Analyses des infections des cellules épithéliales avec Shigella

Résumé

Le présent protocole décrit des tests d’infection pour interroger l’adhérence, l’invasion et la réplication intracellulaire de Shigella à l’aide de lignées cellulaires épithéliales in vitro .

Résumé

L’agent pathogène bactérien entérique adapté à l’homme, Shigella , provoque des millions d’infections chaque année, crée des effets de croissance à long terme chez les patients pédiatriques et est l’une des principales causes de décès dus à la diarrhée dans le monde. L’infection induit une diarrhée aqueuse ou sanglante en raison du passage de l’agent pathogène dans le tractus gastro-intestinal et de l’infection des cellules épithéliales tapissant le côlon. Avec l’augmentation stupéfiante de la résistance aux antibiotiques et le manque actuel de vaccins approuvés, des protocoles de recherche standardisés sont essentiels pour étudier ce formidable agent pathogène. Ici, des méthodologies sont présentées pour examiner la pathogenèse moléculaire de Shigella à l’aide d’analyses in vitro de l’adhérence, de l’invasion et de la réplication intracellulaire bactériennes dans les cellules épithéliales du côlon. Avant les analyses d’infection, le phénotype de virulence des colonies de Shigella a été vérifié par l’absorption du colorant rouge du Congo sur des plaques de gélose. Des milieux de laboratoire supplémentés peuvent également être envisagés pendant la culture bactérienne pour imiter les conditions in vivo . Les cellules bactériennes sont ensuite utilisées dans un protocole standardisé pour infecter les cellules épithéliales du côlon dans des plaques de culture tissulaire à une multiplicité d’infection établie avec des adaptations pour analyser chaque stade de l’infection. Pour les tests d’observance, les cellules de Shigella sont incubées avec des niveaux de milieu réduits pour favoriser le contact bactérien avec les cellules épithéliales. Pour les essais d’invasion et de réplication intracellulaire, la gentamicine est appliquée à différents intervalles de temps pour éliminer les bactéries extracellulaires et permettre l’évaluation de l’invasion et/ou la quantification des taux de réplication intracellulaire. Tous les protocoles d’infection dénombrent les bactéries adhérentes, envahies et/ou intracellulaires en diluant en série les lysats de cellules épithéliales infectées et en plaquant les unités formant des colonies bactériennes par rapport aux titres infectieux sur des plaques de gélose rouge du Congo. Ensemble, ces protocoles permettent une caractérisation et des comparaisons indépendantes pour chaque stade de l’infection à Shigella des cellules épithéliales afin d’étudier avec succès cet agent pathogène.

Introduction

Les maladies diarrhéiques causées par des bactéries pathogènes entériques constituent un fardeau important pour la santé mondiale. En 2016, les maladies diarrhéiques étaient responsables de 1,3 million de décès dans le monde et étaient la quatrième cause de décès chez les enfants de moins de cinq ans ^1,2. Shigella, un pathogène bactérien entérique à Gram négatif, est l’agent causal de la shigellose, une cause majeure de décès diarrhéiques dans le monde³. La shigellose provoque une morbidité et une mortalité importantes chaque année chez les enfants des pays à revenu faible et intermédiaire ^4,5, tandis que les infections dans les pays à revenu élevé sont liées aux épidémies d’origine alimentaire et hydrique dans les garderies ^6,7,8,9. L’inefficacité de la mise au point^{de vaccins 10} et l’augmentation des taux de résistance aux antimicrobiens (RAM)^11,12 ont compliqué la gestion des épidémies de Shigella à grande échelle. Des données récentes des Centers for Disease Control and Prevention montrent que près de 46 % des infections à Shigella aux États-Unis présentaient une résistance aux médicaments en 2020^13,14, tandis que l’Organisation mondiale de la santé a déclaré Shigella comme un agent pathogène prioritaire contre la résistance aux antimicrobiens pour lequel de nouvelles thérapies sont nécessaires de toute urgence¹⁵.

Les infections à Shigella se transmettent facilement par voie fécale-orale lors de l’ingestion d’aliments ou d’eau contaminés, ou par contact humain direct. Shigella a évolué pour devenir un agent pathogène efficace et adapté à l’homme, avec une dose infectieuse de 10 à 100 bactéries suffisante pour provoquer une maladie¹⁶. Pendant le transit de l’intestin grêle, Shigella est exposée à des signaux environnementaux, tels qu’une température élevée et la bile¹⁷. La détection de ces signaux induit des changements transcriptionnels pour exprimer des facteurs de virulence qui améliorent la capacité de la bactérie à infecter le côlon humain 17,18,19. Shigella n’envahit pas l’épithélium colique à partir de la surface apicale, mais transite plutôt à travers la couche épithéliale après absorption dans des cellules microfold (cellules M) spécialisées présentant des antigènes dans l’épithélium associé au follicule 20,21,22. Après la transcytose, les cellules de Shigella sont phagocytées par les macrophages résidents. Shigella s’échappe rapidement du phagosome et déclenche la mort des cellules macrophages, entraînant la libération de cytokines pro-inflammatoires ^5,23,24. Shigella envahit ensuite les cellules épithéliales du côlon par le côté basolatéral, lyse la vacuole macropinocytaire et établit une niche réplicative dans le cytoplasme ^5,25. Les cytokines pro-inflammatoires, en particulier l’interleukine-8 (IL-8), recrutent des leucocytes polynucléaires neutrophiles (PMN) sur le site de l’infection, ce qui affaiblit les jonctions épithéliales serrées et permet l’infiltration bactérienne de la muqueuse épithéliale pour exacerber l’infection basolatérale⁵. Les NMP détruisent la muqueuse épithéliale infectée pour contenir l’infection, ce qui entraîne les symptômes caractéristiques de la dysenterie bacillaire (sanglante)⁵. Bien que les mécanismes d’invasion et de réplication intracellulaire aient été caractérisés de manière approfondie, de nouvelles recherches démontrent de nouveaux concepts importants dans l’infection à Shigella, notamment la régulation de la virulence pendant le transit gastro-intestinal (GI)¹⁷, l’observance¹⁹, l’amélioration de l’accès basolatéral grâce à la perméabilité de la barrière²⁶ et le portage asymptomatique chez les enfants malnutris²⁷.

La capacité de Shigella spp. à provoquer des maladies diarrhéiques est limitée aux humains et aux primates non humains (PNH)²⁸. Des modèles d’infection intestinale à Shigella ont été développés pour le poisson-zèbre²⁹, les souris³⁰, les cochons d’Inde³¹, les lapins 21,32,33 et les porcs ^34,35. Cependant, aucun de ces systèmes modèles ne peut reproduire avec précision les caractéristiques de la maladie observées lors de l’infection humaine³⁶. Bien que des modèles de shigellose aient été établis pour étudier la pathogenèse de Shigella, ces systèmes modèles sont coûteux à mettre en œuvre et nécessitent des doses infectieuses artificiellement élevées, jusqu’à neuf ordres de grandeur supérieures à la dose infectieuse des humains 37,38,39,40,41,42. Ainsi, l’adaptation remarquable de Shigella à l’infection d’hôtes humains nécessite l’utilisation de cultures cellulaires d’origine humaine pour recréer des modèles physiologiquement pertinents pour une interrogation précise de la pathogenèse de Shigella.

Ici, des procédures détaillées sont décrites pour mesurer les taux d’adhérence, d’invasion et de réplication de Shigella dans les cellules épithéliales du côlon HT-29. Grâce à ces protocoles standardisés, les mécanismes moléculaires par lesquels les gènes de virulence bactérienne et les signaux environnementaux ont un impact sur chaque étape de l’infection à Shigella peuvent être interrogés pour mieux comprendre la relation dynamique hôte-pathogène.

Protocole

1. Préparation des réactifs et des matériaux

REMARQUE : Tous les volumes sont cohérents avec un test utilisant deux plaques à 6 puits.

1. Milieu TSB : Ajouter 0,5 L d’eau désionisée (DI) à 15 g de milieu de bouillon de soja tryptique (TSB, voir le tableau des matières) et autoclave. Conserver à température ambiante.
2. Milieu de sels biliaires (BST + BS) : Pour préparer du BST contenant 0,4 % (p/v) de sels biliaires, remettre en suspension 0,06 g de sels biliaires (BS, voir le tableau des matières) dans 15 mL de BSB autoclave. Stériliser le filtre à l’aide d’un filtre PES de 0,22 μm.
   REMARQUE : Les sels biliaires sont constitués d’un mélange 1:1 de cholate de sodium et de désoxycholate de sodium. Préparez des supports frais immédiatement avant utilisation.
3. DMEM + 10 % (v/v) FBS : Ajouter 5 mL de sérum fœtal bovin (FBS) à 45 mL de milieu modifié Eagle de Dulbecco (DMEM). Conserver à 4 °C.
4. DMEM + gentamicine : Dans un tube de 50 mL, ajouter 50 mL de DMEM et 50 μL de gentamicine à 50 mg/mL (voir la table des matières).
   REMARQUE : Faire de l’aliquote fraîche et réchauffer au bain-marie à 37 °C avant chaque expérience.
5. PBS + 1 % (v/v) Triton X-100 : Ajouter 150 μL de Triton X-100 à 15 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
   REMARQUE : Faire de l’aliquote fraîche et réchauffer au bain-marie à 37 °C avant chaque expérience.
6. TSB + plaques indicatrices rouge Congo : Ajouter 15 g de TSB, 7,5 g de gélose sélectionnée et 0,125 g de colorant rouge Congo (voir tableau des matériaux) dans une bouteille de 1 L. Ajouter 0,5 L d’eau DI et autoclave. Verser 10 à 20 ml de milieu dans des boîtes de Pétri stériles individuelles (100 mm x 15 mm) et laisser se solidifier.
   ATTENTION : Le rouge Congo est cancérigène et une toxine pour la reproduction. S’assurer que la manipulation du Congo rouge est effectuée à l’aide de l’équipement de protection individuelle approprié. Consultez la fiche de données de sécurité du produit pour plus d’informations.
   REMARQUE : Environ 20 plaques sont fabriquées à partir de 0,5 L de support rouge Congo. Les assiettes peuvent être préparées 2 à 3 jours à l’avance et laissées à température ambiante jusqu’à utilisation. Pour un stockage à long terme, placez les plaques inversées dans des manchons en plastique à 4 °C jusqu’à 3 mois.
7. DMEM + 10 % (v/v) de FBS et 5 % (v/v) de diméthylsulfoxyde (DMSO) : Ajouter 42,5 mL de DMEM, 5 mL de FBS et 2,5 mL de DMSO dans un tube de 50 mL. Conserver à 4 °C.

2. Préparation des bactéries

REMARQUE : Tous les protocoles de culture et de stockage en laboratoire de Shigella sont adaptés de Payne, S. ^M.43.

ATTENTION : Shigella spp. sont des agents pathogènes du groupe de risque 2⁴⁴. Effectuer tous les travaux de laboratoire dans un environnement BSL-2, avec des mesures de sécurité supplémentaires prises pour limiter les expositions accidentelles dues à la faible dose infectieuse de Shigella spp.

1. Croissance de Shigella à partir d’actions congelées
   1. Transférez une petite quantité de culture congelée du flacon cryogénique dans une plaque de gélose rouge TSB + Congo à l’aide d’un applicateur stérile.
   2. Stérilisez à la flamme une boucle d’inoculation et laissez-la refroidir. Striez l’inoculum d’avant en arrière sur un quadrant de la plaque. Flammez la boucle, laissez-la refroidir, puis passez du premier quadrant au deuxième quadrant de la plaque. Répéter l’opération pour faire des stries d’inoculum dans les troisième et quatrième quadrants de la plaque.
      REMARQUE : Vous pouvez également faire des stries sur l’inoculum à l’aide d’un applicateur stérile frais entre chaque quadrant.
   3. Retournez la plaque et incubez à 37 °C pendant la nuit.
      NOTE : L’incubation à des températures ≥37 °C est nécessaire pour l’expression des facteurs de virulence de Shigella nécessaires à l’observation du phénotype⁴⁵ Congo rouge positif (CR⁺). Les colonies avirulentes auront un aspect blanc et ne seront pas envahissantes.
   4. Fermez la plaque avec un film de paraffine et conservez-la au réfrigérateur à 4 °C.
      REMARQUE : Les colonies bactériennes resteront viables sur des plaques de gélose pendant 1 à 2 semaines.
2. Croissance nocturne de Shigella en culture liquide
   1. Aliquote 3 mL de milieu TSB dans des tubes de culture stériles de 14 mL.
   2. Prélever une seule colonie rouge (CR+) bien isolée à l’aide d’un applicateur stérile et la remettre en suspension dans un milieu liquide.
   3. Incuber les cultures pendant la nuit (16-18 h) à 37 °C en agitant à 250 rotations par minute (tr/min).

3. Préparation des cellules eucaryotes HT-29

REMARQUE : Tous les volumes sont cohérents avec un test utilisant deux plaques à 6 puits. Les lignées cellulaires HT-29 ont été acquises à partir de l’American Type Culture Collection (ATCC). Les protocoles d’entretien HT-29 sont adaptés des recommandations⁴⁶ de l’ATCC. Tous les milieux doivent être préchauffés au bain-marie à 37 °C avant utilisation. Tous les protocoles d’entretien du HT-29 doivent être effectués dans une enceinte de biosécurité. Évitez de produire des bulles lorsque vous mélangez ou travaillez avec des cellules HT-29 dans un milieu pour éviter des changements spectaculaires du pH.

1. Décongélation des cellules HT-29 du stock congelé
   1. Décongeler le flacon de cellules HT-29 dans un bain-marie à 37 °C.
      REMARQUE : Assurez-vous que le capuchon reste complètement au-dessus de l’eau pour éviter toute contamination. La décongélation devrait prendre moins de 2 minutes.
   2. Retirez le flacon de l’eau immédiatement après la décongélation complète de la culture et décontaminez-le avec de l’éthanol à 70 %. Assurez-vous que toutes les étapes à partir de ce point sont effectuées à l’aide de techniques aseptiques.
   3. Ajouter tout le contenu du flacon dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 9 mL de DMEM + 10 % de FBS. Centrifuger à 125 x g pendant 5 min à température ambiante.
   4. Décanter le surnageant dans un conteneur à déchets et remettre le granulé en suspension dans 10 mL de DMEM chaud + 10 % FBS. Transférer les cellules remises en suspension dans une fiole de culture tissulaire de^{75 cm 2} (T75) contenant 10 mL de DMEM chaud + 10 % de FBS (volume total de 20 mL).
   5. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules atteignent 90 % de confluence (environ 6 à 7 jours).
      REMARQUE : La confluence est estimée par approximation visuelle.
2. Ensemencement de cellules HT-29
   1. Préchauffer 20 mL de PBS et 50 mL de DMEM + 10 % FBS dans un bain-marie à 37 °C et préchauffer 3 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % (p/v) à température ambiante.
   2. Une fois que les cellules HT-29 (de l’étape 3.1) atteignent 90 % de confluence, décantez les milieux de culture cellulaire HT-29 du ballon T75 dans un conteneur à déchets. Verser ~10 ml de PBS chaud dans la fiole et agiter doucement pour laver. Décanter le PBS dans un conteneur à déchets. Laver à nouveau avec du PBS chaud et décanter.
   3. Ajouter 2 à 3 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % (p/v) et agiter doucement sur toute la surface. Incuber à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 4 min.
   4. Retirez le flacon de l’incubateur et faites tourner doucement la trypsine-EDTA, en vous assurant visuellement que toutes les cellules se détachent de la surface.
   5. Ajouter immédiatement 6 mL de DMEM chaud + 10 % FBS pour désactiver la trypsine. Pipeter de haut en bas pour bien mélanger.
   6. Transférez tout le contenu dans un tube à centrifuger de 15 mL et faites-le tourner à 500 x g pendant 5 min à température ambiante.
   7. Décanter délicatement le surnageant dans un conteneur à déchets et remettre le granulé en suspension dans 6 mL de DMEM chaud + 10 % FBS.
   8. Immédiatement après la remise en suspension, transférer 10 μL de cellules HT-29 en suspension du milieu de la culture dans un tube PCR de 0,2 mL. Ajouter 10 μL de colorant bleu trypan dans le tube PCR et mélanger.
   9. Ajouter 10 μL de mélange de cellules HT-29/bleu de trypan à une lame de chambre de comptoir de cellules Countess jetable (voir le tableau des matériaux). Énumérer le nombre de cellules vivantes et calculer la viabilité des cellules.
      REMARQUE : Lorsque vous documentez le nombre de cellules dans l’échantillon, lisez le nombre sous le nombre de cellules « vivantes », et non le nombre total de cellules. Alternativement, le dénombrement cellulaire peut être effectué manuellement à l’aide d’un hémocytomètre.
   10. Grainez les cellules HT-29 remises en suspension dans un nouveau ballon T75 ou une plaque à 6 puits.
       1. Pour la fiole T75 :
          1. Pipeter doucement pour mélanger, puis transférer 2,5 x 10⁶ cellules dans une fiole T75 fraîche selon l’équation ci-dessous :
             
          2. Ajouter un milieu DMEM chaud + 10 % de FBS à un volume final de 20 mL (concentration finale de 1,25 x 10⁵ cellules/mL).
          3. Répartissez les cellules uniformément dans le flacon en les balançant doucement d’avant en arrière.
          4. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % de confluence.
             REMARQUE : Pour une croissance optimale, remplacez le milieu DMEM + 10 % FBS dans le flacon T75 tous les ~3 jours. Décanter le milieu dans un récipient à déchets et ajouter 10 ml de PBS chaud dans le flacon. Faites tourner doucement le PBS et décantez-le dans le conteneur à déchets. Ajouter ensuite 20 mL de DMEM frais et tiède + 10 % FBS dans le ballon et remettre dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO₂ .
       2. Pour une plaque à 6 puits :
          1. Pipeter doucement pour mélanger, puis transférer 5,85 x 10⁶ cellules dans un tube conique frais de 50 mL selon l’équation ci-dessous :
             
          2. Ajouter du DMEM chaud + 10 % de FBS dans un volume final de 26 mL (concentration finale de 2,25 x 10⁵ cellules/mL).
          3. Pipeter doucement pour mélanger, puis distribuer 2 ml (4,5 x 10⁵ cellules) dans des puits individuels de plaques à 6 puits.
          4. Dispersez les cellules uniformément dans le puits en les balançant doucement vers le haut/bas et vers la gauche/droite 2 à 3 fois.
          5. Incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % à 95 % de confluence (environ 3 à 4 jours).
             REMARQUE : Une confluence de 85 % est recommandée pour les tests d’invasion et de réplication intracellulaire, tandis qu’une confluence de 90 % à 95 % est recommandée pour les tests d’observance. Les cellules devraient atteindre ~85 % de confluence après 48 h d’incubation avec une concentration finale d’environ 1 x 10⁶ cellules/puits. Il peut être nécessaire d’ajuster le nombre de cellules ensemencées et la durée de l’incubation.
3. Fabrication de stocks HT-29 congelés
   1. Aliquote 1 mL de DMEM + 10 % FBS + 5 % de DMSO dans des flacons cryogéniques individuels.
   2. Ajouter 1 x 10⁶ cellules HT-29 de l’étape 3.2.7 à chaque flacon. Calculez le volume des cellules selon la formule ci-dessous :
      
   3. Stockez les cellules HT-29 à long terme en dessous de -130 °C dans un congélateur à vapeur d’azote liquide.

4. Test d’observance

REMARQUE : Tous les volumes sont cohérents avec un test utilisant deux plaques à 6 puits.

1. Sous-culture pendant la nuit Cultures de Shigella par dilution 1:50 dans un milieu frais.
   1. Vortex, puis ajouter 100 μL de chaque culture de nuit à 5 mL de TSB ou TSB + BS frais dans un tube de culture de taille appropriée.
      REMARQUE : Limitez le volume de culture à <20 % du volume du ballon ou du tube de culture pour assurer une bonne aération.
   2. Incuber à 37 °C en agitant à 250 tr/min jusqu’à ce que les cellules atteignent une densité optique (OD₆₀₀) de 0,7 (phase mi-log de la croissance de Shigella ) ; environ 2-2,5 h.
      REMARQUE : Au cours de la sous-culture, aliquoter 50 mL de DMEM et un volume suffisant de PBS pour toutes les étapes de lavage et placer dans un bain-marie à 37 °C. Laissez le support atteindre 37 °C avant utilisation.
2. Transférer 2 x 10⁸ unités formant colonies (UFC) Shigella sous-cultivées dans des tubes de microcentrifugation individuels de 2 mL.
   REMARQUE : 2 x 10⁸ UFC correspondent à environ 1 mL de cellules bactériennes à une DO₆₀₀ de 0,7. Utilisez des lectures OD₆₀₀ pour approximer la CFU/mL en fonction de l’étalonnage de chaque spectrophotomètre individuel.
3. Lavez chaque échantillon de Shigella 2x avec du PBS.
   1. Cellules à granulés par centrifugation à 17 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, puis ajouter 1 mL de PBS chaud et bien remettre la pastille en suspension, en pipetant doucement l’échantillon de haut en bas jusqu’à ce que le mélange soit complètement homogène (8-10x).
   2. Répétez l’étape 4.3.1 1x fois plus longtemps.
   3. Centrifuger les granulés à 17 000 x g pendant 2 min à température ambiante, aspirer le surnageant et remettre les granulés en suspension dans 2 mL de DMEM chaud.
      REMARQUE : La concentration finale de bactéries remises en suspension sera de 1 x 10⁸ UFC/mL.
4. Vortex, puis ajouter 1 mL (1 x 10⁸ UFC) de Shigella remise en suspension dans chaque puits des monocouches épithéliales du côlon HT-29 préparées en plaques à 6 puits (à partir de l’étape 3.2.10.2).
   REMARQUE : Les infections sont normalement réalisées à une multiplicité d’infection (MOI ; rapport entre les cellules bactériennes et épithéliales) de 100. Pour tester différents MOI, diluez Shigella en suspension dans du DMEM chaud à la concentration désirée, puis ajoutez 1 mL de bactéries diluées aux monocouches HT-29. Par exemple, pour tester un MOI de 10, diluez les bactéries 1:10 en ajoutant 150 μL de 1 x 10⁸ UFC/mL de bactéries à 1,35 mL de DMEM chaud, puis appliquez 1 mL (1 x 10⁷ UFC) sur les cellules HT-29.
5. Incuber les plaques à 6 puits à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 3 h.
6. Pendant l’incubation, déterminer le titre d’infection bactérienne.
   1. Préparer des dilutions en série de 10 fois de cellules Shigella remises en suspension (à partir de l’étape 4.3.3) dans du PBS.
   2. Déposer 100 μL des dilutions 1 x ^10-5 et 1 x ^10-6 sur des plaques TSB + rouge Congo et incuber toute la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : Le placage de 100 μL à partir des dilutions 1 x ^10-5 et 1 x ^10-6 correspond à un facteur de dilution final de 1 x ^10-6 et 1 x ^10-7, respectivement.
7. Après l’incubation, lavez les monocouches 4 à 5 fois avec du PBS.
   1. Aspirer le milieu de chaque puits.
      REMARQUE : Lors de l’aspiration de fluides à partir de plaques à 6 puits, guidez la pointe de l’aspirateur le long de la face inférieure des puits, en essayant d’éviter tout contact avec les cellules HT-29.
   2. Ajouter 1 ml de PBS chaud dans chaque puits et laver délicatement.
      REMARQUE : Pour laver délicatement les monocouches à 6 puits avec du PBS, déplacez la plaque de haut en bas et d’un côté à l’autre sur la paillasse. Le lavage des plaques dans un mouvement circulaire et/ou le retrait de la plaque de la surface de la paillasse peuvent entraîner l’élimination mécanique des cellules du plastique.
   3. Répétez les étapes 4.7.1 et 4.7.2 4 fois de plus.
8. Éliminer le PBS par aspiration et lyser les cellules HT-29 en ajoutant 1 mL de PBS + 1 % de Triton X-100 dans chaque puits.
9. Incuber des plaques de 6 puits à 37 °C pendant 5 min.
10. À l’aide d’un grattoir cellulaire ou d’une pointe de pipette courbée, grattez les cellules lysées du fond du puits et transférez la totalité de 1 ml dans un tube de microcentrifugation frais de 1,7 ml.
11. Déterminez le nombre de bactéries associées aux cellules.
    1. Agiter chaque tube (à partir de l’étape 4.10) pendant au moins 30 s pour déplacer davantage Shigella des cellules eucaryotes lysées.
    2. Préparez des dilutions en série de 10 fois de lysats dans du PBS.
    3. Déposer 100 μL des dilutions 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 et 1 x ^10-4 sur des plaques TSB + rouge Congo et incuber toute la nuit à 37 °C.
       REMARQUE : Le placage de 100 μL à partir des dilutions 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 et 1 x ^10-4 correspond à un facteur de dilution final de 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 et 1 x ^10-5, respectivement.

5. Essai d’invasion

REMARQUE : Tous les volumes sont cohérents avec un test utilisant deux plaques à 6 puits.

1. Sous-culture pendant la nuit Cultures de Shigella par dilution 1:50 dans un milieu frais.
   1. Vortex, puis ajouter 100 μL de chaque culture de nuit à 5 mL de TSB ou TSB + BS frais dans un tube de culture de taille appropriée.
      REMARQUE : Limitez le volume de culture à <20 % du volume du ballon ou du tube de culture pour assurer une bonne aération.
   2. Incuber à 37 °C en agitant à 250 tr/min jusqu’à ce que les cellules atteignent une OD₆₀₀ de 0,7 (phase mi-log de croissance de Shigella ) ; environ 2-2,5 h.
      REMARQUE : Au cours de la sous-culture, aliquoter 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicine et un volume suffisant de PBS pour toutes les étapes de lavage et placer dans un bain-marie à 37 °C. Laissez le support atteindre 37 °C avant utilisation.
2. Transférer 2 x 10⁸ UFC de Shigella sous-cultivée dans des tubes à microcentrifuger individuels de 2 ml.
   REMARQUE : 2 x 10⁸ UFC correspondent à environ 1 mL de cellules bactériennes à une DO₆₀₀ de 0,7. Utilisez des lectures OD₆₀₀ pour approximer la CFU/mL en fonction de l’étalonnage de chaque spectrophotomètre individuel.
3. Lavez les échantillons de Shigella 1x avec PBS.
   1. Cellules à granulés par centrifugation à 17 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, puis ajouter 1 mL de PBS chaud et bien remettre la pastille en suspension, en pipetant doucement l’échantillon de haut en bas jusqu’à ce que le mélange soit complètement homogène (8-10x).
   2. Répétez l’étape 5.3.1. 1x temps supplémentaire.
   3. Centrifuger les granulés à 17 000 x g pendant 2 min à température ambiante, aspirer le surnageant et remettre les granulés en suspension dans 2 mL de DMEM chaud.
      REMARQUE : La concentration finale de bactéries remises en suspension sera de 1 x 10⁸ UFC/mL.
4. Vortex, puis ajouter 1 mL (1 x 10⁸ UFC) de Shigella remis en suspension plus 1 mL de DMEM dans chaque puits des monocouches épithéliales du côlon HT-29 préparées dans des plaques à 6 puits (à partir de l’étape 3.2.10.2).
   REMARQUE : Les infections sont normalement réalisées à une multiplicité d’infection (MOI ; rapport entre les cellules bactériennes et épithéliales) de 100. Pour tester différentes MOI, diluez Shigella en suspension dans du DMEM à la concentration désirée, puis ajoutez 1 mL de bactéries diluées aux monocouches HT-29. Par exemple, pour tester un moment d’inertie de 10, diluez les bactéries 1:10 en ajoutant 150 μL de 1 x 10⁸ UFC/mL de bactéries à 1,35 mL de DMEM, puis ajoutez 1 mL (1 x 10⁷ UFC) aux cellules HT-29.
5. Pour favoriser le contact bactérien avec les cellules HT-29, centrifuger les plaques à 6 puits à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante ou 37 °C si le réglage de la température peut être ajusté.
   REMARQUE : La centrifugation favorise le contact bactérien avec les cellules HT-29, ce qui contourne le besoin de facteurs d’adhérence et permet aux bactéries d’envahir rapidement les cellules.
6. Incuber des plaques de 6 puits à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 45 min.
7. Pendant l’incubation, déterminer le titre d’infection bactérienne.
   1. Préparer des dilutions en série de 10 fois de cellules Shigella remises en suspension (à partir de l’étape 5.3.3) dans du PBS.
   2. Déposer 100 μL des dilutions 1 x ^10-5 et 1 x ^10-6 sur des plaques TSB + rouge Congo et incuber toute la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : Le placage de 100 μL à partir des dilutions 1 x ^10-5 et 1 x ^10-6 correspond à un facteur de dilution final de 1 x ^10-6 et 1 x ^10-7, respectivement.
8. Laver soigneusement les cellules HT-29 infectées 3 fois avec 1 mL de PBS.
   1. Aspirer le milieu de chaque puits.
      REMARQUE : Lors de l’aspiration de fluides à partir de plaques à 6 puits, guidez la pointe de l’aspirateur le long de la face inférieure des puits, en essayant d’éviter tout contact avec les cellules HT-29.
   2. Ajouter 1 ml de PBS chaud dans chaque puits et laver délicatement.
      REMARQUE : Pour laver délicatement les monocouches à 6 puits avec du PBS, déplacez la plaque de haut en bas et d’un côté à l’autre sur la paillasse. Le lavage des plaques dans un mouvement circulaire et/ou le retrait de la plaque de la surface de la paillasse peuvent entraîner l’élimination mécanique des cellules du plastique.
   3. Répétez les étapes 5.8.1 et 5.8.2 2 fois de plus.
9. Éliminer le PBS par aspiration, puis ajouter 2 mL de DMEM chaud complété par 50 μg/mL de gentamicine dans chaque puits et incuber pendant 30 min à 37 °C avec 5 % de CO₂.
10. Laver soigneusement les cellules HT-29 infectées 3 fois avec 1 mL de PBS.
    1. Répétez l’étape de lavage 5.8.
11. Éliminer le PBS par aspiration, puis ajouter 2 mL de DMEM chaud complété par 50 μg/mL de gentamicine dans chaque puits et incuber pendant 60 min à 37 °C avec 5 % de CO₂.
12. Laver soigneusement les cellules HT-29 infectées 3 fois avec 1 mL de PBS.
    1. Répétez l’étape de lavage 5.8.
13. Éliminer le PBS par aspiration et lyser les cellules HT-29 en ajoutant 1 mL de PBS + 1 % de Triton X-100 dans chaque puits.
14. Incuber des plaques de 6 puits à 37 °C pendant 5 min.
15. À l’aide d’un grattoir cellulaire ou d’une pointe de pipette courbée, grattez les cellules lysées du fond du puits et transférez la totalité de 1 ml dans un tube de microcentrifugation frais de 1,7 ml.
16. Déterminez le nombre de bactéries intracellulaires.
    1. Vortex dans chaque tube (à partir de l’étape 5.15) pendant au moins 30 s pour déplacer davantage Shigella des cellules eucaryotes lysées.
    2. Préparez des dilutions en série de 10 fois de lysats dans du PBS.
    3. Déposer 100 μL des dilutions 1 x ^10-2 et 1 x ^10-3 sur des plaques TSB + rouge Congo et incuber toute la nuit à 37 °C.
       REMARQUE : Le placage de 100 μL à partir des dilutions 1 x ^10-2 et 1 x ^10-3 correspond à un facteur de dilution final de 1 x ^10-3 et 1 x ^10-4, respectivement.

6. Test de réplication intracellulaire

REMARQUE : Tous les volumes sont cohérents avec un test utilisant deux plaques à 6 puits.

1. Sous-culture pendant la nuit Cultures de Shigella par dilution 1:50 dans un milieu frais.
   1. Vortex, puis ajouter 100 μL de chaque culture de nuit à 5 mL de TSB ou TSB + BS frais dans un tube de culture de taille appropriée.
      REMARQUE : Limitez le volume de culture à <20 % du volume du ballon ou du tube de culture pour assurer une bonne aération.
   2. Incuber à 37 °C en agitant à 250 tr/min jusqu’à ce que les cellules atteignent une OD₆₀₀ de 0,7 (phase mi-log de croissance de Shigella ) ; environ 2-2,5 h.
      REMARQUE : Au cours de la sous-culture, aliquoter 50 mL de DMEM + 50 mg/mL de gentamicine et un volume suffisant de PBS pour toutes les étapes de lavage et placer dans un bain-marie à 37 °C. Laissez le support atteindre 37 °C avant utilisation.
2. Transférer 2 x 10⁸ UFC de Shigella sous-cultivée dans des tubes à microcentrifuger individuels de 2 ml.
   REMARQUE : 2 x 10⁸ UFC correspondent à environ 1 mL de cellules bactériennes à une DO₆₀₀ de 0,7. Utilisez des lectures OD₆₀₀ pour approximer la CFU/mL en fonction de l’étalonnage de chaque spectrophotomètre individuel.
3. Lavez les échantillons de Shigella 1x avec PBS.
   1. Cellules à granulés par centrifugation à 17 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Aspirer le surnageant, puis ajouter 1 mL de PBS chaud et bien remettre la pastille en suspension, en pipetant doucement l’échantillon de haut en bas jusqu’à ce que le mélange soit complètement homogène (8-10x).
   2. Répétez l’étape 6.3.1. 1x temps supplémentaire.
   3. Centrifuger les granulés à 17 000 x g pendant 2 min à température ambiante, aspirer le surnageant et remettre les granulés en suspension dans 2 mL de DMEM chaud.
      REMARQUE : La concentration finale de bactéries remises en suspension sera de 1 x 10⁸ UFC/mL.
4. Vortex, puis ajouter 1 mL (1 x 10⁸ UFC) de Shigella remise en suspension plus 1 mL de DMEM dans chaque puits de monocouches épithéliales du côlon HT-29 préparées dans des plaques à 6 puits (à partir de l’étape 3.2.10.2).
   REMARQUE : Les infections sont normalement réalisées à une multiplicité d’infection (MOI ; rapport entre les cellules bactériennes et épithéliales) de 100. Pour tester différentes MOI, diluez Shigella en suspension dans du DMEM à la concentration désirée, puis ajoutez 1 mL de bactéries diluées aux monocouches HT-29. Par exemple, pour tester un MOI de 10, diluez les bactéries 1:10 en ajoutant 150 μL de 1 x 10⁸ UFC/mL de bactéries à 1,35 mL de DMEM, puis appliquez 1 mL (1 x 10⁷ UFC) sur les cellules HT-29.
5. Pour favoriser le contact bactérien avec les cellules HT-29, centrifuger les plaques à 6 puits à 2 000 x g pendant 10 min à température ambiante ou 37 °C si le réglage de la température peut être ajusté.
   REMARQUE : La centrifugation favorise le contact bactérien avec les cellules HT-29, ce qui contourne le besoin de facteurs d’adhérence et permet aux bactéries d’envahir rapidement les cellules.
6. Incuber des plaques de 6 puits à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 45 min.
7. Pendant l’incubation, déterminer le titre d’infection bactérienne.
   1. Préparer des dilutions en série de 10 fois de cellules Shigella remises en suspension (à partir de l’étape 6.3.3) dans du PBS.
   2. Déposer 100 μL des dilutions 1 x ^10-5 et 1 x ^10-6 sur des plaques TSB + rouge Congo et incuber toute la nuit à 37 °C.
      REMARQUE : Le placage de 100 μL à partir des dilutions 1 x ^10-5 et 1 x ^10-6 correspond à un facteur de dilution final de 1 x ^10-6 et 1 x ^10-7, respectivement.
8. Laver soigneusement les cellules HT-29 infectées 3 fois avec 1 mL de PBS.
   1. Aspirer le milieu de chaque puits.
      REMARQUE : Lors de l’aspiration de fluides à partir de plaques à 6 puits, guidez la pointe de l’aspirateur le long de la face inférieure des puits, en essayant d’éviter tout contact avec les cellules HT-29.
   2. Ajouter 1 ml de PBS chaud dans chaque puits et laver délicatement.
      REMARQUE : Pour laver délicatement les monocouches à 6 puits avec du PBS, déplacez la plaque de haut en bas et d’un côté à l’autre sur la paillasse. Le lavage des plaques dans un mouvement circulaire et/ou le retrait de la plaque de la surface de la paillasse peuvent entraîner l’élimination mécanique des cellules du plastique.
   3. Répétez les étapes 6.8.1 et 6.8.2 2 fois de plus.
9. Éliminer le PBS par aspiration, puis ajouter 2 mL de DMEM chaud complété par 50 μg/mL de gentamicine dans chaque puits et incuber pendant 30 min à 37 °C avec 5 % de CO₂.
10. Laver soigneusement les cellules HT-29 infectées 3 fois avec 1 mL de PBS.
    1. Répétez l’étape de lavage 6.8.
11. Éliminer le PBS par aspiration, puis ajouter 2 mL de DMEM chaud avec 50 μg/mL de gentamicine dans chaque puits des plaques à 6 puits et incuber à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant la durée souhaitée pour permettre la réplication intracellulaire (jusqu’à 24 h).
12. Laver soigneusement les cellules 2x avec 1 mL de PBS.
    1. Répétez l’étape de lavage 6.8.
13. Éliminer le PBS par aspiration et lyser les cellules HT-29 en ajoutant 1 mL de PBS + 1 % de Triton X-100 dans chaque puits.
14. Incuber des plaques de 6 puits à 37 °C pendant 5 min.
15. Utilisez un grattoir cellulaire ou une pointe de pipette courbée pour gratter les cellules lysées du fond du puits et transférer la totalité de 1 mL dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,7 mL.
16. Déterminez le nombre de bactéries intracellulaires.
    1. Agiter chaque tube (à partir de l’étape 6.15) pendant au moins 30 s pour déplacer davantage Shigella des cellules eucaryotes lysées.
    2. Préparez des dilutions en série de 10 fois de lysats dans du PBS.
    3. Déposer 100 μL des dilutions 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 et 1 x ^10-4 sur des plaques TSB + Congo Red et incuber pendant la nuit à 37 °C.
       REMARQUE : Le placage de 100 μL à partir des dilutions 1 x ^10-2, 1 x ^10-3 et 1 x ^10-4 correspond à un facteur de dilution final de 1 x ^10-3, 1 x ^10-4 et 1 x ^10-5, respectivement.

Résultats

Des tests d’adhérence, d’invasion et de réplication intracellulaire ont été effectués en comparant S. flexneri 2457T de type sauvage (WT) à S. flexneri ΔVF (ΔVF), un mutant supposé réguler négativement la virulence de Shigella. Étant donné que Shigella utilise les sels biliaires comme signal pour réguler la virulence 17,18,47, des expériences ont été réalisées après une sous-culture bactérienne dans un milieu TSB ainsi qu’une supplémentation en sels biliaires à 0,4 % (p/v) ¹⁸. L’exposition aux sels biliaires pendant l’étape de sous-culture agit comme un prétraitement pour reproduire le transit de l’intestin grêle avant l’infection colique 17,18,47. La figure 1 analyse l’effet de la mutation ΔVF sur la capacité de S. flexneri à adhérer aux cellules épithéliales du côlon HT-29. Le pourcentage d’adhérence est tracé sur l’axe des y et représente le rapport des bactéries récupérées après la lyse HT-29 normalisé par rapport au nombre de bactéries d’entrée. Comme prévu, les souches de S. flexneri WT et ΔVF ont présenté une augmentation significative de l’observance lorsqu’elles étaient sous-cultivées avec supplémentation en sels biliaires par rapport à TSB sans supplémentation en sels biliaires¹⁸. Cependant, il n’y avait pas de différence dans l’adhérence aux cellules HT-29 entre les souches mutantes WT et ΔVF dans chaque condition de sous-culture. Ces données indiquent que la mutation ΔVF n’a aucun effet sur la capacité de S. flexneri à adhérer aux cellules épithéliales HT-29 avec ou sans prétraitement aux sels biliaires.

Dans la figure 2, l’effet de la mutation ΔVF sur la capacité de S. flexneri à envahir (Figure 2A) et à se répliquer (Figure 2B) à l’intérieur des cellules épithéliales du côlon HT-29 avec ou sans prétraitement aux sels biliaires a été analysé. Le pourcentage de récupération est tracé sur l’axe des y et représente le rapport de cellules bactériennes récupérées après la lyse cellulaire HT-29 normalisé par rapport au nombre de bactéries d’entrée. Dans la figure 2A, on s’attendait à une augmentation significative de la capacité de WT S. flexneri 2457T à envahir les cellules HT-29 après une pré-exposition aux sels biliaires⁴⁸, tandis que le mutant S. flexneri ΔVF présentait une augmentation plus faible de l’invasion après une préexposition aux sels biliaires par rapport à la souche WT. Le mutant ΔVF avait des taux d’invasion accrus de cellules HT-29 par rapport à la sous-culture WT dans TSB, mais avait des taux d’invasion similaires à ceux de WT lorsqu’il était sous-cultivé dans TSB supplémenté en sels biliaires (Figure 2A). Ces résultats suggèrent que la mutation ΔVF améliore la capacité de S. flexneri à envahir les cellules HT-29, ce qui diminue l’effet des sels biliaires avant l’exposition, même si la capacité d’invasion du mutant ΔVF a encore augmenté après la sous-culture de sels biliaires.

Dans l’ensemble, 10 fois plus de bactéries ont été récupérées après une nuit d’incubation (figure 2B) par rapport à une incubation de 90 minutes (figure 2A), ce qui démontre les différences dans la surveillance de la croissance intracellulaire par rapport à l’invasion, respectivement. Lorsque les cellules HT-29 infectées ont été incubées pendant 18 heures pour permettre la réplication intracellulaire de la bactérie (figure 2B), l’impact du prétraitement des sels biliaires a diminué pour les souches WT et ΔVF . Cependant, l’effet réduit du prétraitement des sels biliaires pendant la réplication intracellulaire était plus spectaculaire pour le mutant ΔVF . Étant donné que l’augmentation de la réplication intracellulaire des deux souches lors de la pré-exposition aux sels biliaires était plus faible que l’augmentation des taux d’invasion dans les mêmes conditions, nous émettons l’hypothèse que les sels biliaires ont un impact plus important sur les premières étapes de la pathogenèse de S. flexneri . Le mutant ΔVF a montré une augmentation du pourcentage de récupération de la réplication nocturne à l’intérieur des cellules HT-29 par rapport à WT (Figure 2B) après les deux conditions de sous-culture. Cependant, les pourcentages de récupération du mutant ΔVF étaient similaires indépendamment des sels biliaires avant l’exposition. Ces tendances des données suggèrent que le mutant ΔVF se réplique plus efficacement à l’intérieur des cellules HT-29 que dans les WT, et que la pré-exposition aux sels biliaires n’a pas d’impact sur la capacité du mutant ΔVF à se répliquer intracellulairement, comme observé pour WT (figure 2B). Étant donné que la différence entre les souches mutantes et WT dans les conditions de pré-exposition aux sels biliaires n’a pas été observée lors de l’essai d’invasion de 90 minutes, nous émettons l’hypothèse que le produit codé par le gène VF supprimé peut également réguler la réplication de S. flexneri à l’intérieur des cellules HT-29. Combinées, les deux analyses démontrent que le mutant ΔVF est plus virulent que WT, ce qui suggère que le produit du gène VF est un régulateur négatif de la virulence de S. flexneri .

Figure 1 : L’adhérence pré-exposition aux sels biliaires induite par S. flexneri aux cellules HT-29. Les cellules mutantes S. flexneri 2457T WT et ΔVF ont été sous-cultivées dans des milieux TSB ou TSB complétés par 0,4 % (p/v) de sels biliaires (TSB+BS). Les bactéries ont ensuite été appliquées sur des cellules HT-29 à une multiplicité d’infection (MOI) de 100 et incubées pendant 3 heures pour examiner l’observance. Après l’incubation, les cellules HT-29 infectées ont été lavées et lysées, et des dilutions en série des bactéries récupérées ont été mises en plaques pour dénombrer les unités formant colonies par mL (UFC/mL). Le nombre de bactéries adhérentes est tracé par rapport aux titres de bactéries d’entrée pour établir le pourcentage d’adhérence. Les données sont représentatives d’une répétition biologique avec trois répétitions techniques (points individuels). Les barres d’erreur indiquent l’erreur type de la moyenne (SEM). La signification statistique a été déterminée par un test t de Student (*p < 0,05 ; ***p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Les sels biliaires avant l’exposition ont augmenté l’invasion de WT S. flexneri et la réplication intracellulaire. Les cellules mutantes S. flexneri 2457T WT et ΔVF ont été sous-cultivées dans des milieux TSB ou TSB supplémentés en sels biliaires (TSB+BS). Les bactéries ont ensuite été appliquées sur des cellules HT-29 à un moment d’inertie de 100, centrifugées sur les cellules et incubées à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 45 min. Les cellules ont été lavées avec du PBS et les bactéries extracellulaires ont été lysées par l’ajout de gentamicine au DMEM pour récupérer exclusivement les bactéries intracellulaires. Après 90 minutes (A, invasion bactérienne) ou 18 h (B, réplication intracellulaire) d’incubation, les cellules HT-29 infectées ont été lavées et lysées, et des dilutions en série des bactéries récupérées ont été mises en plaques pour dénombrer les unités formant colonies par mL (UFC/mL). Le nombre de bactéries intracellulaires est tracé par rapport aux titres bactériens d’entrée pour établir le pourcentage de récupération. Les données sont représentatives d’une répétition biologique, chacune avec trois répétitions techniques (points individuels). La signification statistique a été déterminée par un test t de Student (*p < 0,05). Veuillez noter les différences dans les échelles de l’axe des y entre les panneaux (A) et (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce protocole décrit un ensemble de trois tests standardisés pour étudier l’adhérence, l’invasion et la réplication intracellulaire de Shigella des cellules épithéliales intestinales. Bien que ces méthodes ne soient que des versions modifiées des tests classiques de gentamicine utilisés pour étudier l’invasion et la réplication intracellulaire de divers agents pathogènes bactériens dans les cellules hôtes 49,50,51, des considérations particulières doivent être appliquées lors de l’étude de Shigella.

Les Shigella sont des anaérobies facultatifs, qui se développent de manière optimale à 37 °C dans un milieu riche avec une aération^{de 43}. Lors de la réalisation de ces tests pour interroger les effets de différents signaux environnementaux ou métabolites sur les infections à Shigella, il est recommandé de cultiver Shigella dans un milieu riche pendant la nuit, puis de sous-cultiver dans un milieu défini ou complété jusqu’à la phase mi-log avant l’infection. L’expression maximale des gènes de virulence se produit pendant la phase logarithmique de croissance^52,53. Ainsi, la sous-culture de cultures de Shigella pendant la nuit et la croissance bactérienne en phase exponentielle (OD₆₀₀ ~ 0,7) sont des étapes nécessaires pour évaluer correctement la virulence de Shigella. De plus, l’expression des gènes de virulence dépend de la température. Pour garantir la spécificité de l’expression uniquement lors de l’infection de l’hôte, les gènes de virulence sont induits à des températures physiologiques de l’hôte (37 °C) et strictement réprimés à des températures plus basses (par exemple, 30 °C)⁵⁴. Pour assurer l’expression des gènes de virulence, la sous-culture bactérienne et les infections doivent être effectuées à 37 °C, avec les précautions appropriées pour s’assurer que la température ne descend pas en dessous de 37 °C. Un grand plasmide de virulence de 220 kilobases, qui code pour la machinerie moléculaire nécessaire à l’invasion et à l’infection des cellules épithéliales, est un déterminant essentiel de la virulence pour tous les Shigella spp⁵. Le passage répété et la croissance prolongée à 37 °C favorisent l’instabilité plasmidique de virulence, entraînant une perte de plasmide et rendant les cellules de Shigella avirulentes⁵⁵. Pour assurer le maintien du plasmide de virulence et l’expression des gènes de virulence cruciaux, il est recommandé de réintroduire les bactéries directement des stocks de congélation toutes les deux semaines sur des plaques indicatrices TSB + Congo rouges fraîches. La gélose rouge du Congo peut être utilisée pour différencier les colonies virulentes de type sauvage (rouge, CR⁺) et les colonies avirulentes (blanches, CR^-) qui ont perdu le plasmide de virulence⁴⁵. Si une instabilité plasmidique de virulence est observée à plusieurs reprises, des cultures de nuit de Shigella peuvent être incubées à 30 °C pour éviter la perte de plasmide de virulence, suivies d’une sous-culture à 37 °C pour favoriser l’expression du gène de virulence⁴³. Enfin, si des analyses avec des mutants et/ou des souches complémentaires sont effectuées, dans lesquelles des marqueurs antibiotiques sont présents dans ces souches bactériennes, il est recommandé d’utiliser la sélection d’antibiotiques appropriée pendant les étapes de nuit bactérienne et de sous-culture.

L’utilisation de monocouches épithéliales HT-29 présente de nombreux avantages pour étudier les mécanismes moléculaires de la pathogenèse de Shigella in vitro. Shigella étant un agent pathogène adapté à l’homme, les modèles de petits animaux ne reflètent pas avec précision la pathogenèse caractéristique de la shigellose observée chez l’homme³⁶. Ainsi, l’utilisation de protocoles standardisés pour l’infection de lignées cellulaires d’origine humaine permet l’interrogation quantitative des étapes individuelles de la pathogenèse bactérienne afin de caractériser l’interaction moléculaire entre cet agent pathogène et son hôte natif. Historiquement, les cellules HeLa étaient principalement utilisées pour étudier les interactions hôte-pathogène in vitro 25,56,57. Cependant, les cellules HeLa sont une lignée cellulaire immortalisée du cancer du col de l’utérus, qui sont des cellules hôtes non natives pour les agents pathogènes bactériens entériques. Ainsi, les études in vitro de la pathogenèse entérique se sont déplacées vers l’utilisation de lignées cellulaires d’adénocarcinome colique (par exemple, HT-29, Caco-2 et T84), qui récapitulent plus fidèlement la morphologie épithéliale intestinale, et peuvent être cultivées sur des transwells en tant que monocouches épithéliales avec des surfaces apicales et basolatérales différenciées 58,59,60. Bien que chaque lignée cellulaire ait ses forces et ses faiblesses individuelles, les cellules HT-29 sont utilisées dans les tests décrits ici en raison des similitudes phénotypiques avec les entérocytes intestinaux et de l’expression robuste des récepteurs de surface cellulaire et des cytokines pro-inflammatoires 58,59,61. Cependant, chacun de ces modèles discutés sont des lignées cellulaires dérivées du cancer avec des phénotypes métaboliques et de croissance aberrants qui ne représentent pas avec précision l’état physiologique naturel de l’épithélium colique in vivo⁵⁸. Les progrès récents des techniques de culture de tissus humains ont permis de cultiver des cellules souches intestinales humaines, obtenues à partir de biopsies tissulaires, en organoïdes ou en monocouches cellulaires bidimensionnelles uniques qui récapitulent les différents types de cellules présentes dans le tractus gastro-intestinal (GI) humain 62,63,64. Les organoïdes intestinaux peuvent être différenciés pour inclure les entérocytes, les cellules caliciformes productrices de mucus, les cellules M et d’autres types de cellules spécifiques aux tissus. Des études récentes ont validé l’utilisation de ces modèles organoïdes pour étudier les agents pathogènes entériques, y compris divers pathovars de Shigella spp., Salmonella enterica et Escherichia coli 62,63,64. Bien que les organoïdes soient des modèles plus précis de l’épithélium gastro-intestinal humain et puissent même être cultivés dans des conditions nutritionnelles variées pour représenter la population mondiale⁶⁵, leur complexité relative nécessite une formation et une expertise technique importantes, ce qui entraîne des coûts plus élevés et des temps de culture plus longs par rapport aux lignées cellulaires cancéreuses traditionnelles⁵⁸.

Ce protocole décrit les méthodes à débit moyen, dans lesquelles deux plaques à 6 puits sont utilisées pour un total de 12 monocouches disponibles pour les tests. Cependant, les expériences peuvent facilement être mises à l’échelle pour augmenter le nombre de monocouches ensemencées afin d’accueillir des répétitions techniques supplémentaires, ou de tester des mutants Shigella et des signaux environnementaux supplémentaires. Les plaques de culture tissulaire avec plus de puits (par exemple, des plaques de 12 ou 24 puits) peuvent également être utilisées avec les ajustements appropriés pour tenir compte des puits de plus petit diamètre. Dans les conditions de croissance du HT-29 décrites à l’étape 3.2, les titres de HT-29 sont suffisants pour ensemencer environ six plaques de 6 puits après la culture à partir d’un flacon T75, avec suffisamment de cellules restantes pour maintenir la culture cellulaire du HT-29. De plus, les étapes d’ensemencement des monocouches HT-29 et de préparation des bactéries inoculées sont identiques entre les tests d’adhérence bactérienne, d’invasion et de réplication intracellulaire. Ainsi, des tests testant les mêmes souches de Shigella ou les mêmes conditions de sous-culture peuvent facilement être effectués en parallèle pour examiner simultanément le rôle de chaque condition expérimentale dans les différentes étapes de l’infection à Shigella .

Les titres de récupération pour les bactéries adhérentes (étape 4), envahies (étape 5) et intracellulaires (étape 6) sont déterminés par des dilutions en série de cellules HT-29 infectées après la lyse, ce qui permet une évaluation quantitative de l’efficacité de chaque stade de l’infection à Shigella. Les étapes de centrifugation dans les tests d’invasion et de réplication intracellulaire, basées sur les tests classiques 49,50,51, favorisent le contact bactérien avec les cellules hôtes pour une invasion immédiate et augmentent les taux d’invasion. Ainsi, la centrifugation « saute » l’étape d’adhérence, qui s’est avérée plus tard être un aspect important de l’infection à Shigella 17,18,19,66. Il est essentiel de noter que l’étape de centrifugation ne peut pas être réalisée avec des cellules épithéliales polarisées ensemencées sur des puits transversaux. Pour le test d’observance, cependant, l’adhérence n’est pas forcée par centrifugation, et aucune gentamicine n’est ajoutée aux cellules HT-29 infectées avant la lyse, permettant ainsi le dénombrement des cellules bactériennes adhérentes. Le volume du milieu de culture tissulaire est réduit à 1 mL (contre 2 mL pour les tests d’invasion et de réplication intracellulaire) pour permettre un contact plus efficace des bactéries avec les cellules HT-29. De plus, selon le taux d’adhérence, une certaine invasion et réplication intracellulaire peut se produire pendant les 3 heures d’incubation, mais la quantité est généralement négligeable (par exemple, seulement 0,05 % de la population bactérienne récupérée après la lyse de la cellule hôte). Néanmoins, pour tenir compte correctement des bactéries adhérentes par rapport aux bactéries intracellulaires pendant l’incubation de 3 heures, il est recommandé d’effectuer des essais parallèles, où, en plus du protocole indiqué, une deuxième plaque est incubée avec 50 μg/mL de gentamicine dans 2 mL de DMEM par puits pendant 45 min au total (15 min d’incubation, lavage, DMEM frais + gentamycine pendant 30 min) pour lyser complètement les bactéries extracellulaires. Après la lyse des cellules HT-29 comme indiqué dans le protocole, les bactéries intracellulaires peuvent être énumérées comme indiqué ci-dessus et représenteront le nombre de bactéries qui ont envahi. Cette valeur peut ensuite être soustraite des bactéries dénombrées de la plaque sans traitement à la gentamicine pour déterminer correctement les bactéries adhérentes et envahies. Des analyses parallèles peuvent également être effectuées pour mieux comprendre la réplication intracellulaire de Shigella à l’intérieur des cellules HT-29 après l’invasion, par exemple en utilisant plusieurs points temporels pour effectuer des courbes de croissance intracellulaires. Enfin, en plus de dénombrer les bactéries intracellulaires après une incubation de gentamicine de 18 heures, les surnageants de culture peuvent être collectés et analysés pour la sécrétion de cytokines des cellules HT-29 infectées. Par exemple, l’IL-8 est une chimiokine sécrétée par les cellules épithéliales qui fonctionne en grande partie pour recruter des PMN sur le site de l’infection. La quantité d’IL-8 sécrétée dans les milieux de culture des cellules HT-29 infectées peut être analysée à l’aide d’un test ELISA^{IL-8 67}.

Les sels biliaires se sont avérés être un signal de virulence important pour Shigella pendant le transit dans le système gastro-intestinal humain et peuvent être utilisés pour compléter les milieux de croissance bactérienne dans ces protocoles afin de reproduire les conditions gastro-intestinales typiques. Naturellement, les sels biliaires sont introduits dans le duodénum ou la partie supérieure de l’intestin grêle pour faciliter la digestion ; et dans l’iléon terminal ou l’extrémité de l’intestin grêle, 95 % des sels biliaires sont éliminés et recyclés dans la circulation pour un dépôt final dans la vésicule biliaire⁶⁸. Les sels biliaires ont généralement une concentration comprise entre 0,2 % et 2,0 % (p/v) dans l’intestin grêle et sont naturellement bactéricides. Cependant, Shigella, comme la plupart des bactéries entériques, résiste aux sels biliaires et utilise les signaux pour augmenter l’infection⁴⁷. Plusieurs études ont documenté comment l’exposition aux sels biliaires, parfois en conjonction avec d’autres signaux intestinaux grêles comme le glucose, affecte la survie de Shigella et la régulation de la virulence avant l’infection. Il a été démontré que Shigella résiste aux sels biliaires, modifie l’expression des gènes et forme et disperse un biofilm dans des conditions qui reproduisent le transit intestinal grêle ^17,69. Les études ont démontré que ces changements entraînent un phénotype hypervirulent, dans lequel l’adhérence et l’invasion sont induites lors d’une infection colique ultérieure par Shigella 17,18,19,48,66. Ainsi, les conditions décrites ci-dessus documentent comment sous-cultiver Shigella dans des sels biliaires pour imiter le transit intestinal grêle avant d’effectuer les tests d’adhérence, d’invasion ou de réplication intracellulaire. La formulation TSB spécifiée contient du glucose ajouté par rapport au bouillon Luria typique (LB)¹⁷. Ainsi, si LB est utilisé, il est important de compléter également le milieu avec du glucose (0,5 % à 2,0 % [p/v]) pour tenir compte de manière appropriée des signaux de glucose dans l’intestin grêle¹⁷. De plus, comme mentionné ci-dessus, toutes les sous-cultures de Shigella sont lavées pour éliminer les sels biliaires et imiter la transition vers le côlon pour les analyses d’infection.

Traditionnellement, et comme le soulignent les résultats ci-dessus (Figure 1 et Figure 2), les tests d’infection sont utiles pour déterminer le rôle d’un gène particulier dans l’infection à Shigella . Le phénotype des différents mutants, cependant, peut ne pas être vraiment apprécié sans une supplémentation appropriée du milieu de culture bactérienne. Comme l’ont démontré des recherches antérieures, les sels biliaires modifient considérablement l’expression des gènes de S. flexneri , y compris les gènes du métabolisme central, les facteurs de transcription, les transporteurs de sucre, la résistance aux médicaments et les gènes de virulence codés sur le chromosome ou le plasmide de virulence¹⁷. Ces gènes donnent un aperçu de la façon dont Shigella utilise les sels biliaires comme signal pour modifier l’expression des gènes et se préparer à une éventuelle infection du côlon, et des analyses mutationnelles ultérieures doivent donc être effectuées dans le milieu de croissance bactérienne supplémenté approprié avant d’examiner les effets sur la virulence dans les tests d’adhérence, d’invasion et de réplication intracellulaire. Comme on le voit ci-dessus dans les figures 1 et 2, la mutation ΔVF n’a pas affecté l’observance mais a affecté l’invasion et la réplication intracellulaire. Étant donné que la mutation a amélioré l’invasion et la réplication intracellulaire, des expériences sont actuellement en cours pour déterminer comment le produit génique régule l’infection. Les analyses mutantes servent d’exemple de la façon dont de nouvelles connaissances sur la pathogenèse de Shigella peuvent être étudiées, en particulier dans des conditions qui reproduisent mieux le tractus gastro-intestinal humain. Des analyses de complémentation appropriées sont recommandées pour valider les phénotypes des différents mutants.

Ensemble, ces procédures décrivent des expériences quantitatives qui fourniront des informations importantes sur les mécanismes moléculaires de l’adhérence, de l’invasion et de la réplication de Shigella à l’intérieur des cellules épithéliales du côlon HT-29 en imitant au mieux l’environnement naturel du tractus gastro-intestinal humain pendant l’infection. Des études futures peuvent développer les mutants et les conditions expérimentales pour mieux comprendre comment Shigella se prépare et infecte efficacement les hôtes humains. Malgré des décennies de recherche, il reste encore beaucoup à découvrir sur l’infection à Shigella.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,22 &mu ; m Filtre PES	Millipore-Sigma	SCGP00525	Filtre stérile en polyéthersulfone pour la stérilisation jusqu’à 50 mL de milieux
Tubes de culture de 14 mL	Corning	352059	17 mm x 100 mm Tubes à essai en polypropylène de 17 mm x 100 mm avec capuchon
Tubes coniques de 50 mL de	Corning	430829	de 50 mL Tubes à centrifuger à fond conique en polypropylène transparent avec bouchon étanche
Plaques de culture tissulaire à 6 puits	Corning	3516	Les plaques sont traitées pour une fixation cellulaire optimale
Sels biliaires	Sigma-Aldrich	B8756	Rapport 1:1 entre le cholate et le désoxycholate
Colorant rouge du Congo	Sigma-Aldrich	C6277	Un colorant diazo anionique à base de benzidine, pureté >85 %
Lame de chambre de comptage cellulaire Countess	Invitrogen	C10283	À utiliser avec le compteur cellulaire automatisé Countess
Dimethyl sulfoxyde (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418 A,	un réactif organique hautement polaire
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	Le DMEM est complété par du glucose élevé, du pyruvate de sodium, du GlutaMAX et du
sérum bovin fœtal rouge phénolique (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Gentamicine stérile inactivée par la chaleur
	Sigma-Aldrich	G3632	La concentration du stock est de 50 mg/mL
Lignée cellulaire HT-29	ATCC	HTB-38	Lignée cellulaire d’adénocarcinome ; colorectal en origine
Film de paraffine	Bemis	PM999	Film d’étanchéité de laboratoire
Boîtes de Pétri	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Boîtes de Pétri pour milieux solides
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration ; pH 7,4
Sélectionner gélose	Invitrogen	30391023	Un mélange de polysaccharides extraits des parois cellulaires d’algues rouges pour fabriquer des milieux de placage bactérien
Fioles T75	Corning	430641U	Fioles de culture tissulaire
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Un tensioactif et émulsifiant non ionique commun.
Coloration au bleu de trypan	Invitrogen	T10282	Un colorant pour détecter les cellules mortes de culture de tissus ; seules les cellules vivantes peuvent exclure le colorant
Trypsine-EDTA	Gibco	25200-056	Réactif pour la dissociation cellulaire pour l’entretien et le passage des lignées cellulaires
Bouillon de soja tryptique (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Milieu de croissance bactérienne