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Article de méthode

Coloration rouge Picrosirius pour l’évaluation histopathologique semi-quantitative du dépôt de collagène dans des modèles murins de rejet chronique d’allogreffe pulmonaire

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DOI :

10.3791/66395

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21 mars 2025

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1Department of Thoracic Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 2Department of Plastic and Hand Surgery, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 3Department of Thoracic Surgery, Kyoto University Hospital, 4Department of Otolaryngology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

La coloration Picrosirius Red est une méthode semi-quantitative permettant d’évaluer objectivement le dépôt de collagène dans le remodelage fibrotique pulmonaire murin de manière spatialement résolue. Outre l’évaluation du dépôt total de collagène, la coloration rouge Picrosirius permet de différencier les fibres de collagène de différentes épaisseurs.

Résumé

La fibrose est la caractéristique physiopathologique du rejet chronique après une transplantation pulmonaire et le principal obstacle à la survie à long terme du receveur. Plusieurs modèles de transplantation pulmonaire murine sont disponibles pour l’étude du rejet chronique. Cependant, ils présentent des résultats hétérogènes concernant les modifications fibrotiques du greffon, et l’étendue histologique de la fibrose est principalement rapportée qualitativement. Par conséquent, une approche résolue spatialement qui permet une analyse statistique peut aider à évaluer la fibrose dans ces modèles. Cette étude présente la coloration rouge Picrosirius pour une évaluation semi-quantitative de l’organisation du collagène dans les allogreffes pulmonaires murines et la compare à l’hématoxyline et à l’éosine standard, au trichrome de Masson et aux colorants d’Herovici. La coloration a été réalisée sur des coupes de deux modèles de transplantation murine différents sur la base de mésappariements mineurs et majeurs du complexe d’histocompatibilité (CMH). La méthode a été établie pour l’analyse semi-quantitative de l’organisation du collagène dans des coupes pulmonaires entières. Ainsi, il peut servir d’outil pour des modèles expérimentaux murins de maladies pulmonaires fibrotiques.

Introduction

La transplantation pulmonaire est l’option thérapeutique définitive pour les patients souffrant d’une maladie pulmonaire en phase terminale. Cependant, la survie à long terme est entravée par le rejet chronique, affectant 50 % des receveurs au cours des cinq premières années postopératoires1. Le remodelage fibrotique des petites voies respiratoires et du parenchyme pulmonaire est la caractéristique histologique sous-jacente à la perte progressive de la fonction pulmonaire dans le rejet chronique de l’allogreffe pulmonaire2. Expérimentalement, le rejet chronique d’allogreffe pulmonaire peut être modélisé avec une transplantation pulmonaire orthotopique murine entre des souches de souris non appariées par le CMH. Différentes combinaisons de souches ont été proposées pour obtenir le phénotype du rejet chronique3. Parmi eux, la combinaison de greffe du donneur mineur C57BL/10 et du receveur C57BL/6 est fréquemment utilisée4. Alternativement, les poumons de donneurs BALB/c peuvent être transplantés chez des receveurs C57BL/6 recevant un traitement immunosuppresseur quotidien5. Ces modèles entraînent des degrés histologiquement différents de modifications fibrotiques6. Ces changements sont souvent rapportés qualitativement à l’aide de l’hématoxyline et de l’éosine standard, ainsi que de la coloration trichrome de Masson.

La coloration histologique standard à l’hématoxyline et à l’éosine permet d’avoir une vue d’ensemble de l’échantillon car elle colore les noyaux en bleu, tandis que le cytoplasme et les fibres de collagène apparaissent en rouge. Avec la coloration trichrome de Masson, les noyaux sont colorés en noir, les fibres de collagène sont colorées en vert à bleu et le fond, y compris le cytoplasme, la fibrine et les muscles, est rouge. Étant donné que la coloration trichrome de Masson peut conduire à des valeurs sous-estimées, l’utilisation de la coloration rouge Picrosirius est considérée comme bénéfique7. Picrosirius Red est un colorant anionique linéaire qui s’associe à de longues fibres de collagène cationiques et fournit une coloration rouge riche en contraste. De plus, la coloration rouge Picrosirius améliore la biréfringence naturelle des fibres de collagène sous la lumière polarisée croisée8. De cette façon, l’épaisseur et l’emballage de la fibre de collagène peuvent être évalués. À l’aide d’un filtre polarisant, l’arrière-plan s’assombrit et il devient possible de distinguer l’épaisseur du collagène déposé. Alors que les fibres de collagène épaisses apparaissent rouges, les fibres de collagène minces émergent vertes sous polarisation. Une association directe entre la biréfringence et le sous-type de collagène est fréquemment décrite dans la littérature, la biréfringence rouge étant attribuée au collagène I et la biréfringence verte au collagène III9.

Ce protocole décrit l’utilisation de la coloration Picrosirius Red pour évaluer la fibrose dans les allogreffes de poumon murin. En plus de la coloration histologique conventionnelle, il permet une évaluation semi-quantitative du changement fibrotique dans des modèles murins de rejet chronique, fournit un moyen de distinction entre les fibres de collagène épaisses et fines en une seule coloration, est rentable et est facile à réaliser. Cette méthode peut également être appliquée à d’autres modèles expérimentaux murins caractérisés par un remodelage fibrotique du parenchyme pulmonaire.

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Protocole

Tous les protocoles sur les animaux sont conformes aux principes éthiques des 3R pour une recherche animale sans cruauté et ont été approuvés par le comité d’éthique vétérinaire local (Veterinäramt Kanton Zürich, Suisse, numéro d’étude 45/2014). De même, les lecteurs doivent obtenir l’autorisation des institutions compétentes avant d’effectuer toute procédure sur des animaux de laboratoire.

1. Acquisition d’échantillons

  1. Mener des expériences sur des animaux en fonction des besoins individuels et des approbations éthiques respectives. Un seul microchirurgien effectue toutes les interventions chirurgicales sans temps d’ischémie prolongé supplémentaire.
    REMARQUE : Pour une reproduction de nos résultats représentatifs, procurez-vous des souris adultes mâles C57BL/6J, C57BL/10J et BALB/c de 27 à 30 g provenant des Laboratoires Charles River. Pour les isogreffes, utilisez des animaux C57BL/6J comme donneurs et receveurs. Dans le modèle légèrement incompatible, transplantez des poumons de donneurs C57BL/10J à des receveurs C57BL/6J. Dans le modèle principal non apparié, transplanter des poumons de donneur BALB/c à des receveurs C57BL/6J et injecter postopératoirement de la cyclosporine (10 mg/kg/jour) et de la méthylprednisolone (1,6 mg/kg/jour) par voie sous-cutanée tous les jours5. Utilisez une solution saline pour la perfusion et récupérez les poumons après 8 semaines (56 jours).
  2. Pour l’euthanasie, intubez l’animal avec un cathéter de 20G et aérez-le avec de l’O2 complété par 2 à 3 % d’isoflurane. Confirmer une profondeur suffisante de l’anesthésie par l’absence de réponse à un pincement de la patte.
  3. Effectuez une laparosténotomie médiane en incisant la paroi abdominale avec des ciseaux chirurgicaux et en coupant la longueur du sternum pour exposer le cœur. Identifiez la veine cave inférieure et l’appendice auriculaire gauche par leur emplacement anatomique.
  4. En succession rapide, coupez la veine cave inférieure et l’appendice auriculaire gauche avec des ciseaux chirurgicaux et perfuser l’animal avec 3 à 5 ml de NaCl à 0,9 % à travers la racine de l’artère pulmonaire avec une seringue pour éliminer tout le sang de la circulation pulmonaire.
    REMARQUE : L’euthanasie doit être pratiquée conformément à l’approbation éthique respective. D’autres méthodes peuvent également être appliquées. Il est recommandé d’éliminer complètement le sang de la circulation pulmonaire, ce qui peut également être effectué par perfusion après un arrêt circulatoire.
  5. Retirez les poumons perfusés à l’aide de ciseaux.
  6. Pour la conservation, incubez les échantillons dans du formol à 4 %. Injectez la solution de formol directement dans les bronches et le système vasculaire pulmonaire. Immergez les échantillons dans du formol et laissez-les incuber pendant au moins 6 h.
    REMARQUE : Pour le gonflage du poumon avec du formol, une procédure standardisée doit être appliquée pour obtenir des résultats comparables. Des exemples de protocoles pour de telles procédures sont publiés ailleurs10,11.
  7. Taillez l’orgue selon les besoins expérimentaux. Coupez transversalement les poumons en deux pour capturer toutes les parties de l’arbre bronchique en une section.
  8. Transférez les échantillons vers un processeur automatique de tissus pour la déshydratation dans la séquence alcoolique, en les éclaircissant dans un enrobage de xylol et de paraffine comme suit : 70 % d’éthanol, 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 96 % d’éthanol, 100 % d’éthanol (1 h chacun), 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, de xylol (2 h chacun), de xylol (1 h) et de paraffine 3 fois pendant 2 h.
  9. Faites fondre la paraffine et incorporez des échantillons dans le bon sens dans des cassettes d’enrobage de polyoxyméthylène. Prenez soin d’encastrer les échantillons avec la surface coupée vers le bas. À l’aide d’un microtome rotatif, coupez des sections de 5 μm consécutives. Laissez sécher les lames pendant 24 h à 37 °C avant de poursuivre le traitement.

2. Déparaffinisation et hydratation des lames de paraffine

  1. Retirez la paraffine en incubant les échantillons 2x dans du xylol à 100 % pendant 5 min chacun.
    ATTENTION : Le xylol est inflammable et dangereux pour la santé. Utiliser uniquement sous la hotte.
  2. Hydratez les échantillons dans 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 70 % d’éthanol et 50 % d’éthanol pendant 2 minutes chacun. Ensuite, laver pendant 2 min dans de l’eau distillée.

3. Coloration au rouge Picrosirius

  1. Tache en lames pendant 8 min dans la solution d’hémalum de Meyer. Lavez les lames pendant 10 minutes sous l’eau courante du robinet.
  2. Incuber les lames pendant 1 h dans la solution Picrosirius Red. Pour une solution de Picrosirius Red, utilisez soit une solution de coloration prémélangée, soit utilisez 0,1 % de Direct Red 80 ou de Sirius Red F 3B (CI 35780) dilué dans de l’acide picrique saturé.
    ATTENTION : L’acide picrique est inflammable et hautement explosif et doit être traité avec soin.
    REMARQUE : Il existe de nombreux fournisseurs différents pour les kits de coloration Picrosirius Red disponibles, comme indiqué dans le tableau des matériaux. Soyez conscient des différences de prix et de méthodes de coloration, et respectez toujours les instructions des fournisseurs. Il est recommandé de n’utiliser que des kits de coloration avec l’indice de couleur spécifique pour Sirius Red F 3B (CI 35780).
  3. Trempez les lames 5x-10x dans une solution d’acide acétique (0,5 %). Secouez doucement les lames pour retirer physiquement la solution.
  4. Déshydratez les lames dans 95 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 100 % de xylol et 100 % de xylol pendant 5 minutes chacune.
  5. Intégrez en ajoutant une goutte de support de montage sur chaque échantillon et recouvrez d’une lamelle. Laissez sécher les lames sous une hotte.

4. Numérisation et traitement de l’image

  1. Focalisez les échantillons au microscope optique avec un logiciel d’imagerie approprié jusqu’à ce que l’image devienne claire et nette. Ajoutez un filtre polarisant et ajustez le degré de polarisation jusqu’à ce que l’arrière-plan soit complètement sombre ou noir. Lorsque l’arrière-plan est aussi sombre que possible, la polarisation correcte est obtenue.
    REMARQUE : Il est également possible de visualiser la coloration Picrosirius Red avec une lumière transmise conventionnelle et sans filtre polarisant. À cette fin, il est recommandé d’utiliser Sirius Red avec Fast Green, car il s’est avéré plus sensible que Sirius Red seul 12,13. Cependant, la microscopie polarisante est nécessaire pour distinguer les fibres de collagène épaisses et fines.
  2. Numérisez tous les échantillons complètement sous un grossissement de 20x et exportez-les comme .tiff. Transfert vers le logiciel Fidji14. Assurez-vous de bien nettoyer les lames à l’avance et d’utiliser des paramètres normalisés concernant le temps d’exposition et l’intensité de la source lumineuse.
  3. Entourez l’échantillon manuellement et découpez-le dans le logiciel à l’aide de Modifier > Effacer l’extérieur. Mesurez la surface totale en cliquant sur Analyser > Mesurer.
    REMARQUE : La sélection du compartiment à mesurer est une étape critique dans la création de résultats fiables et comparables. En numérisant et en sélectionnant l’ensemble de l’échantillon, une bonne section transversale est affichée et les tissus hétérogènes sont considérés comme un tout. Cependant, il est également possible de se limiter à des zones spécifiques des échantillons, telles que la plèvre ou les bronches individuelles. Gardez à l’esprit de toujours sélectionner les compartiments à comparer de manière standardisée. Si les échantillons présentent une grande variabilité de la ventilation, il est conseillé d’exclure la zone de l’espace aérien du compartiment analysé15.
  4. Mesurez la teneur totale en collagène par échantillon à l’aide du seuil de couleur en cliquant sur Image > Ajuster > seuil de couleur et ajustez les paramètres en cliquant sur Analyser > Analyser les particules. Définir la taille = 1 - Infini, Effacer, Résumer. Luminosité = 35 - 255. Teinte = 2 - 130
    REMARQUE : Un réglage raisonnable des seuils de couleur est essentiel pour obtenir des résultats fiables.
  5. Répétez l’opération pour les fibres de collagène épaisses et fines en ajustant la teinte comme les fibres de collagène épaisses rouges figure-protocol-1 (teinte 2-30) et les fibres de collagène minces jaune-vert figure-protocol-2 (teinte 31-130). Le résultat sera la zone des pixels tachés.
  6. Configurez la macro pour le traitement automatisé en cliquant sur Plug-ins > Macros > Enregistrer et répéter l’opération avec tous les échantillons.
  7. Pour obtenir des valeurs finales normalisées en fonction de la surface de la section efficace, divisez la surface des pixels colorés pour tous les paramètres par la surface totale mesurée aux étapes 4.3 et 4.5 pour chaque échantillon, respectivement.

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Résultats

Le protocole décrit ci-dessus permet une évaluation semi-quantitative objective du dépôt de collagène dans le tissu pulmonaire murin. Le remodelage fibrotique est la marque physiopathologique du rejet chronique après une transplantation pulmonaire. Par conséquent, la coloration Picrosirius Red a été appliquée dans des modèles de rejet d’allogreffe pulmonaire chronique à l’aide d’une transplantation pulmonaire orthotopique murine gauche. La transplantation pulmonaire majeure non compatible avec le CMH d’un donneur BALB/c ...

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Discussion

Les méthodes histologiques standard telles que l’hématoxyline et l’éosine, ainsi que la coloration trichrome de Masson sont largement utilisées pour détecter les changements fibrotiques dans les poumons murins de manière résolue spatialement16,19. Cependant, des méthodes supplémentaires sont souvent nécessaires pour quantifier ces changements et évaluer la composition en collagène des tissus.

La colora...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Birte Ohm est soutenue par le programme Berta-Ottenstein pour les cliniciens-chercheurs de la Faculté de médecine de l’Université de Fribourg. Steffen U Eisenhardt est professeur Heisenberg à la Fondation allemande pour la recherche (DFG) et a soutenu ce travail avec des subventions personnelles. De plus, nous tenons à remercier Sheena Kreuzaler pour son assistance technique. La figure 1 a été créée avec l’aide de Biorender.com. L’imagerie a été réalisée dans la plateforme Lighthouse, financée en partie par la faculté de médecine de l’Université de Fribourg (numéros de projet 2023/A2-Fol ; 2021/B3-Fol), le DKTK et la DFG (numéro de projet 450392965).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Acide acétiqueHoneywell, Charlotte, États-Unis33209
Axio ObserverZeiss, Oberkochen, Allemagne4633000956 (numéro de série)
Lamelle 1.5Roth, Karlsruhe, AllemagneKCY5.1
Formaldéhyde 37 %Fisher Scientific, Leicestershire, Royaume-UniF/1501/PB15
Solution d’hémalum de MeyerMerck, Darmstadt, Allemagne109249
Picrosirius Red SolutionMorphisto, Offenbach am Main, Allemagne13422alternatives pouvant être utilisées : ab150681, abcam, Cambridge, Royaume-Uni ; SRS250 ScyTek Laboratories, Logan City US
Filtre polarisantZeiss, Oberkochen, Allemagne000000-1121-813
Microtome rotatif, HistoCore AUTOCUTLeica, Wetzlar, Allemagne149AUTO00C1, 14051956472
ROTI Histokitt support de montageRoth, Karlsruhe, Allemagne6638.1
ROTI Plast ParaffinRoth, Karlsruhe, Allemagne6642.5
Cassettes d’enrobage Rotilabo, POMRoth, Karlsruhe, AllemagneK113.1
Superfrost Plus Microscope à adhérenceepredia de lames, Portsmouth, Royaume-UniJ1800AMNZ
Tissue Processor  ;Leica, Wetzlar, AllemagneTP 1020
Software
Fiji software version 2.14.0/1.54fSource
Imaging Software ZEN 3.4.91Zeiss, Oberkochen, Allemagne
Open

Références

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