuffer 2 (10X) ; Conserver à -20 ° ; C
Eau sans nucléases (non traitée au DEPC)	Thermo Fisher Scientific	AM9938  ;
Oligo Clean & Kit de concentrateur  ;	Zymo Research	D4061° ;	Conserver à température ambiante
PEG 8000 (solution à 50 %)  ;	New England Biolabs	M0437M (composant # : B1004SVIAL)	NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM) ; préparer une solution de travail (10 mM) et la stocker à -20º ; C
Thermocycleur Peltier	MJ Research	PTC-200
Phénol :choloroforme :isoamyle  ; alcool 25:24:1 pH = 5,2	Thermo Fisher Scientific	J62336  ;
Tampon PrimeScript (5X)	TaKaRa	2680A  ;
PrimeScript Transcriptase inverse	TaKaRa	2680A  ;
QIAquick  ; Kit d’extraction de gel  ;	Qiagen	28704	Ce kit nécessite un bloc chauffant et de l’isopropanol pour fonctionner avec l’échelle
d’ADN Quick-Load Purple 100 bp	New England Biolabs	N0551S (composant # : N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (composant # : N0556SVIAL)	NEB N0556S contient une échelle d’ADN Quick-Load Purple 50 bp et un colorant de chargement en gel, violet (6X), sans SDS
RecJf  ; (30 U/&mu ; L)  ;	New England Biolabs	M0264L (composant # : M0264LVIAL)	NEB M0264L contient RecJf (30 U/&mu ; L) et NEBuffer 2 (10X) ; Conserver à -20 ° ;
Inhibiteur de la RNase C (souris ; 40 U/&mu ; L)  ;	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	M0314L  ;( composant # : M0314LVIAL)	Stocker à -20 ° ; C
SeqAMP  ; ADN polymérase  ;	TaKaRa	638509  ;	TaKaRa 638509 contient SeqAMP  ; ADN polymérase  ; et SeqAMP  ; Tampon PCR (2X)
SeqAMP  ; Tampon PCR (2X)  ;	TaKaRa	638509  ;	TaKaRa 638509 contient SeqAMP  ; ADN polymérase  ; et SeqAMP  ; Tampon PCR (2X)
Crevette Phosphatase alcaline (1 U/&mu ; L)  ;	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	M0371L  ;( composant # : M0371LVIAL)
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Sigma-Aldrich	; S5881	Préparer une solution de travail (5 M) et la conserver à température ambiante
T4 DNA Ligase (400 U/&mu ; L)  ;	New England Biolabs	M0202L  ;( composant # : M0202LVIAL)	NEB M0202L contient de l’ADN ligase T4 (400 U/&mu ; L) et tampon de réaction de l’ADN ligase T4 (10X)
Tampon de réaction de l’ADN ligase T4 (10X)  ;	New England Biolabs	M0202L  ;( composant # : B0202SVIAL)	NEB M0202L contient de l’ADN ligase T4 (400 U/&mu ; L) et T4 ADN ligase tampon (10X)
T4 ARN ligase 1 (30 U/&mu ; L)  ;	New England Biolabs	M0437M (composant # : M0437MVIAL)	NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM)
Tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X)  ;	New England Biolabs	M0437M (composant # : B0216SVIAL)	NEB M0437M contient de l’ARN ligase T4 1 (30 U/&mu ; L), tampon de réaction de l’ARN ligase T4 (10X), PEG 8000 (1X) et ATP (100 mM)

Sulfate