Ce protocole décrit un test de jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) extrachromosomique et un test de recombinaison homologue (HR) pour quantifier l’efficacité de NHEJ et HR dans les cellules HEK-293T.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Analyse de l’efficacité de l’assemblage d’extrémités non homologues et de la recombinaison homologue dans les cellules HEK-293T à l’aide de systèmes rapporteurs basés sur la GFP
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cassures double brin de l’ADN (CDB) représentent les lésions de l’ADN les plus dangereuses, capables d’induire une perte substantielle d’informations génétiques et la disparition cellulaire. En réponse, les cellules utilisent deux mécanismes principaux pour la réparation des DSB : la jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR). Il est essentiel de quantifier l’efficacité de la NHEJ et de la RH séparément pour explorer les mécanismes et les facteurs pertinents associés à chacun. Le test NHEJ et le test HR sont des méthodes établies utilisées pour mesurer l’efficacité de leurs voies de réparation respectives. Ces méthodes reposent sur des plasmides méticuleusement conçus contenant un gène de protéine fluorescente verte (GFP) perturbé avec des sites de reconnaissance pour l’endonucléase I-SceI, qui induit des CDB. Ici, nous décrivons le test NHEJ extrachromosomique et le test HR, qui impliquent la co-transfectation de cellules HEK-293T avec des plasmides EJ5-GFP/DR-GFP, un plasmide exprimant I-SceI et un plasmide exprimant mCherry. Les résultats quantitatifs de l’efficacité de la NHEJ et de la HR sont obtenus en calculant le rapport entre les cellules GFP positives et les cellules mCherry-positives, tel que compté par cytométrie en flux. Contrairement aux tests chromosomiquement intégrés, ces tests extrachromosomiques sont plus adaptés à la réalisation d’études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires stables établies.
Introduction
Une cassure double brin de l’ADN (CDB) est la forme la plus délétère de dommages à l’ADN, conduisant potentiellement à l’instabilité du génome, à des réarrangements chromosomiques, à la sénescence cellulaire et à la mort cellulaire si elle n’est pas réparée rapidement1. Deux voies bien établies, la jonction d’extrémités non homologues (NHEJ) et la recombinaison homologue (HR), sont reconnues pour leur efficacité dans le traitement des DSBde l’ADN 2,3. La HR est considérée comme un mécanisme sans erreur pour la réparation des DSB, utilisant des séquences homologues dans la chromatide sœur comme modèle pour restaurer la configuration originale de la molécule d’ADN3 blessée. NHEJ, d’autre part, est une voie de réparation DSB sujette aux erreurs qui rejoint les extrémités d’ADN brisées sans s’appuyer sur un modèle2.
Le test NHEJ et le test HR sont des méthodes classiques développées à l’origine dans le laboratoire de Jasin au Memorial Sloan-Kettering Cancer Center et utilisées pour quantifier l’efficacité de NHEJ et HR, respectivement 4,5,6,7. Ces tests jouent un rôle crucial dans l’étude des mécanismes et des facteurs pertinents associés à la NHEJ et à HR 8,9,10,11,12,13,14. Les deux tests reposent sur la mise en œuvre de deux rapporteurs GFP perturbés, EJ5-GFP et DR-GFP, pour surveiller la réparation des DSB induite par l’endonucléase I-SceI. Le rapporteur EJ5-GFP est utilisé dans le test NHEJ, tandis que le rapporteur DR-GFP est utilisé dans le test HR. Chaque rapporteur est subtilement conçu de telle sorte que les DSB induites par I-SceI ne peuvent être réparées que par une voie de réparation spécifique pour restaurer une cassette d’expression GFP 4,5.
Le test NHEJ et le test HR peuvent être effectués en utilisant une approche chromosomiquement intégrée ou extrachromosomique15,16. L’approche chromosomiquement intégrée nécessite l’intégration des rapporteurs GFP perturbés dans le génome, permettant l’analyse de la réparation des DSB dans un contexte chromosomique 6,15. Cependant, cette approche nécessite un passage cellulaire prolongé et ne convient pas aux études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires en raison de l’intégration chromosomique arbitraire, introduisant un facteur de confusion supplémentaire en plus des différences inhérentes. Dans ce protocole, nous décrivons le test NHEJ extrachromosomique et les tests HR, impliquant la transfection transitoire des plasmides GFP et I-SceI perturbés dans les cellules HEK-293T, suivie d’une analyse par cytométrie en flux (le flux de travail de l’expérience est illustré à la figure 1). Ces tests de rapporteur non intégrés ont été initialement rapportés par le laboratoire de Jasin pour étudier la réparation des réticulations interbrins d’ADN16 et ont été utilisés pour évaluer l’efficacité de la NHEJ et l’efficacité de la RH par plusieurs laboratoires 9,10,11,12,13,14,17,18,19, y compris le nôtre 11. Ces approches extrachromosomiques facilitent l’analyse de la réparation des DSB dans des études comparatives impliquant plusieurs lignées cellulaires stables établies.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Isolement plasmidique
- Transformez E. coli compétent avec les plasmides EJ5-GFP, DR-GFP, pCBASceI (plasmide exprimant I-SceI) et PCI2-HA-mCherry (plasmide exprimant mCherry) (voir Tableau des matériaux) en suivant le protocole de transformation standard20.
REMARQUE : PCI2-HA-mCherry peut être remplacé par d’autres plasmides exprimant mCherry ou DsRed. - Cultiver l’E. coli transformé dans 500 mL de milieu LB liquide complété par 100 μg/mL d’ampicilline pendant une nuit à 37 °C en agitant.
- Isolez les plasmides à l’aide d’une trousse d’isolement de maxi de plasmides exempts d’endotoxines disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir la table des matériaux).
- Quantifiez les concentrations de plasmides à l’aide de spectrophotomètres à microvolume nanodrop. Ajustez la concentration plasmidique à 1 μg/μL.
2. Préparation et transfection des cellules
- Culture de cellules HEK-293T dans un milieu DMEM complété par 10 % de sérum de bovin fœtal. Assurez-vous que les cellules HEK-293T ou les cellules stables HEK-293T établies sont en bon état de croissance.
REMARQUE : Les cellules congelées doivent subir au moins deux cycles de division avant la transfection. - La veille de la transfection, ensemencez les cellules HEK-293T dans une plaque à 6 puits à 2 × 10 à5 cellules/puits pour atteindre une confluence d’environ 60 % le lendemain.
- Le jour de la transfection, confirmez la confluence cellulaire, en visant environ 60%. Pour l’essai NHEJ, transfecter les cellules d’échantillon expérimentales dans une plaque à 6 puits avec 1 μg de EJ5-GFP, 1 μg de pCBASceI et 1 μg de plasmides PCI2-HA-mCherry, à l’aide d’un réactif de transfection commercial en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour le test HR, remplacez le plasmide EJ5-GFP par le plasmide DR-GFP.
- Pour les contrôles d’étalonnage FACS, laissez un puits de cellules non transfectées en tant que contrôle négatif. Transfectez les cellules dans une plaque à 6 puits avec soit (1) 1 μg d’EJ5-GFP (pour le test NHEJ) ou 1 μg de DR-GFP (pour le test HR), avec 1 μg de pCBASceI en tant que contrôle GFP monocolore, ou (2) 1 μg de PCI2-HA-mCherry en tant que contrôle monocolore mCherry.
3. Analyse des cellules GFP-positives et mCherry-positives par cytométrie en flux
- Deux jours après la transfection, confirmer l’expression des protéines GFP et mCherry à l’aide d’un microscope fluorescent.
- Trois jours après la transfection, retirez le milieu des puits, lavez-le une fois avec du PBS et ajoutez 500 μL de trypsine dans chaque puits. Incuber 5 min à 37 °C pour détacher toutes les cellules de la plaque. Tout au long de cette étape et des suivantes, protégez les cellules de la lumière directe.
- Ajouter 500 μL de média DMEM complet dans chaque puits, remettre les cellules en suspension en s’assurant qu’aucun agglutinage n’est visible.
- Transférez toutes les cellules de chaque puits dans des tubes à centrifuger de 1,5 ml, puis centrifugez les cellules pendant 2 minutes à 1000 × g à température ambiante.
- Retirez délicatement le surnageant par pipetage et lavez-le une fois avec 1,0 mL de PBS.
- Encore une fois, retirez soigneusement le surnageant par pipetage, remettez les cellules en suspension dans 500 μL de PBS et transférez les cellules dans des tubes FACS (voir le tableau des matériaux).
REMARQUE : Pour des résultats optimaux, commencez l’analyse par cytométrie en flux immédiatement après le prélèvement cellulaire. Alternativement, les cellules peuvent être stockées sur de la glace pendant plusieurs heures. - Étalonnez le FACS avec des cellules non transfectées (contrôle négatif), des cellules transfectées EJ5-GFP/DR-GFP et pCBASceI (contrôle monocolore GFP) et des cellules transfectées mCherry (contrôle monocolore mCherry). Ajustez la tension et la compensation pour minimiser le débordement de fluorescence entre GFP et mCherry.
- Acquérir et enregistrer au moins 10 000 cellules intactes de chaque tube.
4. Analyse des données
REMARQUE : Les étapes suivantes sont effectuées à l’aide du logiciel FlowJo (voir Tableau des matériaux) pour analyser les données FACS. Des procédures comparables peuvent être exécutées dans d’autres logiciels d’analyse.
- Faites glisser tous les fichiers FACS dans le tableau de bord. Double-cliquez sur l’un des fichiers pour afficher le tracé FSC/SSC.
- Créez une porte polygonale pour sélectionner les cellules intactes, à l’exclusion des débris dans le coin inférieur gauche. Nommez cette sous-population « Cellules intactes » et faites glisser cette porte vers la barre « Tous les échantillons ». Faites défiler chaque échantillon à l’aide du bouton Échantillon suivant pour vous assurer que le contrôle est approprié pour chaque échantillon (Figure 2A).
- Double-cliquez sur la sous-population de cellules intactes de l’échantillon de contrôle négatif (cellules non transfectées) pour afficher un nouveau graphique. Remplacez les axes par FL1-H (axe x, GFP) et FL2-H (axe y, mCherry).
- Sélectionnez l’outil Quad Gating et cliquez sur l’extrémité supérieure droite de la population de cellules négatives (Figure 2B). Faites glisser les quatre portes rectangulaires vers la barre « Cellules intactes ». Faites défiler des échantillons de commande GFP unicolore ou mCherry unicolore à l’aide du bouton Échantillon suivant pour vous assurer que la porte est appropriée pour distinguer les cellules GFP positives ou mCherry positives des cellules témoins négatives (Figure 2C,D). Affinez le gate du quadrant si nécessaire et appliquez ce gate à toutes les populations de « cellules intactes ».
- Cliquez sur l’éditeur de mise en page. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les tracés représentatifs et choisissez Copier dans l’éditeur de modèle. Sélectionnez tous les tracés représentatifs, puis double-cliquez pour ouvrir Définition de graphique. Ajustez l’étiquette de l’axe, annotez et la légende comme vous le souhaitez.
- Le pourcentage de cellules mCherry-positives dans les échantillons expérimentaux sert de contrôle de l’efficacité de transfection. Calculez l’efficacité relative de la réparation de l’ADN en comparant le nombre de cellules GFP positives avec le nombre de cellules mCherry positives dans le même graphique.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Pour garantir la précision de l’analyse NHEJ et RH, la mise en œuvre d’une stratégie d’ajustement de la rémunération et de contrôle appropriée est nécessaire. En règle générale, la fluorescence de mCherry ne se manifeste pas dans le détecteur GFP lors de l’utilisation d’un filtre de 530 nm. Cependant, dans les cas de cellules présentant une expression extrêmement élevée de la GFP, la fluorescence de la GFP peut contaminer le détecteur mCherry lors de l’utilisation d’un filtre de 575 nm. Pour répondre à ces préoccupations...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
La méthode décrite ici a été utilisée dans plusieurs articles pour évaluer l’efficacité du NHEJ et l’efficacité des RH 9,10,11,12,13,14,16,17,18,19. Cette méthode est pertinente pour éluc...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Il n’y a aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par la Fondation des sciences naturelles de la province du Heilongjiang en Chine (YQ2022C036) et la Fondation pour l’innovation supérieure de l’Université médicale de Qiqihar (QYYCX2022-06). Figure 1 produite à l’aide de MedPeer.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Vaisselle de 6 cm ; | BBI | F611202-9001 | |
| 6 plaques de puits | Corning | 3516 | |
| Ampicilline | Beyotime | ST007 | Concentration de travail : 100 &mu ; g/mL |
| DH5 et alpha ; Competent Cells | TIANGEN | CB101 | |
| DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| DR-GFP | Addgene | 26475 | |
| EJ5-GFP | Addgene | 44026 | |
| EndoFree Maxi Plasmid ; kit | TIANGEN | DP117 | alternative sans endotoxines le kit d’extraction de plasmide peut être utilisé |
| TUBES FACS | FALCON | 352054 | |
| Sérum fœtal bovin | CLARK | FB25015 | |
| Cytomètre en flux | BD Biosciences | BD FACSCalibur | |
| FlowJo V.10.1 | logiciel d’analyse alternatif | Treestar | |
| Cellules HEK-293T | nationale de la ressource de lignées cellulaires | 1101HUM-PUMC000091 | |
| Lipo3000 | Invitrogen | L3000015 | des régents de transfection alternatifs peuvent être utilisés |
| PBS | Biosharp | BL601A | |
| pCBASceI | Addgene | 26477 | I-SceI exprimant le plasmide |
| PCI2-HA-mCherry | contenant DsRed peuvent être utilisés | ||
| Trypsin | Gibco | 25200-056 |
Références
- Huang, R., Zhou, P. K. DNA damage repair: historical perspectives, mechanistic pathways and clinical translation for targeted cancer therapy. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 254(2021).
- Pannunzio, N. R., Watanabe, G., Lieber, M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10512-10523 (2018).
- Wright, W. D., Shah, S. S., Heyer, W. -D. Homologous recombination and the repair of DNA double-strand breaks. J Biol Chem. 293 (27), 10524-10535 (2018).
- Pierce, A. J., Johnson, R. D., Thompson, L. H., Jasin, M. XRCC3 promotes homology-directed repair of DNA damage in mammalian cells. Genes Dev. 13 (20), 2633-2638 (1999).
- Bennardo, N., Cheng, A., Huang, N., Stark, J. M. Alternative-NHEJ Is a mechanistically distinct pathway of mammalian chromosome break repair. PLoS Genet. 4 (6), e1000110(2008).
- Gunn, A., Stark, J. M. I-SceI-based assays to examine distinct repair outcomes of mammalian chromosomal double strand breaks. Methods Mol Biol. 920, 379-391 (2012).
- Zuo, N., et al. Detection of alternative end-joining in HNSC cell lines using DNA Double-strand break reporter assays. Bio Protoc. 12 (17), 4506(2022).
- Schrank, B. R., et al. Nuclear ARP2/3 drives DNA break clustering for homology-directed repair. Nature. 559 (7712), 61-66 (2018).
- Lu, H., Saha, J., Beckmann, P. J., Hendrickson, E. A., Davis, A. J. DNA-PKcs promotes chromatin decondensation to facilitate initiation of the DNA damage response. Nucleic Acids Res. 47 (18), 9467-9479 (2019).
- Xu, R., et al. hCINAP regulates the DNA-damage response and mediates the resistance of acute myelocytic leukemia cells to therapy. Nat Commun. 10 (1), 3812(2019).
- Wang, T., et al. WASH interacts with Ku to regulate DNA double-stranded break repair. iScience. 25 (1), 103676(2022).
- Guo, G., et al. Reciprocal regulation of RIG-I and XRCC4 connects DNA repair with RIG-I immune signaling. Nat Commun. 12 (1), 2187(2021).
- Watkins, J., et al. Genomic complexity profiling reveals that HORMAD1 overexpression contributes to homologous recombination deficiency in triple-negative breast cancers. Cancer Discov. 5 (5), 488-505 (2015).
- Chen, Y., et al. USP44 regulates irradiation-induced DNA double-strand break repair and suppresses tumorigenesis in nasopharyngeal carcinoma. Nat Commun. 13 (1), 501(2022).
- Seluanov, A., Mao, Z., Gorbunova, V. Analysis of DNA double-strand break (DSB) repair in mammalian cells. JoVE. (43), e2002(2010).
- Nakanishi, K., Cavallo, F., Brunet, E., Jasin, M. DNA recombination: Methods and Protocols. Tsubouchi, H. , Humana Press. Totowa, NJ. 283-291 (2011).
- Cavallo, F., et al. Reduced proficiency in homologous recombination underlies the high sensitivity of embryonal carcinoma testicular germ cell tumors to cisplatin and poly (ADP-Ribose) polymerase inhibition. PLoS One. 7 (12), e51563(2012).
- Unfried, J. P., et al. Long noncoding RNA NIHCOLE promotes ligation efficiency of DNA double-strand breaks in hepatocellular carcinoma. Cancer Res. 81 (19), 4910-4925 (2021).
- Cavallo, F., Caggiano, C., Jasin, M., Barchi, M. Testicular Germ Cell Tumors: Methods and Protocols. Bagrodia, A., Amatruda, J. F. , Springer US. New York, NY. 113-123 (2021).
- Green, M. R., Sambrook, J. The Hanahan method for preparation and transformation of competent Escherichia coli: high-efficiency transformation. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (3), 101188(2018).
- Stark, J. M., Pierce, A. J., Oh, J., Pastink, A., Jasin, M. Genetic steps of mammalian homologous repair with distinct mutagenic consequences. Mol Cell Biol. 24 (21), 9305-9316 (2004).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
