Modèle murin modifié de lésion cérébrale traumatique légère répétitive incorporant une fenêtre de crâne amincie et une percussion fluide

Résumé

Ce protocole présente un modèle murin modifié de lésions cérébrales traumatiques légères répétitives (TCLr) induites par une méthode de traumatisme crânien fermé (CHI). L’approche comprend une fenêtre crânienne amincie et une percussion fluide pour réduire l’inflammation généralement causée par l’exposition aux méninges, ainsi qu’une reproductibilité et une précision améliorées dans la modélisation des TCL chez les rongeurs.

Résumé

Le traumatisme craniocérébral léger est un trouble neurologique cliniquement très hétérogène. Il est urgent de disposer de modèles animaux de lésions cérébrales traumatiques (TCC) hautement reproductibles avec des pathologies bien définies pour étudier les mécanismes de la neuropathologie après un TCC léger et tester des traitements. Reproduire l’ensemble des séquelles des traumatismes crâniens dans des modèles animaux s’est avéré être un défi. Par conséquent, la disponibilité de plusieurs modèles animaux de TCC est nécessaire pour tenir compte des divers aspects et sévérités observés chez les patients TCC. Le CHI est l’une des méthodes les plus courantes pour fabriquer des modèles de rongeurs de rmTBI. Cependant, cette méthode est sensible à de nombreux facteurs, notamment la méthode d’impact utilisée, l’épaisseur et la forme de l’os du crâne, l’apnée animale et le type d’appui-tête et d’immobilisation utilisé. L’objectif de ce protocole est de démontrer une combinaison des méthodes de la fenêtre crânienne amincie et des lésions par percussion fluide (FPI) pour produire un modèle murin précis de TCLr associé à l’CHI. L’objectif principal de ce protocole est de minimiser les facteurs qui pourraient avoir un impact sur la précision et la cohérence de la modélisation CHI et FPI, y compris l’épaisseur de l’os du crâne, la forme et le soutien de la tête. En utilisant une méthode de fenêtre crânienne amincie, l’inflammation potentielle due à la craniotomie et à l’IPF est minimisée, ce qui permet d’obtenir un modèle de souris amélioré qui reproduit les caractéristiques cliniques observées chez les patients atteints d’un TCC léger. Les résultats de l’analyse comportementale et histologique à l’aide de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) suggèrent que le TCLr peut entraîner une lésion cumulative qui produit des changements à la fois dans le comportement et la morphologie grossière du cerveau. Dans l’ensemble, le TCLm modifié associé au CHI constitue un outil utile pour les chercheurs afin d’explorer les mécanismes sous-jacents qui contribuent aux changements physiopathologiques focaux et diffus du TCLm.

Introduction

Les traumatismes crâniens légers, y compris les commotions cérébrales et les sous-commotions cérébrales, représentent la majorité de tous les cas de traumatismes crâniens (>80 % de tous les traumatismes crâniens)¹. Les traumatismes crâniens légers résultent généralement de chutes, d’accidents de la route, d’actes de violence, de sports de contact (p. ex., football, boxe, hockey) et de combats^{militaires2,3}. Un traumatisme crânien léger peut entraîner des événements neurobiologiques qui affectent les fonctions neurocomportementales tout au long de la vie du patient et augmentent le risque de maladies neurodégénératives ^4,5,6. Les modèles animaux constituent un moyen efficace et contrôlé d’étudier les traumatismes crâniens légers, dans l’espoir d’améliorer davantage le diagnostic et le traitement des traumatismes crâniens légers. Divers modèles de TCC légers ont été développés, tels que l’impact cortical contrôlé (CCI), la chute de poids (WD), la blessure par percussion fluide (FPI) et les modèles TBI ^7,8. Aucun modèle expérimental unique ne peut imiter toute la complexité de la pathologie induite par les traumatismes crâniens ^9,10. L’hétérogénéité de ces modèles est avantageuse pour aborder les diverses caractéristiques associées aux patients atteints de TCC léger et étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires correspondants. Cependant, chaque modèle animal de TCC a ses limites³, ce qui limite nos connaissances actuelles sur les TCC légers chez l’animal et leur pertinence clinique.

Les modèles WD et CCI sont utilisés pour reproduire des conditions cliniques telles que la perte de tissu cérébral, l’hématome sous-dural aigu, les lésions axonales, les commotions cérébrales, le dysfonctionnement de la barrière hémato-encéphalique et même le coma après un traumatisme crânien ^3,11,12. Le modèle WD consiste à induire des lésions cérébrales en frappant soit la dure-mère, soit le crâne avec des poids tombant librement. L’impact d’un objet lesté sur un crâne intact peut reproduire des lésions mixtes focales/diffuses ; Cependant, cette méthode est associée à une précision et une répétabilité médiocres du site de la blessure, à des lésions par rebond et à un taux de mortalité plus élevé dû aux fractures du crâne ^3,11,12. Le modèle CCI consiste à appliquer un métal entraîné par l’air pour impacter directement la dure-mère exposée. Par rapport au modèle WD, le modèle CCI est plus précis et reproductible, mais il ne produit pas de lésions diffuses en raison du petit diamètre de la pointe^{d’impact 11}. Au cours de la modélisation FPI, le tissu cérébral est brièvement déplacé et déformé par la percussion. Le FPI peut induire des lésions focales / diffuses mixtes et reproduire une hémorragie intracrânienne, un gonflement du cerveau et des lésions progressives de la matière grise après un TCC. Cependant, le FPI a un taux de mortalité élevé en raison de lésions du tronc cérébral et d’apnée prolongée ^3,12. La craniotomie impliquée dans les modèles WD, CCI et FPI conventionnels peut entraîner une contusion corticale, des lésions hémorragiques, des dommages à la barrière hémato-encéphalique, une infiltration de cellules immunitaires, une activation des cellules gliales, un temps de modélisation prolongé et des issues fatales possibles ^3,12.

Le TCC léger se caractérise par un score GCS (Glasgow coma scale, GCS) compris entre 13 et 15². Les traumatismes crâniens légers peuvent être focaux ou diffus et sont associés à des lésions aiguës, telles que la dégradation de l’homéostasie cellulaire, l’excitotoxicité, l’épuisement du glucose, le dysfonctionnement mitochondrial, les troubles du flux sanguin et les lésions axonales, ainsi qu’à des lésions subaiguës, notamment des lésions axonales, une neuroinflammation et une gliose ^2,3. Malgré des progrès significatifs dans la délimitation de la physiopathologie complexe des TCC, les mécanismes sous-jacents des TCC/TCL légers restent insaisissables et nécessitent des investigations plus^{approfondies 9}. Étant donné que le CHI est le type le plus courant de TCC¹², ce protocole présente une nouvelle approche pour créer un modèle murin contrôlé plus précisément de TCL à l’aide d’un dispositif FPI modifié pour effectuer un impact dans une fenêtre de crâne amincie¹³. En évitant les lésions induites par la craniotomie, l’épaisseur variable du crâne et les imprécisions induites par la forme, ainsi que les blessures de rebond, cette approche vise à surmonter les principaux inconvénients associés aux modèles WD, CCI et FPI. L’application de l’impact FPI sur la fenêtre du crâne aminci est pratique pour évaluer les lésions des vaisseaux cérébraux après un TCL et aide à minimiser les taux de mortalité élevés dans certains modèles, ce qui se traduit par une ressemblance plus étroite avec les caractéristiques cliniques des patients TCC.

Protocole

Toutes les procédures impliquées dans ce protocole ont été effectuées sous l’approbation du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (Zhejiang Normal University, numéro de permis, dw2019005) et conformément à l’ARRIVE et au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les spécifications techniques se trouvent dans la table des matériaux.

1. Procédure de manipulation des animaux

1. Hébergez les souris dans un environnement contrôlé avec une température de 22 à 24 °C, une humidité variant de 40 % à 60 %, un cycle lumière/obscurité de 12 heures, et fournissez un accès ad libitum à de l’eau et à de la nourriture de souris standard. Pour les besoins de cette expérience, 25 souris mâles ICR (25-30 g, âgées de 8 semaines) ont été utilisées.
2. Répartissez au hasard les souris dans le groupe témoin (n = 12) ou le groupe rmTBI (n = 13). Pour prévenir l’agression potentielle de souris fictives envers les souris qui ont subi un TCL, séparez-les dans des cages distinctes.
3. Donnez aux souris au moins 1 semaine pour s’acclimater à leur environnement de cage avant de commencer l’expérience. Cette période d’acclimatation permet aux souris de se familiariser avec leur environnement et de minimiser les impacts potentiels du stress ou de l’anxiété sur les réponses physiologiques ou comportementales au cours de l’étude.

2. Préparation du dispositif TBI

1. Fabriquer le modèle de TCLr chez la souris à l’aide d’un dispositif FPI modifié (voir la Table des matériaux ; Graphique 1A) ¹³. Avant d’utiliser le dispositif FPI, inspectez soigneusement toutes les connexions pour détecter des signes de fuite ou de fissuration, en accordant une attention particulière aux jonctions entre le cylindre et le tube, et entre le connecteur à trois voies et le tube. Pour déterminer avec précision les pressions d’impact, un transducteur de pression a été installé au point d’impact sur le dispositif de blessure par percussion^{de fluide 13}.
2. Effectuez une inspection minutieuse du dispositif FPI pour vous assurer que le piston se déplace en douceur à l’intérieur du cylindre et que les impacts peuvent être effectués efficacement (figure 1B). Vérifiez qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le système. Si des bulles d’air sont détectées, ajoutez soigneusement de l’eau distillée dans le système à l’aide d’une seringue de 50 ml et expulsez les bulles d’air en poussant rapidement la tige du cylindre à travers un connecteur à 3 voies à proximité et/ou à travers la seringue.
   REMARQUE : Le système FPI se compose d’eau distillée à l’intérieur de la bouteille et du tube connecté. Il est crucial d’étalonner l’appareil avant de l’utiliser pour garantir l’exactitude et la fiabilité des résultats.

3. Préparation du crâne aminci

REMARQUE : La chirurgie animale et la préparation du crâne aminci ne doivent pas être effectuées à la vue d’autres souris. La fenêtre crânienne amincie est utile pour évaluer les lésions des vaisseaux cérébraux après une procédure FPI.

1. Respecter les exigences du centre animalier en demandant à l’opérateur expérimental de porter une blouse et un masque stériles pendant toutes les procédures de manipulation des animaux.
2. Désinfectez la paillasse du laboratoire, l’appareil FPI, le tube anesthésique et le comptoir adjacent avant de commencer l’expérience à l’aide d’un spray d’éthanol à 70 %.
3. Pesez les souris des groupes simulé et TCL avant la chirurgie et comparez leur poids à celui enregistré 1 semaine avant l’expérience. Excluez de l’étude toute souris présentant une mauvaise santé telle qu’un pelage rugueux, de la diarrhée, une perte de poids ou une léthargie. De plus, excluez les souris qui pèsent moins de 20 g pour vous assurer qu’elles peuvent tolérer des impacts répétés. Ces mesures sont cruciales pour maintenir le bien-être des animaux et garantir des résultats expérimentaux fiables.
4. Anesthésier des souris avec de l’isoflurane à 4 % à 5 % (dans de l’oxygène à 100 % à un débit de 1 L/min) pendant 3 à 4 minutes dans une chambre d’induction. Administrer un lubrifiant ophtalmique (voir Tableau des matériaux) aux yeux de l’animal pour maintenir la lubrification tout au long de la chirurgie. Pour atténuer la douleur, administrer la buprénorphine par voie sous-cutanée (0,05 mg/kg) au milieu entre les oreilles 20 minutes avant l’anesthésie et par la suite toutes les 6 heures pendant une durée de 24 heures. De plus, à la fin de l’anesthésie, administrer une dose sous-cutanée unique de 5 mg/kg de carprofène à chaque animal.
5. Désinfectez la tête après que la souris a perdu ses réflexes de redressement et de retrait de la pédale. Coupez la fourrure de la tête de la souris à l’aide de ciseaux chirurgicaux et utilisez un rasoir pour enlever la fourrure restante. Désinfectez le cuir chevelu avec trois applications séquentielles de chlorhexidine à 2 %, entrecoupées de gommages à l’éthanol à 75 %.
6. Placez un tampon chirurgical stérile jetable sous l’animal et dans la zone environnante pour assurer une bonne hygiène. Faites une incision de 1,5 cm à l’aide d’un petit ciseau chirurgical fin le long de la ligne médiane du cuir chevelu de la souris pour exposer complètement le site chirurgical (Figure 2A).
7. Fixez la souris à l’aide de barres d’oreille non terminales dans un cadre stéréotaxique conventionnel (voir le tableau des matériaux). Ajustez la position de la tête de la souris dans un cadre stéréotaxique à un niveau plat ou à un léger angle incliné en fonction de la zone cible spécifique qui sera étudiée. Nettoyez la fourrure de la zone chirurgicale pour éviter l’inflammation plus tard.
8. Maintenez la température corporelle de la souris à 37 °C à l’aide d’un coussin chauffant isotherme conventionnel (voir tableau des matériaux).
9. Pendant le processus d’installation chirurgicale et d’installation du moyeu d’impact (Luer Lock femelle), maintenez l’anesthésie de la souris (sans réponse au pincement des orteils ou de la queue) avec un cône nasal qui délivre une concentration continue de 2% d’isoflurane, régulée par un vaporisateur calibré.
10. Nettoyez soigneusement la zone chirurgicale autour de la fenêtre du crâne aminci à l’aide d’un coton-tige stérile imbibé de solution saline.
11. Créez une fenêtre crânienne amincie, d’environ 2,5 mm de diamètre et 20 μm d’épaisseur, dans le cortex moteur frontal droit à l’aide d’un micro-foret à pointe plate (voir le tableau des matériaux, figure 2B) et d’une lame microchirurgicale. Situer le site chirurgical à 1,5 mm en avant du bregma et à 1,3-2,0 mm latéralement par rapport à la ligne médiane (Figure 2C).
    1. Pour éviter que la micro-perceuse ne pénètre dans le crâne lors de la création de la fenêtre du crâne amincie, humidifiez par intermittence le crâne avec une solution saline tout en meulant avec la micro-perceuse.
    2. Confirmez l’épaisseur du crâne en sondant doucement le crâne aminci avec la pointe aplatie d’une aiguille de seringue fine et en évaluant sa douceur. Estimez visuellement la clarté des micro-vaisseaux corticaux exposés pour déterminer l’épaisseur du crâne.
    3. Pour vérifier l’épaisseur du crâne, appliquez une solution saline stérile sur la zone amincie et inspectez visuellement à l’aide d’un microscope à dissection conventionnel (voir le tableau des matériaux). Cette technique peut aider à s’assurer que le crâne a été suffisamment aminci.
       REMARQUE : Lubrifiez l’œil de la souris tout au long de la préparation du crâne aminci et de la procédure de modélisation rmTBI pour éviter le dessèchement. L’amincissement du crâne à moins de 15 μm comporte le risque d’un traumatisme cortical léger qui peut entraîner une légère inflammation corticale¹⁴.
12. Fixez un Luer Lock femelle ajusté (2,2 mm de diamètre intérieur, créé à partir d’un moyeu d’aiguille 19G, comme illustré à la figure 2D) au site du crâne aminci. Fixez le Luer Lock à l’aide de colle et de ciment dentaire (Figure 2E).
    REMARQUE : Lorsque vous utilisez de la colle pour fixer la serrure Luer femelle à la zone autour de la fenêtre du crâne aminci, il est crucial de bien sécher la zone du crâne et d’empêcher l’adhésif de pénétrer dans la fenêtre elle-même. L’adhésif à l’intérieur de la fenêtre peut réduire considérablement la force d’impact du FPI.

4. Procédure de modélisation rmTBI associée au CHI

1. Introduire le TCLr en utilisant la méthode de percussion à fluide latéral avec un dispositif FPI modifié, comme décrit précédemment^13,15.
2. Après avoir terminé les procédures de fenêtre de crâne aminci et de moyeu d’impact, transférez la souris de l’appareil stéréotaxique à la plate-forme de l’impacteur.
3. Étant donné les effets potentiels de l’anesthésie sur le temps du réflexe de redressement de l’animal et la gravité des blessures après la percussion ^9,16, surveiller la profondeur de l’anesthésie en évaluant les réflexes de retrait palpébral et de la patte (Figure 2F).
4. Connectez le Luer Lock femelle, qui a été collé sur la fenêtre du crâne aminci, au Luer Lock mâle à l’extrémité du tube du dispositif FPI (Figure 2G).
   REMARQUE : Dans la modélisation rmTBI, l’anesthésie induite par l’isoflurane chez la souris a été prolongée en raison de l’induction de l’apnée et de l’inconscience par percussion.
5. Introduire deux traumatismes crâniens légers (intervalle de 48 heures) avec l’appareil modifié. Appliquez le premier impact FPI immédiatement après avoir terminé l’opération de la fenêtre à crâne aminci et installé la serrure Luer. N’administrez l’impact FPI qu’une fois que la souris montre un retour d’un réflexe de retrait à une pince de patte à chaque occasion (Figure 2H). L’application d’un impact FPI chez des souris profondément anesthésiées peut provoquer une apnée prolongée et la mort.
   1. Pour appliquer l’impact FPI, soulevez le pendule au degré désigné le long du rapporteur sur l’appareil et relâchez le pendule à l’aide de la commande logicielle^13,15. L’impact doit atteindre une intensité de percussion de 2,0 ± 0,1 atm, conformément aux protocoles établis utilisés dans les études sur les rongeurs 10,17,18. Exclure les animaux d’autres essais si l’impact n’a pas été enregistré entre 1,9 et 2,1 atm ou si une fracture du crâne s’est produite pendant l’IPF.
   2. Pour les souris factices, fixez-les sur l’appareil, mais ne donnez pas l’impact.
6. Après l’impact, détachez immédiatement la connexion Luer Lock et transférez les souris dans un coussin chauffant isotherme pour les récupérer. Une fois que la souris a retrouvé sa vigilance et sa conscience, retournez-la dans sa cage d’origine sans retirer le verrou Luer femelle. Administrer le deuxième impact FPI, de la même manière, 48 h plus tard.
7. Après le rmTBI, retirez soigneusement la serrure Luer femelle et le ciment dentaire. Suturez le cuir chevelu à l’aide d’un adhésif tissulaire et utilisez des pinces plates pour pincer le cuir chevelu afin de faciliter le processus d’adhésif (voir le tableau des matériaux ; Figure 2I).
8. Pour prévenir l’inflammation, l’infection et soulager la douleur et l’inconfort post-chirurgicaux, appliquez un mélange d’érythromycine et de pommade au diclofénac de sodium dans un rapport de 1:1 (voir le tableau des matériaux) sur la plaie. Transférez les souris dans un coussin chauffant isotherme pour la récupération.
9. Enregistrez la durée du réflexe de redressement, qui commence lorsque la souris est retirée de l’appareil stéréotaxique et placée latéralement sur la plate-forme de l’impacteur pour FPI et se poursuit jusqu’à ce que la souris puisse se tenir debout de manière indépendante.
10. Une fois que la souris a retrouvé sa vigilance et sa conscience, retournez-la dans sa cage d’origine. Les souris sont généralement pleinement conscientes et capables de marcher dans les 1,5 heures suivant la blessure.
11. Dans les jours qui suivent la modélisation d’un traumatisme crânien, observez les souris à la recherche de divers signes, notamment des schémas respiratoires, la présence de mucus autour du nez et de la bouche, ainsi que des rougeurs, un gonflement, des exsudats ou une réouverture de la zone de la plaie. Exclure de l’étude les animaux présentant un ou plusieurs des symptômes anormaux ci-dessus.
    REMARQUE : La pré-micro-injection d’AAV-GCaMP6s permet d’observer l’homéostasie neuronale sous-jacente du Ca2+ et l’excitabilité dans le cortex lésé à travers la fenêtre du crâne aminci à l’aide de la microscopie à balayage laser à deux photons¹⁵.

5. Test du labyrinthe aquatique Morris (MWM)

REMARQUE : Le MWM (voir la table des matériaux) est une méthode largement reconnue pour évaluer l’apprentissage spatial et les déficits de mémoire chez les souris après un traumatisme crânien.

1. Effectuez le test MWM à partir de 7 jours après la blessure (DPI). La piscine circulaire du MWM avait un diamètre de 120 cm et une hauteur de 50 cm, avec une température de l’eau maintenue à 25 °C. Séparez la piscine circulaire en quatre quadrants, avec la plate-forme d’évacuation, une plate-forme ronde d’un diamètre de 6 cm et d’une hauteur de 30 cm, immergée à 1 cm sous la surface de l’eau dans le quadrant nord-est.
2. Positionnez une caméra directement au-dessus du bassin circulaire pour enregistrer la trajectoire du mouvement des souris. Marquez les souris avec du ruban adhésif noir sur le dos pour faciliter la reconnaissance par le logiciel d’acquisition d’images et pour l’enregistrement des données, y compris la latence, la distance de nage et la trajectoire de mouvement.
3. Placez les souris dans l’eau, face à la paroi intérieure de chacun des quatre quadrants, une fois pour chaque quadrant. Une fois que les souris ont trouvé la plate-forme, laissez-les s’y reposer pendant 10 secondes. Si une souris ne parvient pas à trouver la plate-forme dans les 60 s, demandez à l’opérateur de guider la souris vers la plate-forme, laissez-la se reposer sur la plate-forme pendant 10 s, puis renvoyez la souris dans sa cage d’accueil pour se reposer.
4. Répétez l’essai d’acquisition 4 fois par jour pour chaque souris. Après les essais d’acquisition, sur 12 DPI, effectuez une expérience de sonde spatiale de 60 s et enregistrez le nombre de fois que les souris ont traversé la zone de la plate-forme d’origine et la durée du séjour de la souris dans le quadrant où se trouvait la plate-forme.
5. Après chaque essai, séchez rapidement les souris avec une serviette ou placez-les sous une lampe chauffante pour maintenir leur température corporelle et prévenir l’hypothermie pendant l’essai d’acquisition de 60 secondes de DPI 7 à DPI 11.
6. Après l’achèvement des procédures expérimentales décrites ci-dessus, anesthésez les souris avec du pentobarbital (45 mg/kg, i.p.) à 13 DPI. Perfusion d’une solution saline isotonique par voie transcardique, suivie d’une perfusion avec 4 % de paraformaldéhyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,2). Récupérer les cerveaux pour une coloration HE conventionnelle afin d’évaluer les altérations macroscopiques de la morphologie corticale et hippocampique. Une description détaillée du protocole de coloration de l’HE peut être trouvée dans des publications antérieures^13,15.
7. Une fois toutes les expériences terminées, euthanasier la souris par injection de pentobarbital surdosé (≥100 mg/kg, i.p.) s’il n’y a pas besoin d’échantillons de souris. Avant de prélever des tissus ou de disposer de la carcasse, surveillez la souris jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de battements cardiaques pendant au moins 60 secondes.

Résultats

Le protocole décrit dans cette étude décrit une méthode pour induire un TCLr à travers une fenêtre crânienne amincie, qui offre une solution aux lésions cérébrales causées par la préparation de la craniotomie lors de la modélisation conventionnelle du TCC par percussion. En utilisant cette procédure de percussion fluide modifiée avec le dispositif modifié, une précision et une reproductibilité améliorées de l’impact FPI ont été obtenues¹³. L’impacteur modifié a la polyvalence d’être utilisé à la fois pour la modélisation CHI et FPI, avec ou sans craniotomie du crâne. De plus, la gravité de la blessure est modulée en ajustant les paramètres de la blessure, tels que l’angle de chute du pendule d’impact, ou en ajoutant des coussinets supplémentaires en mousse d’éthylène-acétate de vinyle à cellules fermées de dureté variable à la plaque d’extrémité du pôle de piston.

Le modèle modifié de TCLr offre des avantages significatifs, tels que la production d’une pathologie focale et diffuse sans exposer la durale corticale, ce qui minimise l’inflammation due à l’exposition à la méningée et/ou au FPI direct sur le parenchyme. De plus, ce modèle réduit les variations d’épaisseur et de forme de l’os du crâne pour produire des résultats fiables en matière de blessures. Par conséquent, le modèle modifié de TCLr est efficace et fiable pour simuler des déficits neuropathologiques et comportementaux liés aux symptômes post-commotionnels (SPC) cliniquement pertinents à différents degrés de blessure. En particulier, ce modèle est utile pour étudier les mécanismes pathologiques des TCC qui reposent sur la précision et la reproductibilité des modèles TCC animaux, en particulier pour étudier les mécanismes légers liés aux TCC.

La branche latérale frontale de l’artère cérébrale moyenne de la souris et de la veine raine caudale¹⁹, située sous le crâne aminci, permettait une visualisation claire sous la caméra. Après deux percussions rmTBI, chacune à une pression d’environ 2,0 atm, toutes les souris ont présenté des hématomes sous-duraux à 0 DPI. Bien que l’intégrité du crâne aminci ne semble pas être compromise ; cependant, une réduction du nombre de microvaisseaux a été observée parallèlement à des changements dans la morphologie des microvascularisations (figure 2H), comme indiqué précédemment¹⁵. À 2 DPI, les hématomes se sont en grande partie résorbés. La mortalité résulte principalement d’un impact alors que la souris est sous anesthésie profonde, ce qui peut prolonger considérablement l’apnée. L’évaluation régulière de la profondeur de l’anesthésie avant l’impact par les réflexes de retrait palpébral et de la patte peut réduire considérablement la mortalité. D’autres facteurs peuvent avoir un impact sur les taux de mortalité après une percussion fluide, notamment la tension de la souris, la dureté du crâne, le sexe et l’âge. Dans une étude précédente utilisant le même protocole rmTBI, une souris C57BL/6J était morte¹⁵. Dans ce protocole, seules des souris ICR mâles ont été utilisées pour introduire l’ensemble des procédures.

Des études humaines et animales ont montré que même des impacts répétitifs à la tête peuvent provoquer des lésions microstructurelles généralisées de la substance blanche 20,21,22, qui sont associées à de moins bonnes performances cognitives ^21,22. À 7-12 DPI, les TCLr peuvent produire des déficiences de l’apprentissage spatial et de la mémoire, qui ont été examinées à l’aide du paradigme MWM. La figure 4 illustre les résultats obtenus à partir de cette évaluation.

L’analyse du dernier essai d’acquisition dans le MWM a démontré une augmentation significative (p< 0,05) de la latence des souris rmTBI pour atteindre la plate-forme immergée, par rapport au groupe témoin. Dans l’essai de sonde, l’analyse du pourcentage de temps passé dans le quadrant de la plate-forme d’origine a démontré une réduction significative (p<0,01) dans le groupe TCLr par rapport au groupe témoin, indiquant un déclin des capacités d’apprentissage par référence spatiale et de mémoire chez les souris atteintes de TCLr.

La méthode décrite ici a été utilisée dans une publication antérieure¹⁵ utilisant les souris C57BL/6J. Outre le MWM, trois analyses supplémentaires ont été effectuées, comme décrit ci-dessous.

L’OFT a été utilisé pour évaluer les capacités de locomotion et d’exploration en mesurant la vitesse moyenne de déplacement, la distance totale parcourue et le pourcentage de la distance parcourue dans les zones centrales. Effectuez un test en champ libre (OFT) à 6 DPI pour évaluer la locomotion, l’exploration et l’anxiété chez la souris. L’appareil d’essai mesurait 40 x 40 x 40 cm, qui a été divisé en 16 zones (chacune mesurant 18 x 18 cm). La souris a été placée au centre de l’appareil et a été autorisée à explorer librement pendant 5 min. L’enregistrement de la distance parcourue dans les 4 zones centrales, de la distance totale parcourue, de la vitesse moyenne de déplacement et du temps passé dans les zones frontalières a été effectué. Les niveaux d’anxiété ont été évalués en fonction du pourcentage de distance parcourue dans les zones centrales et du temps passé par les rongeurs dans les zones limitrophes pendant une période d’observation de 5 minutes. À 6 DPI, le rmTBI peut ne pas avoir d’impact significatif sur les capacités locomotrices générales des souris, il peut induire une anxiété significative et modifier le comportement exploratoire, comme le montre la figure 4¹⁵. De plus, le modèle modifié de TCLr induit des lésions axonales diffuses, qui peuvent être évaluées par des tests comportementaux supplémentaires, tels que le test d’aptitude cognitive décrit dans ce protocole.

Il a été démontré que le TCL altère le travail spatial et la mémoire de référence chez la souris, comme l’illustre la figure 5^{à 15}. Ces fonctions cognitives ont été évaluées à l’aide du test Y-maze. Le test a été effectué à 8 DPI pour mesurer les déficits de mémoire de travail à court terme chez la souris. Pour un comportement d’alternance spontanée : un dispositif de labyrinthe en Y en acrylique (20 cm de haut, 50 cm de long et 10 cm de large en bas) a été utilisé. Après avoir placé la souris au centre de l’appareil et lui avoir permis d’explorer pendant 8 minutes, les entrées du bras ont été enregistrées. Le comportement d’alternance spontanée est défini comme l’entrée successive de la souris dans les trois bras sur des ensembles de triplets. Calculez le taux d’alternance spontanée (%) comme suit (séries de triplets successives / nombre total d’entrées de bras moins 2) x 100. Pour la mémoire de référence spatiale, pendant l’entraînement de 8 minutes, fermez de manière aléatoire un bras du dispositif Y-maze. Après 1 h après l’exposition initiale, la souris est réintroduite dans le labyrinthe avec les trois bras ouverts et lui permet d’explorer librement pendant 3 min. Le temps passé à explorer le nouveau bras par rapport aux deux autres bras est enregistré. Calculez l’indice de préférence en fonction du temps passé dans le nouveau bras par rapport au temps passé dans les trois bras.

De plus, nous suggérons d’évaluer les lésions structurelles macroscopiques dans le cerveau à l’aide d’une simple coloration HE (Figure 6)¹⁵ après avoir terminé tous les tests comportementaux. Utilisez la région corticale sectionnée coronalement de 1 mm en avant du site de la lésion jusqu’au bord postérieur de la lésion, et la région de l’hippocampe sectionnée coronairement à la zone typique en forme de croissant (Bregma : -1,7 à -2,2 mm). Le comptage des neurones dans chaque lame à partir de six champs aléatoires à l’aide d’une grille oculaire (grossissement de 400x) et la moyenne du nombre neuronal ont fourni la densité numérique par champ visuel (densité numérique). Les régions cérébrales touchées par le TCLr présentaient des degrés variables de lésions neuronales¹⁵. Plus précisément, le cortex moteur a démontré une étendue plus puissante et plus variée de telles lésions que l’hippocampe. La coloration HE a montré un changement considérable vers la morphologie pynotique à partir des neurones normaux (Figure 6A, B, E, F). De plus, on a observé que la matrice extracellulaire se relâche spécifiquement dans la région de la lésion (Figure 6F). Outre les zones relâchées de la matrice observées, les souris rmTBI ont également montré une augmentation significative de la coloration hyperchromique, vue comme une couleur rouge plus foncée, dans un nombre significatif de neurones subgranulaires dans le gyrus denté et certains neurones corticaux et CA1. Curieusement, ces motifs de coloration ne présentaient aucun signe d’accompagnement de rétrécissement cytoplasmique ou de noyau pycnotique (Figure 6C, D, G, H, K⁾¹⁵. Les méthodes de coloration comportementale (à l’exception du test WMM) et HE mentionnées ci-dessus ont été détaillées dans une publication récente, qui a introduit le modèle modifié rmTBI¹⁵.

Figure 1 : Périphérique FPI modifié et capture d’écran du logiciel. (A) Le dispositif FPI modifié. (B) La capture d’écran affiche la forme d’onde de pression FPI ainsi que la mesure et l’exportation automatiques des paramètres de pression d’impact en temps réel tels que le temps de montée, le temps de descente et la durée à mi-largeur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Le modèle murin modifié de TCLr chez les souris ICR. (A) Une incision médiane est pratiquée pour exposer la zone chirurgicale. (B) Une fenêtre crânienne amincie a été fabriquée sur le cortex moteur. La clarté des micro-vaisseaux corticaux exposés est utilisée pour déterminer l’épaisseur du crâne. (C) L’épaisseur du crâne peut également être vérifiée en sondant doucement le crâne aminci avec la pointe aplatie d’une aiguille de seringue fine et en évaluant sa douceur. (D) La Luer Lock femelle a été collée à la fenêtre du crâne aminci. (E) Le Luer Lock femelle attaché a été fixé par l’application du ciment dentaire. (F) La profondeur de l’anesthésie a été surveillée en vérifiant les réflexes de retrait palpébral et de la patte. (G) L’impact du FPI a été émis après le retour d’un réflexe de retrait à un pincement de patte. (H) Image post-rmTBI de la fenêtre du crâne aminci à 0 DPI. (I) Le cuir chevelu a été suturé avec un adhésif tissulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Les effets du rmTBI sur l’apprentissage des références spatiales et la mémoire chez les souris ICR. (A) La trace de navigation des souris lors du dernier essai d’acquisition enregistrée à 11 DPI, (B) l’itinéraire spatial de la sonde dans l’essai de sonde enregistré à 12 DPI, et (C) le temps d’évasion qu’il a fallu aux souris pour localiser la plate-forme lors du dernier essai d’acquisition. Les résultats ont révélé que le groupe TCLr a mis beaucoup plus de temps à atteindre la plate-forme cachée que le groupe témoin (p<0,05). (D) Le pourcentage de temps passé par les souris dans le quadrant de la plate-forme d’origine par rapport au temps de navigation total pendant l’essai de la sonde était significativement plus faible dans le groupe rmTBI que dans le groupe témoin (p<0,01). n = 8. *p<0,05, **p<0,01 par rapport au contrôle par test t non apparié. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Les effets du TCLr sur la locomotion, l’exploration et l’anxiété chez les souris C57BL/6J. (A) Traces représentatives du mouvement des souris témoins et rmTBI pendant 5 min OFT. (B-E) Les données résumées montrent la distance parcourue dans les zones centrales, la distance totale parcourue, la vitesse moyenne de déplacement et le temps passé dans les zones périphériques, respectivement. Contrôle, n = 13 ; TCCr, n = 12. p<. 01 par rapport au contrôle par test t non apparié. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Les effets du rmTBI sur le travail spatial et la mémoire de référence chez les souris C57BL/6J. (A, B) Traces représentatives de contrôle et de mouvement des souris rmTBI pendant le travail spatial et les évaluations de la mémoire de référence dans le labyrinthe Y. Le test d’alternance spontanée du labyrinthe en Y est une méthode couramment utilisée pour évaluer la mémoire à court terme dans les modèles de rongeurs¹⁵. (C) Résumé des taux d’alternance spontanée des souris témoins et des souris TCLC pendant l’évaluation du travail spatial. Les rongeurs préfèrent généralement explorer un nouveau bras du labyrinthe plutôt que de revisiter un qu’ils ont déjà exploré. Un indice de préférence est calculé en fonction du temps passé par les rongeurs dans le nouveau bras par rapport au temps passé dans les trois bras, et cet indice est ensuite analysé. (D) Résumé de l’indice de préférence des souris témoins et des souris TCLC lors de l’évaluation du travail spatial. Contrôle, n = 13 ; TCCr, n = 12. p<. 01 par rapport au contrôle par test t non apparié. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Comparaison de la coloration HE du cortex moteur lésé ipsilatéralement et de la sous-région du gyrus denté de l’hippocampe entre le contrôle et le rmTBI chez les souris C57BL/6J. (A, B) Cortex moteur normal ; et (C, D) la région de l’hippocampe des souris témoins dans différentes grossissements. (E, F) Lésions du cortex moteur et de l’hippocampe (G, H) chez les souris rmTBI. Les neurones hyperchromes du cortex et du CA1 peuvent avoir été légèrement affectés par la préparation chirurgicale ou un TCL prolongé ; cependant, des neurones hypochromes (peut-être endommagés intermédiaires) et pycnotiques (neurones apoptotiques) ont été observés dans le cortex moteur des souris TCL par rapport aux neurones normaux chez les souris témoins. Ces caractéristiques de l’apoptose neuronale comprenaient un rétrécissement du cytoplasme neuronal et du noyau, accompagné d’une vacuolisation apparente. Notamment, la ligne blanche de démarcation en (E) représente la limite entre le tissu lésé et le tissu environnant. De plus, les neurones hyperchromes de la sous-région DG (H) se référaient peut-être à des neurones granulaires immatures et matures nouvellement générés. Les graphiques à barres ci-dessous montrent la distribution des neurones normaux et affectés par un TCLr dans les sous-régions (I) du cortex moteur et de l’hippocampe (J) CA1 et (K) DG. Contrôle, n = 13 ; rmTBI, n = 12, ***p<. 001 par rapport au contrôle par test t non apparié. Ce chiffre a été modifié au lieu de¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les traumatismes crâniens se réfèrent à deux types principaux, fermés et pénétrants, ce dernier se caractérisant par une perturbation du crâne et de la dure-mère. Les données cliniques suggèrent que les ICH sont plus fréquents que les lésions pénétrantes ^1,2. Après un seul traumatisme crânien léger, la plupart des patients présentent des symptômes du SPC qui disparaissent généralement dans un court laps de temps, et il existe une controverse concernant la proportion de patients dont le SCP se transforme en séquelles à long terme^23,24. Par conséquent, les chercheurs se sont concentrés sur les modèles d’CHI répétitifs afin de mieux comprendre les effets cumulatifs des commotions cérébrales multiples²⁵, qui se produisent couramment lors de chutes, d’accidents de la route et de sports de contact. Ces impacts répétés peuvent entraîner des effets plus graves et à long terme^26,27. En utilisant des modèles CHI répétitifs, les chercheurs peuvent explorer les effets additifs ou synergiques potentiels de plusieurs commotions cérébrales et mieux comprendre les mécanismes sous-jacents qui contribuent au SCP. De tels modèles peuvent faciliter l’élaboration d’interventions thérapeutiques ciblées pour atténuer les conséquences à long terme des impacts répétés à la tête.

Bien que certains modèles CHI tentent de simuler à la fois un seul foyer et un TCLC en incorporant à la fois des forces linéaires et de rotation, ces modèles peuvent entraîner des lésions de rebond et des imprécisions dans la gravité des blessures en raison de facteurs tels que la fracture du crâne, la morphologie et l’épaisseur du crâne, l’apnée animale prolongée¹⁰ et la variabilité des paramètres d’entrée mécanique, en particulier lorsque le mouvement de rotation de la tête est incorporé⁹. Les méthodes d’impact et de chute de poids contrôlées par piston sont couramment utilisées pour induire un TCL dans des modèles animaux de CHI²⁵. L’impact contrôlé par piston permet un réglage précis et réglable des paramètres d’impact grâce à l’utilisation de dispositifs d’impact à entraînement électromagnétique ou pneumatique, permettant ainsi une reproductibilité élevée des chocs. Cependant, l’utilisation d’un impact contrôlé par piston, que ce soit sur le cortex exposé comme dans le CCI ou sur le crâne fermé, nécessite toujours une immobilisation stricte de la tête de l’animal dans un cadre stéréotaxique lors de l’impact. À l’inverse, les méthodes de perte de poids nécessitent des matériaux simples et rentables qui sont faciles à installer, mais le compromis est une variabilité assez élevée de la gravité de la blessure²⁵.

Le modèle FPI induit généralement des lésions focales et diffuses mixtes, ce qui permet la fabrication de TCC de gravité variable. Malgré ses avantages, le modèle FPI présente également des limites potentielles. Comme le modèle CCI, le FPI nécessite toujours une craniotomie, une intervention chirurgicale qui peut induire une inflammation du tissu cérébral¹⁷. De plus, même un FPI léger pénètre fréquemment dans la dure-mère à des profondeurs variables, ce qui peut introduire des confusions dans l’interprétation des données. Ainsi, les modèles CCI et FPI ont des limites pour reproduire les caractéristiques cliniques observées chez les patients TCC légers⁹. Par conséquent, nous présentons un protocole qui combine les méthodes de la fenêtre du crâne aminci et du FPI, qui peuvent être utilisées pour produire un modèle murin plus précis de rmTBI associé à CHI. L’objectif de ce protocole est de refléter étroitement les caractéristiques cliniques des patients atteints de TCC léger. Un modèle hautement reproductible serait un outil inestimable pour étudier les mécanismes sous-jacents à la physiopathologie des traumatismes crâniens légers et évaluer les interventions thérapeutiques potentielles.

Les résultats de notre recherche sur les TCCr s’alignent sur les publications précédentes qui utilisaient des fenêtres crâniennes amincies pour les investigations de TCC légers^28,29. Par exemple, Ren et al. ont créé une fenêtre crânienne amincie d’une épaisseur d’environ 30 μm dans le cortex d’association pariétale gauche, induisant un léger traumatisme crânien en appuyant doucement sur la fenêtre à l’aide d’une extrémité émoussée d’un diamètre de 1 mm provenant d’un instrument stéréotaxique chirurgical²⁹. Leur étude a montré une expansion notable de la mort cellulaire et de l’expression des espèces oxydatives réactives (ROS) dans le cortex lésé²⁹. Pour étudier le TCLr, Nguyen et al. ont appliqué trois CCI avec une pointe d’impacteur modifiée (pointe ronde en silicone de 3 mm de diamètre et de 1,5 mm d’épaisseur) sur une fenêtre crânienne amincie de souris (20 à 40 μm d’épaisseur) dans le cortex d’association pariétale²⁸. Pour protéger et maintenir la transparence de la zone du crâne aminci pour l’imagerie à long terme, ils ont recouvert la fenêtre du crâne aminci d’une fine couche de colle cyanoacrylate. Les trois CCI ont été réalisés une fois par semaine pendant 3 semaines, avec des paramètres d’impact de 4 m/s de vitesse et 2 mm de profondeur. À la suite des trois CCI, les souris ont montré une astrogliose évidente et une activation microgliale²⁸. Étant donné que l’utilisation de la fenêtre crânienne amincie comme modèle pour les TCC légers/TCL est relativement récente, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour examiner la relation entre la gravité/progression des blessures et les différentes techniques d’impact. Par exemple, dans une étude précédente, nous avons pu observer des changements évidents dans la morphologie cellulaire après deux FPI administrés avec un intervalle de 2 jours¹⁵. Pendant ce temps, dans d’autres études, une seule compression douce de la fenêtre du crâne aminci a induit un léger TCC avec une mort cellulaire évidente et une expression réactive des espèces oxydatives²⁹, et trois CCI hebdomadaires ont entraîné une astrogliose robuste et une activation microgliale²⁸.

Il faut procéder prudemment à plusieurs étapes pour fabriquer un modèle de dommage cohérent à l’aide de la méthode décrite. Au cours de l’opération de la fenêtre du crâne aminci, en fonction de différentes zones cibles (par exemple, nous nous sommes concentrés sur le cortex moteur), la tête de la souris doit être fixée dans un cadre stéréotaxique au niveau horizontal ou à un léger angle latéral vers le côté opposé de la fenêtre du crâne aminci dans ce protocole. Ce positionnement spécifique peut faciliter la création de la fenêtre crânienne amincie dans la zone correspondant au cortex moteur. Le placement précis des barres d’oreille est l’un des aspects les plus difficiles de cette procédure, et cela peut prendre du temps et de la pratique pour le maîtriser. Avant de tenter l’opération de la fenêtre du crâne aminci ou d’induire un CHI, il est essentiel de s’assurer que le crâne est de niveau. Si le crâne n’est pas positionné correctement, la tête doit être ajustée en conséquence. En raison de la forme et de l’épaisseur inégales de l’os du crâne, la croissance du crâne est variable même au sein d’un os spécifique.^Il est essentiel d’ajuster le positionnement de la tête avant d’entreprendre la procédure de fenêtre de crâne amincie ou CHI. Ne pas le faire augmente le risque de fractures du crâne, ce qui peut avoir un impact significatif sur la précision et la fiabilité du CHI. Pour des conseils plus complets sur la procédure de la fenêtre du crâne aminci, reportez-vous au protocole décrit par Guang et ^al.14.

Le choix de la zone de modélisation des traumatismes crâniens varie d’un chercheur à l’autre en fonction de son objet de recherche. Étant donné la variabilité significative de l’emplacement réel de la blessure dans le CHI, bien que la plupart des études indiquent que le site d’impact est situé au centre entre le bregma et le lambda, il est recommandé de varier le lieu d’impact dans les études expérimentales futures, comme l’indique une revue des modèles animaux de CHI²⁵. Pour valider le modèle modifié de blessure du crâne aminci CHI, nous vous recommandons de commencer par le cortex moteur, comme décrit dans ce protocole. Le TCL peut causer des lésions du cortex moteur focal, qui peuvent être facilement évaluées à l’aide d’approches d’évaluation locomotrice telles que l’OFT dans ce protocole. L’incision pratiquée au cours de cette procédure nécessite du temps pour guérir, ce qui peut potentiellement déclencher une réponse immunitaire périphérique, introduisant finalement une variabilité dans l’expérience. Pour minimiser le risque d’inflammation, d’infection et de douleur et d’inconfort post-chirurgicaux, nous recommandons d’appliquer une pommade topique contenant une combinaison d’érythromycine et de diclofénac de sodium sur la plaie. Cette approche s’est avérée efficace pour réduire l’inflammation et la douleur associées aux interventions chirurgicales chez les animaux.

Le protocole de percussion fluide à base de crâne aminci est une méthode prometteuse pour modéliser le TCLr chez les rongeurs, car il réduit l’inflammation généralement causée par l’exposition des méninges au FPI. Cette technique, présentée dans la fenêtre du crâne aminci, peut générer efficacement un PCS cliniquement pertinent à des degrés divers, offrant une alternative potentielle pour les chercheurs qui étudient les TCLr. De plus, la fenêtre crânienne amincie facilite l’observation de l’homéostasie Ca²⁺ et de l’hyperexcitabilité neuronale dans le cortex in vivo¹⁵. L’utilisation de cette technique peut améliorer notre compréhension des mécanismes sous-jacents de la progression du SPC à court/modéré/long terme, améliorant ainsi la capacité de prédire son développement et de développer des traitements thérapeutiques plus efficaces.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
75 % d’éthanol	Shandong XieKang Medical Technology Co., Ltd.
Chlorhydrate de buprénorphine	Tianjin Pharmaceutical Research Institute Pharmaceutical Co., Ltd	Solution H12020272	, Carprofène analgésique
	Shanghai Guchen Biotechnology Co., Ltd	53716-49-7	Poudre,
Digluconate de chlorhexidine	Shanghai Macklin Biochemical Co., Ltd.	18472-51-0	Solution aqueuse à 19 %-21 %,
kit de ciment et de solvant dentaire	Shanghai New Century Dental Materials Co., Ltd.	20220405, 3#	Poudre reconstituée dans le miroir de dissection à solvant correspondant
	Shenzhen RWD Life Science Inc.	77019
Pommade à l’érythromycine  ;	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	220412
source de lumière froide à fibre optique	Shenzhen RWD Life Science Inc.	F-150C
Micro-foret à pointe plate  ;	Shenzhen RWD Life Science Inc.	HM31008	en acier de 2 mm
	Jiaxing Bocom Biotech Inc.	Biocom Animal Brain Impactor V1.0
ICR souris	Jinhua Laboratory Animal Center  ;   ;	Stock#2023091	25 Souris mâles, 25-30g, 8 semaines
Isoflurane	Shandong Ante Animal Husbandry Technology Co., Ltd.  ;
Coussin chauffant isotherme  ;	Wenzhou Repshop Pet Products Co., Ltd.  ;
Luer Loc hup			Fabriqué sur mesure à l’aide d’un embout d’aiguille 19G
Perceuse crâne à main Micro	Shenzhen RWD Life Science Inc.	78001	Max : 38 000 tr/min
Dispositif FPI modifié	Jiaxing Bocom Biotech Inc.
Labyrinthe aquatique Morris	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63031	Évaluer les capacités d’apprentissage spatial et de mémoire
Champ ouvert	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63008	Evaluer la locomoation et l’anxiété
de la souris Lubrifiant ophtalmique  ;	Suzhou Tianlong Pharmaceutical Co., Ltd.
Pommade au diclofénac de sodium	Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Co., Ltd.	221207	anti-inflammatoire non stéroïdien
Système d’anesthésie pour petits animaux - Amélioré  ;	Shenzhen RWD Life Science Inc.	R530IP
Système de suivi vidéo intelligent	Panlab Harvard Apparatus Inc., MA, USA	V3.0	Suivi et analyse des animaux
Cadre stéréotaxique  ;	Shenzhen RWD Life Science Inc.	68043
Vetbond Tissue Adhesive	3M, St Paul, MN, USA	202402AX	Suture la plaie animale
Y maze	Shenzhen RWD Life Science Inc.	63005	Évaluation de la mémoire de travail spatiale de la souris