Une nouvelle méthode d’injection intrapéritonéale (IP) chez le poisson-zèbre adulte est décrite. Lors de la manipulation de composés toxiques tels que la doxorubicine, cette procédure est plus efficace que les deux méthodes de propriété intellectuelle précédemment mentionnées. La technique est conçue pour être facilement adoptée par les chercheurs ayant une expérience limitée du modèle du poisson zèbre.
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Article de méthode
Une technique d’injection intrapéritonéale chez le poisson-zèbre adulte qui minimise les dommages corporels et la mortalité associée
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Résumé
Résumé
Le poisson-zèbre adulte (Danio rerio), qui est génétiquement accessible, est utilisé comme un modèle de vertébré précieux pour étudier des troubles humains tels que la cardiomyopathie. L’injection intrapéritonéale (IP) est une méthode importante qui délivre des composés dans le corps pour tester des effets thérapeutiques ou générer des modèles de maladies tels que la cardiomyopathie induite par la doxorubicine (CIVD). Actuellement, il existe deux méthodes d’injection IP. Les deux méthodes ont des limites lors de la manipulation de composés toxiques tels que la doxorubicine, qui entraînent des effets secondaires se manifestant par de graves dommages à la forme du corps et la mort des poissons. Bien que ces lacunes puissent être surmontées par une formation approfondie des enquêteurs, une nouvelle méthode d’injection de PI qui a un minimum d’effets secondaires est souhaitable. Ici, une méthode d’injection IP unique capable de gérer des composés toxiques est rapportée. Une réduction constante de la fonction cardiaque peut entraîner sans entraîner de mort significative des poissons. La technique peut être facilement maîtrisée par des chercheurs qui ont une expérience minimale avec les poissons-zèbres adultes.
Introduction
Le poisson-zèbre (Danio rerio) a attiré l’attention en tant que modèle expérimental pour l’étude des maladies humaines parce que cet animal présente une homologie élevée de gènes et d’organes avec les humains, une fécondation externe, une facilité de manipulation génétique et une transparence corporelle jusqu’à la maturité précoce, ce qui facilite une myriade d’applications d’imagerie1. Contrairement au processus simple consistant à administrer des médicaments directement dans l’eau pour les embryons et les larves de poisson-zèbre, l’administration de médicaments aux poissons-zèbres adultes présente une entreprise plus complexe et plus difficile2.
Chez les poissons adultes, les composés peuvent être délivrés par des techniques d’administration passive de médicaments, telles que l’administration directe dans l’eau, ou par des méthodes d’administration orale de médicaments comme le gavaging2. D’autres approches comprennent l’enrobage de la nourriture pour poissons avec les composés et l’alimentation ultérieure des poissons3, et l’administration directe de médicaments insolubles dans l’eau à une concentration prédéterminée, y compris des injections rétro-orbitaires ou intrapéritonéales 4,5. L’administration intrapéritonéale est préférée pour les études in vivo de modèles de maladies en raison de ses avantages pharmacocinétiques distincts6. Cette méthode permet d’obtenir une concentration élevée de médicament et une demi-vie prolongée dans la cavité péritonéale, offrant une voie efficace pour l’administration de médicaments 7,8. L’approche est couramment utilisée dans les milieux de recherche pour assurer une absorption et une distribution optimales des médicaments 9. Alors que les méthodes basées sur l’injection s’avèrent efficaces pour l’administration unique, les injections prolongées et répétées entraînent souvent des lésions corporelles et des infections chroniques2.
Actuellement, il existe deux méthodes d’injection IP chez les zerbafish adultes 4,10. Cependant, les deux méthodes ont des limites lorsqu’elles délivrent des composés toxiques comme la doxorubicine, entraînant de graves dommages à la forme du corps et la mortalité des poissons. Les effets secondaires peuvent compliquer considérablement l’interprétation des données. Bien que ces défis puissent être relevés grâce à une formation approfondie10, il existe un besoin évident d’une nouvelle méthode d’injection de propriété intellectuelle qui minimise les effets secondaires.
Ici, notre objectif est de développer une nouvelle méthode d’injection IP optimisée pour l’administration efficace de doxorubicine dans le poisson-zèbre adulte, facilitant la génération de modèles fiables de cardiomyopathie induite par la doxorubicine (CIVD) avec une minimisation des dommages corporels et de la mortalité associée.
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Protocole
Toutes les procédures effectuées ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Mayo Clinic, conformément aux normes décrites dans le « Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire » (National Academies Press, 2011). Tous les poissons-zèbres de l’étude appartiennent à la souche Wild Indian Karyotype (WIK). Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé pour l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.
1. Préparation et stockage de la solution mère de doxorubicine
- Obtenez le stock de doxorubicine d’une source commerciale.
REMARQUE : La doxorubicine est sensible à la lumière, alors acquérez-la sous forme de poudre et stockez-la dans des récipients opaques pour la protéger de l’exposition à la lumière. Effectuez toutes les étapes de la préparation de la poudre de Dox à l’intérieur d’une hotte chimique. - Dissoudre complètement la poudre de Dox dans de l’eau distillée et préparer une solution mère avec une concentration finale de 5 mg/mL.
- Aliquote la crosse en la divisant en tubes de 1,5 mL.
- Enveloppez les tubes dans du papier d’aluminium pour les protéger de l’exposition à la lumière.
- Conserver la solution aliquote Dox à 4 °C pour un stockage à court terme (<1 mois), ou à -20 °C pour un stockage à long terme10.
2. Regrouper les poissons en fonction de leur poids corporel
- Regroupez les poissons présentant une différence de poids corporel inférieure à 10 % pour l’injection ultérieure.
REMARQUE : Pour économiser des efforts à cette étape, les poissons dont l’écart de poids corporel est inférieur à 10 % sont classés comme étant de la même taille. - Laissez le poisson jeûner pendant 24 heures avant l’injection.
- Anesthésier le poisson à l’aide d’eau embryonnaire contenant 0,16 mg/mL de tricaïne pendant 1 min.
- Sortez le poisson de l’eau avec de la tricaïne et tamponnez les deux côtés du corps du poisson avec du papier filtre propre pour éliminer l’excès d’eau.
- Mesurez et consignez le poids corporel de chaque poisson, puis remettez-le rapidement dans un bassin de récupération rempli d’eau douce du système.
REMARQUE : L’injection de dox a été effectuée sur des poissons après avoir atteint l’âge de 3 mois. Dans cette étude, les chercheurs ont utilisé des poissons âgés de 3 à 10 mois. Les poids corporels du poisson-zèbre de souche WIK mature peuvent varier de 0,2 g à 0,5 g. Une anesthésie prolongée de plus de 5 minutes, suivie d’une injection de Dox, a entraîné une mortalité élevée des poissons.
3. Préparation de l’aiguille et de la station pour l’injection
- Déterminer le volume d’injection de la solution mère de Dox (p. ex., 5 mg/mL) nécessaire pour chaque poisson en fonction du poids corporel moyen pour atteindre la dose cible de 20 μg/g.
- Utilisez la formule suivante pour calculer le volume d’injection :
- Ajouter 1 solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour diluer la solution de Dox calculée à l’étape 1 pour l’injection, atteignant un volume total de 5 μL.
REMARQUE : Utilisez une solution en vrac pour chaque groupe de poissons en fonction de leur poids corporel et incluez 3 poissons supplémentaires dans chaque groupe pour s’assurer qu’il n’y a pas de pénurie de solution injectable au cours de l’expérience. - Tapotez doucement le tube, puis faites une brève microcentrifugeuse à grande vitesse pour recueillir la solution à température ambiante pendant 10 s.
- Placez la solution préparée sur de la glace et protégez-la de l’exposition à la lumière.
- Placez une boîte de Pétri propre de 100 mm avec une éponge sous un microscope à dissection, puis ajustez la mise au point.
REMARQUE : L’éponge contient une rainure de 4 cm de long. La rétraction élastique de l’éponge fournira au poisson un soutien et maintiendra le corps du poisson en position. L’éponge peut être réutilisée. - Équipez une micro-seringue de 10 μL d’une aiguille biseautée de 34 G.
- Rincez l’aiguille avec 1 tampon HBSS pour éliminer les bulles et éliminer les blocages potentiels de la seringue.
- Mesurer 5 μL de la solution préparée à l’étape 4 pour l’injection.
4. Procédure d’injection IP Dox
- Mettez le poisson adulte dans de l’eau avec 0,16 mg/mL de tricaïne pendant 1 min pour induire un état d’inconscience.
- Placez le poisson dans la rainure de l’éponge incrustée, l’abdomen vers le haut (figure 1A).
- Insérez l’aiguille avec un angle proche de 0°, en partant du milieu de la nageoire pectorale vers la face postérieure de la cavité cardiaque (Figure 1B).
REMARQUE : Évitez tout contact avec le cœur pendant la procédure. - Dirigez l’aiguille vers la queue et passez sous la peau argentée.
REMARQUE : Placez l’aiguille à proximité de la peau argentée, en prenant soin d’éviter toute égratignure ou perçage. - Surveillez la pointe de l’aiguille dans la cavité abdominale tout au long de l’opération (Figure 1C).
REMARQUE : Évitez d’endommager le foie, les intestins, la vessie natatoire et d’autres organes. Assurez-vous que l’aiguille atteint l’extrémité de l’intestin, près du foramen cloacal. - Distribuez graduellement et uniformément la solution de Dox de 5 μL, puis retirez lentement l’aiguille le long du chemin d’origine pour éviter toute fuite (Figure 1D).
- Surveillez la cavité abdominale pour détecter la présence de Dox en observant une coloration rouge de la solution de Dox (Figure 1E).
- Déplacez rapidement le poisson injecté dans un réservoir de passage propre rempli d’eau douce du système pour aider le poisson à récupérer.
REMARQUE : Entre les injections, rincez l’aiguille une fois avec 1x tampon HBSS.
5. Gestion des poissons après l’injection
- Remettez le poisson dans le système avec circulation après l’injection.
- Jeûnez tous les poissons injectés pendant 24 heures supplémentaires pour faciliter leur récupération.
- Pendant la première semaine, gardez un œil attentif sur les poissons. Retirez les poissons morts dès que possible pour éviter d’infecter les autres poissons.
REMARQUE : La mort des poissons dans les 24 premières heures est probablement due à des blessures physiques causées par l’injection ou une anesthésie prolongée. Enregistrez le nombre de poissons pour générer une courbe de survie. - Effectuer une échocardiographie pour phénotyper le poisson injecté de Dox à 56 jours après l’injection11.
REMARQUE : Assurer l’uniformité des conditions et des procédures pour le groupe témoin correspondant injecté avec la solution HBSS.
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Résultats
Auparavant, deux méthodes intrapéritonéales (IP) ont été employées pour l’administration de doxorubicine chez le poisson-zèbre adulte 4,10. Dans la méthode I, également connue sous le nom de méthode d’injection IP classique décrite par Kinkel et al.4, l’aiguille a été insérée à un angle de 45° par rapport à la ligne médiane entre les nageoires pelviennes, l’abdomen vers le haut. Dans la méthode II, ou la méthode d’injection IP alternative ...
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Discussion
Différente des deux méthodes d’injection IP existantes 4,10, la nouvelle méthode d’injection IP se caractérise par les caractéristiques distinctes suivantes. Tout d’abord, un angle de pénétration unique de l’aiguille est utilisé (proche de zéro) ; deuxièmement, l’aiguille pénètre dans le poisson par un emplacement unique, c’est-à-dire un trou naturel sur la surface ventrale d’un poisson, ce qui faciliterait l’injection ; et enfin, le mouvement de l’aigui...
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Remerciements
Cette étude a été soutenue par le NIH (HL107304 et HL081753) et la Fondation Mayo (Center for Biomedical Discovery and Cardiovascular Research Center) à X.X. J.L. est financée par les Fonds de recherche fondamentale pour les Universités centrales de l’Université Central South, n° 56021702. Un merci spécial à Beninio Gore et Quentin Stevens pour la gestion de l’installation de poisson zèbre.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10 &mu ; L NanoFil-seringue | World Precision Instruments, Inc | Outil d’injection | NANOFIL |
| 34 G aiguille | World Precision Instruments, Inc | NI34BV-2 | outil d’injection |
| 60 mm boîte de Pétri | fisher scientific/fisherbrand | FB0875713A | la pose de l’éponge ; |
| Microscope de dissection | Nikon | SMZ800 | Injcetion du médicament Dox |
| Doxorubicine chlorhydrate | Sigma | D1515-10MG | pour la création d’un modèle DIC ; |
| Échocardiographie | VISUAL SONICS | Vevo 3100 | fonction cardiaque |
| Mousse Éponge | Jaece Industries | L800-D | mise en place du poisson |
| saline équilibrée de Hank (HBBS) | Thermo Fisher | 14025076 | Véhicule pour |
| microcentrifugeuse Dox ; | southernlabware | MyFuge/C1012 | récupère la solution Dox ; |
| Balance de précision | Balance Torbal | AD60 | Balances numériques |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthésie |
| poisson Tube | Eppendorf | 1,5 mL | stockage ; |
| vevo LAB ; logiciel | FUJIFILM VISUAL SONICS ; | 5.6.0 | Quantification du cœur |
Références
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Réimpressions et autorisations
