Nous décrivons un protocole d’extraction de noyaux de haute qualité à partir de cellules souches pluripotentes induites cryopréservées, de types de cellules stromales/endothéliales et de cellules sanguines dérivées de cellules souches pluripotentes induites afin de soutenir les analyses de séquençage de nouvelle génération à noyau unique. La production de noyaux intacts de haute qualité est impérative pour les expériences multiomiques, mais peut constituer une barrière à l’entrée sur le terrain pour certains laboratoires.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Isolement nucléaire à partir de cellules sanguines dérivées in vitro cryoconservées
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les modèles basés sur les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont d’excellentes plateformes pour comprendre le développement du sang, et les cellules sanguines dérivées d’iPSC ont une utilité translationnelle en tant que réactifs d’essais cliniques et thérapies cellulaires transfusables. L’avènement et l’expansion de l’analyse multiomique, y compris, mais sans s’y limiter, le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNAseq) et le dosage de la chromatine accessible à la transposase (snATACseq), offre le potentiel de révolutionner notre compréhension du développement cellulaire. Cela inclut la biologie du développement à l’aide de modèles hématopoïétiques in vitro . Cependant, il peut être techniquement difficile d’isoler des noyaux intacts à partir de cellules cultivées ou primaires. Différents types de cellules nécessitent souvent des préparations nucléaires adaptées en fonction de la rigidité et du contenu cellulaires. Ces difficultés techniques peuvent limiter la qualité des données et constituer un obstacle pour les chercheurs intéressés à poursuivre des études multiomiques. La cryoconservation des échantillons est souvent nécessaire en raison des limites de la collecte et/ou du traitement des cellules, et les échantillons congelés peuvent présenter des défis techniques supplémentaires pour l’isolement nucléaire intact. Dans ce manuscrit, nous proposons une méthode détaillée pour isoler des noyaux de haute qualité à partir de cellules dérivées d’iPSC à différentes étapes du développement hématopoïétique in vitro pour une utilisation dans les flux de travail multiomiques à noyau unique. Nous avons axé le développement de la méthode sur l’isolement de noyaux à partir de cellules stromales/endothéliales adhérentes dérivées d’iPSC et de cellules progénitrices hématopoïétiques non adhérentes, car celles-ci représentent des types de cellules très différents en ce qui concerne l’identité structurelle et cellulaire. Les étapes de dépannage décrites ont limité l’agglutination et les débris nucléaires, ce qui a permis de récupérer des noyaux en quantité et en qualité suffisantes pour les analyses en aval. Des méthodes similaires peuvent être adaptées pour isoler des noyaux d’autres types de cellules cryoconservées.
Introduction
L’hématopoïèse est un système de développement relativement bien caractérisé, mais une incapacité à récapituler la formation des cellules sanguines in vitro démontre une compréhension incomplète des facteurs connexes. Les modèles d’hématopoïèse basés sur des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) peuvent aider à élucider les principaux facteurs de développement et la biologie associée. Le système iPSC offre également un excellent modèle pour étudier les troubles sanguins, et des cellules sanguines basées sur les iPSC ont été développées pour produire des réactifs pertinents sur le plan translationnel et thérapeutique....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Cryoconservation des cellules
- Congeler >1 x 106 cellules isolées dérivées d’iPSC par mL dans 1 mL de 90 % de FBS et de 10 % de DMSO. Placez les cryoflacons dans un récipient de congélation à -80°C pour réduire la vitesse de congélation et optimiser la récupération des cellules viables (Tableau des matériaux). Anticipez une perte cellulaire considérable, qui peut varier en fonction des conditions de culture et de l’identité cellulaire.
- Passez de -80 °C à un stockage d’azote liquide dans les 24 h.
2. Décongélation des cellules
- Récupérer le cry....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Nous avons utilisé le protocole susmentionné pour extraire des noyaux de cellules stromales/endothéliales adhérentes dérivées d’iPSC cryopréservées et de cellules progénitrices hématopoïétiques non adhérentes (flottantes). Une représentation schématique détaillée de la procédure d’isolement nucléaire se trouve à la figure 1.
Pour l’examen morphologique, des noyaux isolés ont été colorés au bleu trypan et visualisés au microscope. L’examen morphologique nucléaire e.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Étapes critiques du protocole
L’isolement de noyaux de haute qualité est essentiel pour la mise en œuvre réussie des modalités actuelles de séquençage de nouvelle génération basées sur un noyau unique, qui évoluent rapidement. Compte tenu des obstacles existants pour les laboratoires intéressés par ces approches, en particulier pour les échantillons cryoconservés, notre intention était de mettre au point une technique d’isolement nucléaire adaptée aux cellules préalablement congelées. L’isolement des .......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient Jason Hatakeyama (10x Genomics) et Diana Slater (Children’s Hospital of Philadelphia Center for Applied Genomics) pour leurs conseils et leurs suggestions. Cette étude a été soutenue par les National Institutes of Health (HL156052 à CST).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Solution <>Réactifs de Culture Cellulaire | |||
| Solution de Diméthylsulfoxyde de Diméthyle (DMSO) | Sigma | 673439 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Corning | 21031CV | |
| Sérum de Bovin Fœtal (FBS) | GeminiBio | 100106 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875093 | |
| Cellules | |||
| Cellules souches pluripotentes induites | N/A | N/A | Les iPSC utilisées dans cette étude ont été obtenues par l’intermédiaire de l’installation centrale de cellules souches pluripotentes humaines CHOP |
| Cell Staining Reagents ; | |||
| Trypan Blue Solution | Corning | 25900CI | |
| strong>Réactifs d’élimination des cellules mortes | |||
| Chlorure de calcium (CaCl2) | Sigma | C4901 | |
| EasySep Dead Cell Removal (Annexin V) Kit | StemCell Technologies | 17899 | Ce kit est conçu pour l’épuisement des types de cellules indésirables marquées à la biotine. Le kit comprend un cocktail d’élimination des cellules mortes (Annexin V), un cocktail de sélection de biotine et des billes de Dextran. Ce kit cible la phosphatidylsérine sur le feuillet externe de la membrane cellulaire des cellules apoptotiques à l’aide de l’annexine V. Les cellules indésirables sont marquées avec de l’annexine V, des anticorps biotinylés et des particules magnétiques, et séparées sans colonnes à l’aide d’un aimant EasySep. Les cellules souhaitées sont simplement versées dans un nouveau tube. |
| Matériaux | |||
| 10 & micro ; l Micropipette | Wards science | 470231606 | |
| 100 & micro ; l Micropipette | Wards science | 470231598 | |
| 1000 & micro ; l Embout universel étendu | Oxford Lab Products | OAR-1000XL-SLF | |
| 1000 & micro ; l Micropipette | Wards science | 470231602 | |
| 2,0 ml Flacons cryogéniques | Corning | 431386 | |
| 20 µ ; l Micropipette | Wards science | 470231608 | |
| 200 & micro ; l Micropipette | Wards science | 470231600 | |
| 5ml Tube à fond rond en polystyrène | Falcon | 352063 | |
| Corning DeckWork 0.1-10 µ ; l Station de pointe de pipette | Corning | 4143 | |
| Corning DeckWork 1-200 µ ; l Station de pointe de pipette | Corning | 4144 | |
| Chambre de comptage | CytoSMART | 699910591 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 & micro ; m ; | Bel-Art | H136800040 | |
| Magnet | StemCell Technologies | 18000 | |
| NALGENE Cryo 1° ; C Conteneur de congélation | Nalgene | 51000001 | |
| Nuclei comprennent un tampon de lyse, ; Tampon de lavage, tampon de noyaux dilués et tampon de dilution de lyse. La constitution de ces zones tampons est présentée dans les tableaux 1, 2 et 3. Notre méthode d’isolement des noyaux a amélioré l’isolement par rapport aux protocoles de kit standard (par exemple, 10x Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide [CG000338]). Ce protocole peut être utilisé avec plusieurs kits commerciaux, y compris le Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression Reagent Bundle, 16 rxns (PN-1000283). | |||
| Kit d’élimination des cellules mortes | STEMCELL | 17899 | |
| Digitonin | Thermo Fisher Scientific | BN2006 | |
| DL-Dithiothreitol solution (DTT) | Sigma | 646563 | |
| Flowmi Cell Strainer, 40 µ ; m | Bel-Art | H136800040 | |
| MACS solution d’albumine sérique bovine (BSA) Solution | Miltenyi Biotec | 130091376 | |
| magnésium (MgCl2) | Sigma | 7786303 | |
| Chlorure de magnésium Solution, 1 M | Sigma | M1028 | |
| Nonidet P40 Substitut | Sigma | 74385 | |
| Sans nucléase | Eau Thermo Fisher Scientific | AM9937 | |
| Tampon de noyaux (20X) | 10X Genomics | 2000153 | |
| Protector Inhibiteur de RNase | Sigma | 3335399001 | |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sigma | S7653-250G | |
| Solution de chlorure de sodium, 5 M | Sigma | 59222C | |
| Chlorhydrate de Trizma Soultion, pH 7,4 | Sigma | T2194 | |
| Chlorhydrate de Trizma (Tris-HCl) (pH7.4) | Sigma | T3252-500G | |
| Tween 20 | Bio-Rad | 1662404 | |
| Autre équipement | |||
| Compteur de cellules automatisé | CytoSMART | 699910591 | |
| Microscope | Zeiss | Primostar 3 |
Références
- Ito, Y., et al. Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production. Cell. 174 (3), 636-648 (2018).
- An, H. H., et al. The use of pluripotent stem cells to generate diagnostic tools for transfusion medicine.....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
