Suivi de la fibrinolyse de caillots de sang total formés en boucle de Chandler sous flux de cisaillement dans un modèle de thrombolyse in vitro

Résumé

Les tests de thrombolyse in vitro ont souvent eu du mal à reproduire les conditions in vivo, que ce soit dans le thrombus modèle digéré ou dans l’environnement dans lequel la thrombolyse se produit. Dans cet article, nous explorons comment le couplage de la boucle de Chandler et du test de fibrinolyse par écoulement fluorométrique en temps réel (RT-FluFF) est utilisé pour la surveillance de la lyse des caillots haute fidélité, ex-vivo.

Résumé

La thromboembolie et les complications qui y sont associées sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde, et divers tests ont été mis au point pour tester l’efficacité des médicaments thrombolytiques in vitro et in vivo. Il existe une demande croissante de modèles de caillots in vitro plus pertinents sur le plan physiologique pour le développement de médicaments en raison de la complexité et du coût associés aux modèles animaux, en plus de leur manque souvent de translatibilité à la physiologie humaine. Le débit, la pression et le taux de cisaillement sont des caractéristiques importantes du système circulatoire, les caillots qui se forment sous l’écoulement présentant des caractéristiques de morphologie et de digestion différentes de celles des caillots formés statiquement. Ces facteurs sont souvent non représentés dans les tests conventionnels de digestion par caillot in vitro , ce qui peut avoir des implications pharmacologiques qui ont un impact sur les taux de réussite de la traduction des médicaments.

Le testd’ibrinolyse orométrique F lowing FR eal-T ime Flu(RT-FluFF) a été développé en tant que plate-forme de test de thrombolyse haute fidélité qui utilise des caillots marqués par fluorescence formés sous écoulement de cisaillement, qui sont ensuite digérés à l’aide de plasma circulant en présence ou en l’absence d’agents pharmaceutiques fibrinolytiques. La modification des débits des étapes de formation et de digestion des caillots permet au système d’imiter les conditions artérielles, pulmonaires et veineuses dans des configurations expérimentales très diverses. Les mesures peuvent être prises en continu à l’aide d’un fluorimètre en ligne ou en prenant des points temporels discrets, ainsi qu’une mesure conventionnelle de la masse du caillot final. Le test RT-FluFF est un système flexible qui permet le suivi en temps réel de la digestion des caillots dans des conditions d’écoulement qui représentent plus précisément les conditions physiologiques in vivo tout en conservant le contrôle et la reproductibilité d’un système de test in vitro.

Introduction

Les maladies découlant fondamentalement d’étiologies thrombo-emboliques représentent une source majeure de morbidité et de mortalité dans la société actuelle. Les manifestations de la pathogenèse thrombo-embolique comprennent, sans s’y limiter, les infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires¹. Une énorme quantité de recherches en cours, couvrant plusieurs disciplines, tourne autour de la mise au point de méthodes sûres et efficaces pour traiter la thrombose pathogène. Les variations dans les manifestations artérielles et veineuses de la thrombose et les différentes localisations anatomiques ont entraîné le développement de différentes approches de traitement. Cependant, le traitement aigu repose généralement sur l’utilisation d’une thrombolyse pharmacologique via des activateurs du plasminogène avec un potentiel de thrombectomie mécanique dans certaines circonstances cliniques².

Le développement de nouvelles stratégies de traitement pharmacologique repose fondamentalement sur des modèles animaux in vivo et des modèles de digestion in vitro pour les essais précliniques ^3,4. Les modèles in vivo bénéficient naturellement de leur capacité à capturer l’interaction complexe de divers paramètres physiologiques sur l’efficacité du traitement, y compris la clairance des agents pharmaceutiques ainsi que les interactions cellulaires avec les médicaments. Cependant, cette même complexité rend souvent ces modèles très coûteux et pose des problèmes supplémentaires lorsqu’il s’agit d’isoler la pharmacodynamique/cinétique sous-jacente chez les animaux qui diffère considérablement de la physiologie humaine. Le développement de modèles in vitro a contribué à faciliter un cadre de test distillé dans lequel le développement et le criblage de médicaments peuvent être effectués, mais manque souvent de la fidélité nécessaire pour récapituler l’état pathologique étudié.

Les protocoles in vitro courants pour tester de nouveaux thrombolytiques reposent sur l’utilisation de caillots formés et lysés dans des conditions statiques où la masse résiduelle du caillot sert de critère d’évaluation principal ^5,6. Malheureusement, ces techniques ne tiennent pas compte des aspects mécaniques de la lyse des caillots, tels que l’écoulement turbulent et les chutes de pression trans-thrombus qui peuvent modifier considérablement la pharmacodynamique des médicaments testés. De plus, les caillots formés dans des conditions statiques contiennent une microarchitecture qui diffère des caillots physiologiques. Il a été démontré de manière reproductible que la présence d’un cisaillement lors de la formation d’un caillot a un impact sur les caractéristiques du caillot résultant, telles que l’activation plaquettaire et la réticulation de la fibrine. Les caillots produits sous l’effet d’un écoulement de cisaillement présentent une hétérogénéité complexe de la pointe à la queue qui est absente dans les caillots formés statiquement ^7,8. De tels écarts par rapport à l’architecture physiologique du caillot peuvent avoir un impact important sur la caractérisation du développement de médicaments, y compris la pénétration du médicament dans un thrombus et l’efficacité de la lyse ultérieure⁹.

Pour remédier à certaines de ces limitations associées à l’utilisation de modèles statiques de coagulation/lyse de caillot, l’adoption de la boucle de Chandler pour la formation de caillots et la lyse de caillots en présence de cisaillement a entraîné une résurgence¹⁰. Bien que de tels systèmes permettent une meilleure représentation de la dynamique de l’écoulement et génèrent des caillots avec une architecture plus pertinente sur le plan physiologique par rapport aux tests relativement statiques, leurs conditions d’écoulement simplifiées représentent tout de même un écart par rapport aux conditions physiologiques. Enfin, des approches microfluidiques ont également été entreprises en raison de leur facilité d’imagerie et de leurs modèles d’écoulement uniformes ; Cependant, ils restent une élimination significative des conditions physiologiques attendues dans les gros vaisseaux principalement affectés dans la plupart des troubles thrombo-emboliques cliniquement pertinents^11,12.

En gardant à l’esprit la discussion ci-dessus, nous avons développé un modèle de thrombolyse in vitro haute fidélité pour le dépistage préclinique des médicaments thrombolytiques. Le modèle vise à s’attaquer à certains des pièges actuels décrits ci-dessus dans le domaine du dépistage des nouvelles thérapies thrombolytiques et a été validé pour sa reproductibilité et sa sensibilité à des concentrations variables d’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le système décrit dans le présent document offre des écoulements de cisaillement physiologiques à l’aide d’une pompe péristaltique, d’un amortisseur de pression, d’un réservoir chauffé, de deux capteurs de pression, d’un fluorimètre en ligne et d’un analogue de caillot formé par cisaillement en boucle de Chandler marqué par fluorescence pour faciliter le suivi en temps réel de la fibrinolyse¹³. Dans l’ensemble, le système global s’appelle le test de fibrinolyse à flux fluorométrique en temps réel (RT-FluFF Assay)¹⁴ et ce manuscrit aborde les subtilités de la mise en place et de l’exécution réussies des tests dans ce modèle de thrombolyse in vitro haute fidélité.

Protocole

Toutes les méthodes mentionnées ci-dessous sont conformes aux protocoles du comité d’examen institutionnel (IRB) et du comité d’éthique de la recherche humaine de l’établissement. Tous les volontaires en bonne santé ont fourni un consentement écrit et éclairé avant le don de sang. Il convient de noter que tous les documents mentionnés dans le protocole se trouvent dans le Tableau des matériaux. Bien que la WB et le plasma humains soient abordés tout au long de ce protocole, l’utilisation de sang d’animaux de recherche et de produits sanguins appauvris en facteurs peut être achetée et remplacée.

1. Prélèvement de sang total

1. Prélever du sang total veineux (BM) de volontaires sains consentants à l’aide de techniques de phlébotomie standard.
   ATTENTION : Assurez-vous que les précautions universelles sont suivies pour réduire le risque de contact avec du sang ou d’autres matières potentiellement infectieuses tout au long de ce protocole. L’utilisation de gants, d’une blouse de laboratoire et d’un écran facial est nécessaire.
2. Prélever ~50 ml de WB directement dans des tubes de citrate de sodium à 3,2 % et accumuler immédiatement dans des tubes de 50 ml pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE : Un tube de jetange avant le prélèvement sanguin dans le tube de citrate est nécessaire en plus de s’assurer que les tubes sont remplis au volume recommandé par le fabricant. Les WB fraîchement collectées récapituleront le mieux la dynamique de coagulation de l’hôte. L’entreposage à court terme de la WB à température ambiante (≤4 h avant l’utilisation) est permis. La WB n’est pas stockée pendant la nuit, car il a été démontré qu’elle a un impact sur la dynamique de la coagulation lorsqu’elle est examinée par thromboélastographie¹⁵.

2. Formation de caillots

1. Dans 3 mL de sang total citraté, ajouter du fibrinogène marqué par fluorescence (FITC-Fg) par fluorescence (FITC-Fg) jusqu’à une concentration finale de 60 μg/mL (rapport entre 1:50 de fibrinogène marqué par fluorescence et de fibrinogène non modifié, en supposant une concentration plasmatique endogène de fibrinogène de 3 mg/mL).
   REMARQUE : Ce rapport peut être augmenté jusqu’à 1:10 avec un impact minimal sur la morphologie du caillot. ^13,14 Le fibrinogène marqué par fluorescence peut être acheté ou généré en faisant réagir le fibrinogène avec l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Le mélange du fibrinogène doit être effectué ≤5 minutes avant le début de la série.
   1. Si le fibrinogène a déjà été aliquote et congelé, inspectez le FITC-Fg décongelé pour vous assurer que la polymérisation n’a pas commencé prématurément, le rendant ainsi inutilisable (assurez-vous de l’absence de particules ou de fibres dans la solution).
2. Préparez la configuration de la boucle Chandler avec un tambour de 120 mm de diamètre dans un bain-marie à 37 °C (Figure 1). Assurez-vous que le dispositif de boucle Chandler est capable de tourner à une vitesse de rotation fixe de 0 à 90 tr/min pendant tout le processus de formation du caillot.
   REMARQUE : D’autres configurations et modifications de la boucle de Chandler peuvent être trouvées dans Zeng et al.¹⁶. Planche à billets
3. Coupez les tubes (diamètre intérieur 5/32, diamètre extérieur 7/32") et formez des boucles qui s’adaptent fermement mais pas étroitement autour du tambour. Pour la taille de tube recommandée décrite ici, coupez un tube PCR standard de 200 μL à utiliser comme raccord pour connecter les extrémités du tube pour former la boucle fermée.
   REMARQUE : Différentes tailles de tubes peuvent être utilisées pour produire des caillots de différentes tailles¹⁶.
4. Amorcer la coagulation du sang en ajoutant 200 mM de solution de chlorure de calcium dans un rapport de 1:17 de solution de calcium par rapport au sang total. Chargez le sang dans la tubulure (remplissez ~50 % du volume du tube) à l’aide d’une seringue de 3 ml. Placez immédiatement la boucle sur le tambour de boucle Chandler reliant les extrémités et commencez la rotation.
   1. Assurez-vous d’un bon mélange avec une inversion douce avant le chargement pour éviter tout problème résultant de la sédimentation des composants WB.
   2. Assurez-vous qu’une quantité égale de sang est ajoutée à chaque tube à chaque passage, car cela peut avoir un impact sur la taille du caillot s’il n’est pas maintenu de manière constante.
   3. Comme les bulles dans la colonne de sang peuvent également avoir un impact sur la coagulation du sang, retirez-les en déplaçant doucement le tube en forme de « balançoire » pour faciliter l’évacuation des bulles avant de les charger sur le tambour.
5. Faites pivoter le tambour partiellement immergé dans le bain-marie à une vitesse de rotation de 40 tr/min pour obtenir un taux de cisaillement calculé de ~450 ^s-1.
   REMARQUE : Reportez-vous à Zeng et al. pour plus d’informations sur les cisailles calculées en fonction de la taille du tube et de la vitesse de rotation (20 à 60 tr/min)¹⁶. Les taux de cisaillement veineux et artériel typiques sont de 20-200 ^s-1 et 300-1 000 ^s-1, respectivement, ~400-500 ^s-1 étant représentatif de l’artère pulmonaire.
6. Laisser les caillots se former pendant 40 à 60 minutes dans des conditions de faible luminosité pour minimiser le photoblanchiment du fibrinogène marqué par fluorescence.
7. Une fois le temps de coagulation souhaité atteint, retirez les caillots du tube et utilisez-les immédiatement. Pour assurer l’élimination en douceur des caillots sans compromettre la structure, retournez doucement le tube pour permettre au caillot de glisser lentement hors du tube dans un petit récipient.
   REMARQUE : Le stockage des caillots formés dans du plasma citraté ou du PBS pendant une nuit à 4 °C peut avoir un impact sur l’analyse ultérieure de la digestion des caillots dans la boucle d’écoulement.

3. Configuration de l’instrument RT-FluFF

1. Assurez-vous que l’appareil à boucle d’écoulement est connecté comme illustré à la figure 2 et que toutes les connexions sont sécurisées. En bref, l’appareil de boucle d’écoulement comprend, dans l’ordre du sens d’écoulement : Pompe > amortisseur > capteur de pression d’entrée > capteur de pression de > de sortie > fluorimètre > réservoir chauffé > pompe. Ajustez la sélection de la capacité de la pompe, du débit expérimental, du diamètre et de la longueur du tube, de la température, du volume du réservoir et de la taille/géométrie du caillot en fonction des besoins expérimentaux uniques à chaque étude.
   REMARQUE : Pour cet exemple, le même tube de diamètre utilisé dans la boucle de Chandler a été utilisé pour RT-FluFF. Le tube peut être utilisé pour plusieurs passages le même jour, mais doit être surveillé pour détecter toute dégradation ou fuite, puis changé/rincé au besoin. Il est recommandé de rincer à l’eau distillée tiède entre les passages. Selon la conception de l’expérience, il peut être nécessaire de remplacer le tube après chaque passage.
2. Une fois que tous les tubes sont fixés, allumez le moniteur de pression. Vérifiez que le moniteur de pression indique 0 mmHg pour les capteurs d’entrée et de sortie. Si ce n’est pas le cas, ouvrez les vannes pour vous assurer que les capteurs de pression sont ouverts à la pression atmosphérique et mettez les capteurs à zéro.
3. Allumez le bloc chauffant ou le bain-marie utilisé et surveillez la température tout au long de l’expérience. Maintenez la température proche de 37 °C pour imiter la température physiologique du corps humain.
4. Allumez la pompe au débit souhaité pour vérifier s’il y a des fuites et vérifier que les capteurs de pression fonctionnent.
   REMARQUE : Un débit de ~160 mL/min dans cette taille de tube représentera un taux de cisaillement de ~500 ^s-1.
5. Éteignez la pompe pour faciliter le chargement du caillot.

4. Chargement du caillot dans la boucle d’écoulement

1. Si un caillot précédemment fabriqué qui a été stocké est utilisé, assurez-vous de ramener le caillot à température ambiante avant de le charger dans le système de boucle d’écoulement.
2. La perte de masse du caillot est un paramètre important pour les tests de thrombolyse. Il est préférable de mesurer la masse du caillot juste avant de la charger dans la boucle d’écoulement au lieu de s’appuyer sur des mesures préalables.
   1. Les mesures de la masse des caillots doivent toujours être effectuées de la même manière à chaque fois pour assurer l’uniformité entre les échantillons et tous les jours d’analyse, car la teneur en liquide à l’intérieur et sur les caillots peut avoir un impact significatif sur leur masse. La meilleure pratique consiste à éponger doucement les caillots sur les lingettes de laboratoire jusqu’à ce qu’ils ne libèrent plus une quantité significative de liquide sur la lingette, en prenant soin de ne pas comprimer le caillot tout au long du processus de mesure.
3. Immergez le caillot dans le plasma (autologue ou de type apparié) ou dans une autre solution de phase mobile utilisée dans la boucle d’écoulement (telle que le PBS ou un milieu défini) dans un récipient peu profond tel qu’une parabole de pesée. La solution en phase mobile doit être prélevée directement dans le réservoir du système de 50 mL pour contrôler le volume total du système. Aucun agent de test thrombolytique ou pharmaceutique ne doit être présent pendant la phase de charge du caillot. Il est recommandé que le volume total de la phase mobile pour l’exécution de la boucle d’écoulement soit de ≥50 mL et qu’il soit uniforme pour tous les échantillons.
4. Retirez la section centrale de la boucle d’écoulement du tube (entre les capteurs d’entrée et de sortie) et fixez une seringue de 10 ml à une extrémité du tube.
5. À l’aide de l’extrémité libre du tube, placez-le dans le plasma (ou phase mobile) et prélevez un petit volume de la solution pour amorcer le tube. Ensuite, placez l’entrée du tube près du caillot, en examinant soigneusement le caillot pour identifier la tête (généralement l’extrémité légèrement plus épaisse du caillot) et la queue (extrémité opposée à la tête). La tête du caillot doit être positionnée vers le capteur de pression d’entrée et loin de la sortie. Placez le tube à l’extrémité « arrière » du caillot et aspirez-le dans le tube avec la seringue.
   REMARQUE : dans les cas où la directionnalité tête/queue du caillot ne peut pas être déterminée visuellement, la directionnalité peut être attribuée en fonction de la connaissance de la direction de rotation de la boucle de Chandler - la tête du caillot fait face dans la direction opposée de la rotation du tambour.
6. Fixez le tube à l’appareil principal de manière à ce que le caillot soit le plus proche du capteur de pression de sortie (la tête du caillot doit être tournée vers l’opposé du capteur de sortie). Fixez le caillot dans sa position en perforant le tube et la tête du caillot avec deux aiguilles de 30 G en forme de « X ». Laissez ces aiguilles pendant toute la durée de la course.
   REMARQUE : Selon les réglages de l’amortisseur et de la pompe, des aiguilles supplémentaires peuvent être nécessaires pour s’assurer que le caillot ne se fragmente pas prématurément. Si nécessaire, un tamis peut être ajouté au tube en aval du caillot pour empêcher les fragments de caillot de circuler dans le système. Une fois qu’un nombre défini d’aiguilles a été établi pour retenir le caillot, maintenez ce nombre constant dans toutes les conditions.
7. Prenez le reste de la solution en phase mobile et mettez-le dans un tube de 50 ml comme réservoir.
8. Placez le réservoir dans le bain-marie et mettez le tube d’entrée et de sortie (la sortie provient du fluorimètre et l’entrée va dans la tête de pompe).
9. Vérifiez que le fluorimètre utilisé est connecté et surveillé. Au début de l’expérience, vérifiez que la valeur initiale est appropriée par rapport à la ligne de base d’un système mobile en phase uniquement.
   REMARQUE : Si un fluorimètre en ligne n’est pas disponible, un échantillonnage périodique en série du réservoir peut être effectué à des intervalles définis tout au long de la période d’analyse de la boucle d’écoulement. Les fractions collectées peuvent être lues à l’aide d’une plaque à 96 puits immédiatement après la fin de l’expérience sur n’importe quel spectrophotomètre disponible dans le commerce.
10. Ajoutez 500 μL de tPA de 100 000 ng/mL directement dans le volume du réservoir pour obtenir une concentration finale de 1 000 ng/mL de tPA dans 50 mL. Le volume, la concentration et le médicament spécifique ajouté dépendront de la concentration circulante cible souhaitée et du volume du réservoir du système.
11. Vérifiez les points suivants avant de démarrer la pompe :
    1. Tous les carrefours sont sécurisés.
    2. Les deux vannes situées au-dessus des capteurs de pression sont dans la position fermée appropriée.
    3. Tout plasma (ou fluide) résiduel a été remplacé dans le réservoir.
    4. Le thrombolytique a été ajouté au réservoir et correctement mélangé.
    5. Le tube d’entrée se trouve près du fond du réservoir (ce qui garantit un minimum de bulles).
    6. Le tube de sortie est sécurisé et à la hauteur appropriée pour la pression souhaitée (selon l’emplacement de la cuve modélisé).
    7. Le sens de rotation de la pompe est correct (ordre d’écoulement : pompe > amortisseur > caillot > fluorimètre > réservoir > pompe).
    8. Si le régime de la pompe est réglé très haut (>150 tr/min), démarrez à une vitesse plus lente et augmentez la vitesse pour vous assurer que le changement rapide de pression ne fragmente pas le caillot ou ne provoque pas de fuite du tuyau.
    9. S’assurer que le système enregistre correctement les données du fluorimètre et/ou que les fournitures sont préparées pour l’échantillonnage périodique de la phase mobile pour les lectures de points temporels après l’expérience.
12. Allumez la pompe et réglez-la pour atteindre le débit volumétrique souhaité de 160 mL/min ou augmentez le débit jusqu’à ce que la pression souhaitée soit atteinte. Le système se remplira de liquide et de bulles. Les bulles augmenteront artificiellement les lectures fluorométriques, alors surveillez les bulles pour qu’elles disparaissent. Une fois qu’ils l’ont fait, éteignez les lumières et commencez l’acquisition des données.
13. Laissez la pompe fonctionner jusqu’à ce que le caillot soit considérablement dégradé ou que le temps expérimental souhaité se soit écoulé (≥60 min). Ajoutez des réactifs, au besoin, au système tout au long de l’expérience via le réservoir pour créer des conditions expérimentales uniques testant une variété de variations thrombolytiques.
    REMARQUE : La durée de l’expérience dépendra du débit de la pompe (niveau de cisaillement) et de la concentration de thrombolytique.
14. Une fois le test terminé, réduisez le débit volumétrique et retirez le tube d’entrée pendant que la pompe fonctionne encore pour pousser la majeure partie du fluide du système dans le réservoir (une partie de la phase mobile restera dans le tube). Débranchez la section du tube contenant le caillot du côté du capteur de pression de sortie du tube et abaissez-le dans un bateau de pesée.
15. Retirez les aiguilles qui maintiennent le caillot en place pour recueillir le liquide restant de l’intérieur du système et le caillot/fragments de caillot. Utilisez une seringue pour aider à nettoyer le système au besoin.
16. Pesez et traitez le caillot restant pour des analyses supplémentaires telles que le calcul du pourcentage de masse perdue ou pour l’histologie.

5. Nettoyage du système

1. Entre les échantillons, rincez l’ensemble du système à l’eau tiède à haut régime (>150 tr/min). Chargez l’eau dans le réservoir et faites couler l’eau dans le système pendant au moins 2 min, videz-la et revenez deux fois pour rincer complètement le système. Après ces rinçages, si la lecture du fluorimètre ne revient pas à la valeur de base, répétez le processus de rinçage pour un cycle supplémentaire. S’il n’est toujours pas revenu à la ligne de base, changez complètement le tube avant d’analyser l’échantillon suivant.
   REMARQUE : Au cours des expériences, les tubes peuvent être réutilisés entre les échantillons ; Cependant, en raison de la perforation avec des aiguilles utilisées pour maintenir le caillot en place, la section du tube entre les capteurs de pression d’entrée et de sortie doit être remplacée après chaque passage. Dans certaines conditions expérimentales, il peut être nécessaire de remplacer l’ensemble de la tubulure après chaque analyse ou chaque analyse de regroupement pour éliminer toute contamination croisée de l’échantillon.
2. Une fois que tous les échantillons ont été analysés pour l’expérimentation de la journée, retirez tous les tubes et jetez-les. Frottez les jonctions en T avec de l’eau chaude et une brosse à poils jusqu’à ce qu’elles soient propres, laissez sécher et rincez les amortisseurs de seringue à l’eau chaude. Utilisez 70% d’EtOH pour aider à la stérilité.

Résultats

Formation de caillot en boucle de Chandler
Lors de la formation des caillots, nous avons généralement visé des quadruples pour nous assurer que s’il existait des valeurs aberrantes de caillots (basées sur la morphologie et la masse macroscopiques), nous avions toujours la capacité d’effectuer des tests de thrombolyse en triple. En supposant des conditions de charge optimales, les caillots devraient tous être assez uniformes en longueur (~3,3 cm), en poids (~100 mg) et en apparence, comme le montre la figure 3. Lors de l’utilisation de FITC-Fg, nous avons également cherché à examiner les caillots sous la lumière UV pour assurer une dispersion relativement uniforme de la fluorescence par opposition aux zones irrégulières de marquage hyper-fluorescent à l’intérieur du caillot. Faire varier le degré de FITC-Fg dans le sang total ne devrait pas modifier le poids ou l’apparence des caillots dans nos concentrations explorées ; cependant, l’architecture des microcaillots a été affectée aux concentrations les plus élevées de FITC-Fg (1:5 FITC-Fg à Fg non modifié). Des travaux antérieurs effectués par Zeng et al. capturent la large gamme de phénotypes de caillots attendus dans la boucle de Chandler en fonction du niveau de cisaillement choisi¹⁶.

Parfois, une coagulation aberrante peut se produire. Les problèmes de formation de caillots les plus courants appartiennent à l’une des deux catégories suivantes : (i) coagulation prématurée et (ii) altération de la coagulation. Dans la coagulation prématurée, tout le volume de sang se solidifie à l’intérieur de la tubulure de l’anse de Chandler. Cela deviendra apparent lorsque la rotation du tambour est activée, car le sang ne « coule » pas, mais se colle plutôt aux parois du tube et tourne à l’unisson. Dans de telles circonstances, ces caillots ne sont pas utilisables et doivent être jetés. Pour éviter cela, assurez-vous qu’une fois que la coagulation est activée avec l’ajout de chlorure de calcium, la boucle est immédiatement fermée et placée sur le tambour rotatif pour que la coagulation s’ensuive. La deuxième circonstance, ou altération de la coagulation, se produit lorsque les échantillons n’ont pas été correctement mélangés ou si le sang a commencé à coaguler avant le début de la rotation, mais pas tout à fait aussi important que dans la circonstance (i). Les caillots présentant les problèmes ci-dessus auront tendance à apparaître filandreux et fragiles lorsqu’ils sont manipulés et ont souvent des masses de caillots considérablement élevées. D’un point de vue phénotypique, ils se rapprochent des caillots observés à des cisaillements veineux très faibles, car cela représente essentiellement une coagulation dans le cadre de la stase. Il faut s’attendre à des caillots irréguliers à l’occasion et les jeter.

Étalonnage du fluorimètre RT-FluFF
Une caractéristique importante du système RT-FluFF est le fluoromètre, ou spectrophotomètre, utilisé pour suivre la thrombolyse au cours de la période de digestion du caillot. Avant toute expérience, il est essentiel de s’assurer du bon fonctionnement du fluorimètre, ou spectrophotomètre. Pour nos besoins, puisque nous avons conçu notre fluorimètre spécifiquement pour l’appareil RT-FluFF, nous devions nous assurer qu’il était bien corrélé avec le spectrophotomètre en présence de quantités connues de dilutions FITC-Fg dans une solution statique (Figure 4A). Une fois que nous avons été en mesure de déterminer avec certitude la plage linéaire de notre fluorimètre, nous avons ensuite cherché à voir comment le fluorimètre se comporterait en présence d’un écoulement. Nous avons vérifié la fonctionnalité en injectant progressivement de la fluorescéine dans la solution qui s’écoule afin de surveiller une augmentation progressive de la fluorescence afin de mieux comprendre la reproductibilité de la lecture du fluorimètre et de déterminer la rapidité avec laquelle la fluorescence s’équilibre dans le système d’écoulement (Figure 4B). Des expériences de suivi ont été réalisées en injectant régulièrement de la fluorescéine et du FITC-Fg dans la solution de manière continue afin de mieux imiter la libération fluorescente continue attendue des expériences de fibrinolyse (figure 4C). On pense que les différences de pente représentées entre FITC-Fg et FITC proviennent des effets de trempe qui se produisent lorsque FITC est conjugué à proximité d’elle-même, par exemple lorsque de nombreuses molécules de FITC sont conjuguées à une seule protéine (fibrinogène dans ce cas). Naturellement, les augmentations et les pentes par étapes différeront non seulement en fonction des concentrations de FITC/FITC-Fg utilisées, mais aussi du nombre de molécules de FITC par fibrinogène. Par extension, il devient essentiel de contrôler le degré de conjugaison de la FITC au fibrinogène lors de la réalisation d’expériences utilisant le RT-FluFF si l’espoir est de comparer les données sur de nombreux lots de caillots. Grâce à des expériences approfondies, nous avons constaté que ~14 conjugaisons FITC par fibrinogène fournissent un bon signal fluorescent pour suivre la digestion du caillot tout en restant stable en solution (agrégation prématurée limitée) et avec un impact minimal sur la microstructure du caillot résultant. Il est important de noter que chaque fois qu’un FITC-Fg pur et non coagulé est analysé dans l’appareil RT-FluFF, l’exposition du FITC-Fg à un cisaillement élevé peut favoriser son agrégation. Ce phénomène est le plus souvent observé aux jonctions des raccords de tubes et à l’intérieur du tube de tête de pompe et, au fil du temps, peut avoir un impact sur la fluorescence disponible en solution.

Lors de la collecte d’échantillons de la boucle d’écoulement à des moments discrets pour lire la fluorescence sur un spectrophotomètre, bon nombre de ces considérations associées à l’étalonnage du fluorimètre ne sont pas nécessaires. Cependant, il est toujours nécessaire d’explorer la plage dynamique du spectrophotomètre spécifique utilisé pour s’assurer que le marquage FITC-Fg, la quantité de FITC-Fg dans le caillot formé par la boucle de Chandler et la taille du caillot sont tous optimisés dans votre système. Il est recommandé que les échantillons soient lus immédiatement après l’isolement du système ou placés dans une plaque à 96 puits pour les lectures multiplex une fois l’expérience terminée. Si nécessaire, les échantillons peuvent être acidifiés directement après le prélèvement afin d’éliminer toute activité enzymatique supplémentaire avant d’être analysés.

Lyse du caillot RT-FluFF
Pour valider le système RT-FluFF à l’aide de caillots formés sous les cisaillements artériels dans la boucle de Chandler, nous avons utilisé du plasma humain comme phase mobile dans l’appareil avec du tPA (Alteplase) comme agent fibrinolytique. Les concentrations de tPA explorées variaient de 0 à 1 000 ng/mL. Pour imiter les conditions d’écoulement pulmonaire humain, la température du réservoir de plasma a été maintenue à 37 °C et physiquement élevée à 8 cm au-dessus du niveau du caillot pour donner une pression d’écoulement moyenne de 12 mmHg avec le débit de la pompe ajusté pour générer un écoulement de cisaillement de ~500 ^s-1 en l’absence de caillot. Des amortisseurs d’écoulement pulsatile ont été ajoutés au système pour assurer une variation minimale entre les pressions de pointe et de creux de la pompe péristaltique afin d’obtenir un taux de cisaillement presque constant (figure 4D). En l’absence d’amortisseur de pression, la pression de sortie de la pompe péristaltique fluctue considérablement en raison de la nature de la façon dont elle produit l’écoulement en éjectant de petits sachets de liquide à travers le système pendant que la tête de la pompe tourne. La lyse des caillots a été observée pendant 60 minutes. Comme prévu, l’augmentation des concentrations de tPA a entraîné une augmentation des taux de lyse du caillot (UFR/minute) et une perte de masse accrue par rapport aux conditions avec moins ou pas de tPA. À une concentration de tPA de 1 000 ng/mL, une lyse du caillot de ~85 % a été obtenue sur une période de digestion de 60 minutes. En examinant les images grossières de caillots subissant une lyse, on peut comprendre que la lyse se produira principalement dans les régions de la queue du caillot avant d’impacter la tête plus densément structurée, comme on le voit à la fois par la dégradation physique de l’architecture du caillot et la perte de fluorescence de surface. L’étirement attendu des caillots se produira également en fonction de la perte d’intégrité mécanique au fil du temps d’une manière dépendante du taux de cisaillement.

Bien que des différences significatives dans les taux de lyse des caillots puissent être appréciées, grossièrement et sur la base de la libération de fluorescence, il n’y a pas de corrélation parfaitement linéaire entre la libération de fluorescence et la quantité de fibrinolytique présente. La figure 5 l’apprécie le mieux. La fibrinolyse dans les caillots à base de WB conduit naturellement à la libération non seulement de fragments de FITC-Fg, mais aussi de globules rouges (GR) qui sont piégés dans les réseaux de fibrine lors de la formation des caillots. La libération de ces globules rouges dans la circulation à l’intérieur de l’appareil RT-FluFF commencera à colorer sensiblement le rouge plasma circulant. Ce changement colorimétrique dans le plasma en circulation peut avoir un impact négatif sur l’émission fluorescente du FITC-Fg en circulation lu par le capteur du fluorimètre. Lorsque les concentrations fibrinolytiques atteignent les limites supérieures, le degré de libération de FITC-Fg dans la solution l’emporte sur les effets des GR sur les émissions de fluorescence.

Figure 1 : Représentation schématique de la configuration de la boucle de Chandler. Les tubes remplis de sang chargés sur le tambour de boucle Chandler sont immergés dans un bain d’eau à 37 °C tout au long du processus de formation du caillot, les lumières étant tamisées. Le tambour est tourné à une vitesse de rotation constante via un moteur à courant continu, un arbre d’entraînement et un tableau de commande. Cette figure a été modifiée à partir de Zeng et al¹⁴. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Représentation schématique du système RT-FluFF. Les composants importants du système sont identifiés sur l’image. Un seul amortisseur de grand volume est illustré dans l’image pour minimiser les pulsations dans le débit associées à l’utilisation d’une pompe péristaltique. En l’absence d’un fluorimètre en ligne, deux options supplémentaires pour l’échantillonnage périodique sont les suivantes : 1) échantillonnage directement à partir du réservoir ; ou 2) l’intégration d’un port d’échantillonnage en ligne pour extraire la phase mobile. Cette figure a été modifiée à partir de Zeng et al¹⁴. Abréviation : RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Caractéristiques grossières du caillot WB de l’anse de Chandler marquées FITC-Fg, y compris la masse et l’apparence physique sous la lumière ambiante et UV. (A) La formation constante de caillots dans diverses conditions de coagulation est réalisable grâce à l’ajustement fin du protocole de formation de caillots de l’anse de Chandler. Il est important de noter que les masses et l’apparence des caillots varient considérablement en fonction du diamètre du tube, de la vitesse de rotation et de la durée de formation du caillot. Les caillots illustrés se sont formés à 37 °C pendant 1 h à un taux de cisaillement de 506 ^s-1. Barres d’échelle = 20 mm. (B) Masses de caillots formées dans la boucle de Chandler en utilisant les rapports respectifs de FITC-Fg. Les données représentent la moyenne ±écart-type pour des points de données supérieurs ou égaux à des points de données triples. Cette figure a été modifiée à partir de Zeng et al¹⁴. Abréviations : FITC-Fg = fibrinogène marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine ; WB = sang total. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Caractérisation du fluorimètre. (A) Comparaison du fluorimètre en ligne RT-FluFF avec un spectrophotomètre dans le contexte de quantités connues de dilutions FITC-Fg. (B) Introduction progressive de la fluorescéine dans le système RT-FluFF pour déterminer la reproductibilité du fluorimètre et le temps d’équilibre de la fluorescence dans le plasma humain en écoulement. (C) Perfusions continues comparant la fluorescéine et la FITC-Fg dans la plateforme RT-FluFF. Les différences de pente proviennent probablement de l’extinction de la fluorescence dans le groupe FITC-Fg. (D) Formes d’onde du capteur de pression de sortie (post-caillot) associées à l’utilisation d’amortisseurs de tailles différentes dans les mêmes conditions de débit volumétrique. Cette figure a été modifiée à partir de Zeng et al¹⁴. Abréviations : FITC-Fg = fibrinogène marqué à l’isothiocyanate de fluorescéine ; RT-FluFF = Dosage de fibrinolyse par écoulement fluorométrique en temps réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Thrombolyse dans la plateforme RT-FluFF. (A) Des pentes représentatives de fluorescence augmentent au cours de 60 min de digestion du caillot en présence de tPA circulant. Notez le temps de latence initial de la thrombolyse, car l’activation du plasminogène par le tPA et la digestion des caillots n’est pas instantanée. (B) Pourcentage de masse de caillot perdue à diverses concentrations de tPa et à diverses modalités de thrombolyse, y compris : le système RT-FluFF, la digestion du caillot en boucle de Chandler sous cisaillement constant et la digestion statique (sans cisaillement) du caillot. Les données représentent la moyenne ± l’écart-type pour des points de données supérieurs ou égaux à des points de données triples, les astérisques doubles indiquant une valeur p < 0,01 et les astérisques triples signifiant une valeur p < 0,001. (C) Caractéristiques globales de la thrombolyse à 200 ng/mL de tPA. Cette figure a été modifiée à partir de Zeng et ^al.14. Abréviations : RT-FluFF = Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay ; tPA = activateur tissulaire du plasminogène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Formation et étiquetage des caillots
Il a été démontré que la boucle de Chandler fournit un moyen facile et efficace de générer de manière reproductible des caillots qui imitent les thrombus¹⁶ in vivo. Des paramètres de réglage précis tels que la taille du tube, les vitesses de rotation, le diamètre du tambour et le temps de coagulation permettent la génération rapide de caillots dans différentes conditions de cisaillement qui peuvent capturer des caractéristiques architecturales appréciées dans une gamme de thrombus imitant à la fois les sources artérielles et veineuses. La flexibilité supplémentaire de pouvoir introduire des marqueurs tels que FITC-Fg élargit les utilisations potentielles de ces thrombi, comme nous l’avons démontré dans le système RT-FluFF. Aussi rudimentaires que soient les principes sous-jacents de la boucle de Chandler, il reste une courbe d’apprentissage initiale abrupte associée à une formation constante de caillots tout en manipulant simultanément du sang et des produits sanguins tout au long du processus de formation des caillots. Cela provient du fait que la coagulation de la WB est extrêmement sensible à la manipulation dans les instants précédant et suivant le début de la coagulation. Le choix de la tubulure utilisée lors de l’étape de formation du caillot dans l’anse de Chandler est particulièrement important, car les interactions avec la surface du sang peuvent avoir un impact sur la progression de la formation du caillot. La tubulure doit être de qualité médicale ou chirurgicale (apyrogène et non hémolytique) et présenter une faible bioréactivité. Comme nous l’avons vu dans nos résultats, la variation des caillots formés est attendue dans les phases initiales d’apprentissage de la technique lors du développement de son flux de travail optimal basé sur l’échelle expérimentale et les modifications uniques du test. L’obtention éventuelle de la reproductibilité est cruciale compte tenu de l’impact de l’architecture du caillot sur le comportement d’un caillot lors de la fibrinolyse. Enfin, une variation de la coagulation, même chez des volontaires sains, est également à prévoir et doit être prise en compte lors de la conception de l’expérience.

Test RT-FluFF
La quantification fluorométrique/spectrophotométrique de la fibrinolyse avec FITC-Fg comme marqueur offre de nombreux avantages par rapport aux techniques classiques qui reposaient principalement sur l’évaluation de la masse de caillots finaux. La capacité de surveiller, en temps réel ou en temps quasi réel, la dynamique de la fibrinolyse dans un environnement qui se rapproche des paramètres de flux physiologiques représente une amélioration significative par rapport aux tests traditionnels de dépistage de médicaments fibrinolytiques. Ce test a été intentionnellement conçu à l’échelle présentée pour ressembler davantage à la taille des caillots, au champ d’écoulement, au débit volumétrique et à la charge massique des caillots cliniquement pertinents, plutôt que d’adopter une approche microfluidique entièrement miniaturisée. La réduction de l’appareil RT-FluFF signifierait qu’il faudrait utiliser des tubes de plus petit diamètre et/ou des distances de tubes plus courtes. En conséquence, le système commencerait à s’écarter des modèles d’écoulement souhaités et de la pertinence physiologique. Semblable à la boucle de Chandler, le système RT-FluFF permet de contrôler des paramètres tels que le taux de cisaillement en modulant les pressions d’écoulement sous un débit constant et le contrôle du fluide d’écoulement utilisé. De plus, le système RT-Fluff peut également s’adapter au flux pulsatile et aux géométries uniques de digestion par caillot tout en permettant un échantillonnage périodique de la phase mobile tout au long du processus de digestion, ce qui n’est pas possible dans une boucle de Chandler en raison de sa configuration de digestion fermée rotative. L’impact de ces paramètres sur la lyse des caillots a été exploré en profondeur dans le cadre de Zeng et ^al.14.

Pris ensemble, les caillots formés en boucle de Chandler et la tubulure de test RT-FluFF peuvent être du même diamètre ou varier à la fois aux étapes de formation et de digestion du caillot pour atteindre différents niveaux d’occlusion, modélisant jusqu’à une occlusion presque complète du vaisseau pour imiter la thromboembolie. Tous les tests décrits dans le présent document ont utilisé le même diamètre de tube dans la boucle de Chandler et le système RT-FluFF. Avec l’augmentation du diamètre du tube dans le système RT-FluFF, il peut être nécessaire d’augmenter le volume du réservoir en phase mobile pour s’adapter au volume supplémentaire nécessaire pour remplir le système. L’augmentation du volume du réservoir peut également augmenter la quantité nécessaire de thrombolytique/médicament à ajouter au système et augmenterait également les besoins en plasma ou en phase mobile. Bien que l’utilisation du plasma autologue soit idéale, il faudrait prélever des quantités excessivement importantes de sang chez des donneurs individuels pour tenir compte de la formation du caillot de l’anse de Chandler et des volumes de phase mobile RT-FluFF dans tous les tests et répétitions nécessaires à la réalisation d’une expérience complète. Pour cette raison, on utilisait couramment du plasma groupé de type apparié, acquis auprès d’un centre de don de sang ou acheté auprès d’un fournisseur commercial. Bien que la tubulure globale du test RT-FluFF puisse être raccourcie dans une certaine mesure, il existe des limites telles que tous les composants ont suffisamment d’espace pour rester dans la boucle pour exécuter les expériences de digestion. Il est particulièrement important de noter que la longue partie du tube utilisée en amont du caillot lui-même doit dépasser une longueur minimale, calculée en fonction du diamètre du tube et du débit, de sorte que le flux laminaire est atteint au moment où le flux atteint le caillot en suspension. Quel que soit le choix de la taille de la tubulure, les mêmes considérations détaillées dans l’étape de formation du caillot de la boucle de Chandler doivent également être appliquées à la tubulure du système RT-FluFF. Il est important de rappeler que le tube entre les capteurs de pression, où le caillot formé en boucle de Chandler est fixé en place par deux aiguilles insérées en « X », doit être remplacé après chaque essai pour éviter que des fuites ne se produisent aux sites de ponction de l’aiguille. L’utilisation d’aiguilles pour maintenir le caillot en place pendant la digestion sous le débit limite le regroupement des caillots et offre des capacités d’orientation du caillot par rapport à la direction de l’écoulement afin d’améliorer la cohérence d’un test à l’autre. Bien qu’un seul essai représentatif de digestion par caillot à l’aide du tPA soit décrit dans le présent document, la boucle de Chandler et le test RT-FluFF offrent un haut degré de personnalisation pour s’adapter à une grande variété de structures de caillots, de molécules rapporteures, de taux de cisaillement et de conditions de digestion pour tester de nouveaux fibrinolytiques.

Limitations
Comme pour toutes les plateformes ou méthodes actuellement utilisées pour cribler les médicaments fibrinolytiques, le test RT-FluFF souffre également de certaines faiblesses qui doivent être reconnues. Premièrement, les caillots formés dans l’anse de Chandler, bien qu’ils présentent des motifs couramment présents dans les caillots in vivo , se forment toujours dans un environnement différent des caillots in vivo où le flux pulsatile et l’interaction avec l’endothélium existent¹⁷ De plus, même si les concentrations de FITC-Fg ont été optimisées pour minimiser les effets sur l’architecture du caillot, l’ajout du fibrinogène modifié représente toujours un écart par rapport aux conditions physiologiques. Le choix du plasma en phase mobile peut avoir un impact sur l’utilisation d’un fluorimètre, car il y aura une petite quantité de signal de fond associée à la teneur en protéines et en lipides du plasma qui peut varier d’un donneur à l’autre. Une limitation potentiellement importante de la configuration RT-FluFF est l’impact négatif des globules rouges sur les lectures fluorométriques, ce qui limite l’utilisation de la WB en tant que phase mobile lors de l’utilisation de FITC comme marqueur fluorescent de digestion des caillots. Une méthode réalisable pour atténuer ce phénomène consiste à introduire une étape de centrifugation dans les globules rouges des pastilles avant de lire des points temporels discrets sur un spectrophotomètre ou à utiliser une autre étiquette de rapporteur de digestion de caillot qui est moins affectée par la présence de globules rouges¹⁸. Une attention particulière doit être prise en fonction de la conception du test pour s’assurer que les variables importantes sont contrôlées. Par exemple, si le plasma est la phase mobile de choix, il est préférable de regrouper le plasma de plusieurs donneurs afin de minimiser la coagulation d’un donneur à l’autre et la variabilité de la fibrinolyse. Enfin, comme pour toute protéine marquée par fluorescence, le problème de l’extinction se pose naturellement en raison de la présence de l’étiquette FITC à proximité relative l’une de l’autre à la surface du fibrinogène¹⁹.

Conclusions et orientations futures
L’étude d’un processus dynamique tel que la thrombolyse nécessite un environnement tout aussi dynamique dans lequel les conditions physiologiques peuvent être reproduites et plusieurs paramètres peuvent être contrôlés simultanément. Le système haute fidélité RT-FluFF comble cette lacune et servira d’outil important dans le développement et le dépistage futurs de nouveaux thrombolytiques avant leur traduction en modèles animaux. RT-FluFF est une plate-forme très polyvalente, avec de multiples capacités qui n’ont pas été discutées ici, mais qui pourraient certainement être incorporées dans des protocoles en fonction des besoins uniques de la conception de médicaments pharmaceutiques, du mode d’action ou de la réplication de divers états de la maladie de la coagulation. Les avantages que nous avons pu apprécier dans le système RT-FluFF sont les suivants : (a) géométries et configurations variables des tubes, (b) surveillance de la pression en temps réel corrélée au degré d’occlusion de la lumière, (c) mesures de fluorescence en temps réel ne nécessitant aucune intervention de l’utilisateur, (d) flexibilité de la durée du test et de la fréquence de l’échantillon, (e) utilisation d’un réservoir pour imiter les conditions in vivo , (f) des modèles d’écoulement de cisaillement in vivo, (g) la possibilité d’inclure un flux pulsatile, (h) une flexibilité significative dans la formation de l’anse de Chandler d’analogues de caillots distincts représentatifs de la maladie, (i) la possibilité de tester les impacts des médicaments sur la formation ou la digestion des caillots, et (j) l’imagerie directe du substrat de caillot pour suivre la digestion des caillots en vrac à travers le tube transparent permet en outre la post-digestion, Analyse vidéo longitudinale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
30 G  ; Aiguilles hypodermiques jetables	Exel International  ;	26439	Autres consommables
Barre de tour HSS de 6 mm Outil de stock Uxcell B07SXGSQ82 boucle Chandler de 150 mm de long			,  ;
Microplaque transparente à fond plat à 96 puits transparente aux rayons UV	Corning	3635	Autres consommables, copolymère acrylique non traité, non stérile
Air-Tite Luer-lock Non stérile Seringues de 60 mL	Air-Tite	MLB3	RT-FluFF Appareil, amortisseurs
Système d’eau ultrapure Arium Mini Plus	Sartorius	NA	DI source d’eau
Chlorure de calcium	Millipore Sigma	C5670	Autres consommables
Transducteurs BP jetables	Instruments AD	MLT0670	Appareil RT-FluFF
Dräger Siemans HemoMed Pod	Dräger	5588822	Appareil RT-FluFF
Dräger Moniteur patient Siemans	Dräger	SC 7000	RT-FluFF
Appareil Tambour (cylindre, diamètre 120 mm, largeur 85 mm)			Boucle de Chandler,
visière faciale	Moxe	SHIELDS10	Boucle de Chandler,  ;
Fibrinogène à partir de plasma humain, Alexa Fluor 488 Conjugué	Thermo Scientific	F13191	Autres consommables
Raccord, Polycarbonate, Robinet d’arrêt à quatre voies, Luer Lock mâle, non stérile	Masterflex	30600-04	Appareil RT-FLUFF
fluorescéine (FITC)	Thermo Scientific	119245000	Autres consommables
Bain-marie à usage général	Thermo Scientific	2839	Boucle de Chandler,  ;
Plaque chauffante 4 & times ; 4	Fisher Scientific	1152016H	RT-FluFF
Appareil Plasma de source humaine Zen-Bio		SER-SPL	Autres consommables, anticoagulant CPDA-1
Sang total humain  ;	Zen-Bio	SER-WB-SDS  ;	Autres consommables, anticoagulant CPDA-1
Tête de pompe L/S EASY-LOAD II pour tubes de précision haute performance, boîtier PPS, rotor en acier inoxydable	Masterflex	77200-62	RT-FluFF Appareil, tête de pompe
L/S Pompe à entraînement numérique à vitesse variable L/S avec E/S à distance, 6 à 600 tr/min ; 90 à 260 VAC	Masterflex	7528-10	RT-FLUFF Appareil, contrôleur
vitesse du moteur	CoCocina	ZK-MG	Chandler loop,  ;
Nalgene Tubing T-Type Connectors	Thermo Scientific	6151-0312	RT-FluFF Appareil
Tube de pompe péristaltique  ;	Masterflex	06424-15  ;	Autres consommables
Solution saline tamponnée au phosphate	Millipore Sigma	P3813	Autres consommables, poudre, pH 7,4, pour la préparation de solutions de 1 L
Alimentation à découpage	SoulBay	UC03U	Chandler loop,  ;
Thermo Scientific National Target Seringues jetables entièrement en plastique 10 mL	Thermo Scientific	S751010	Autres consommables
Activateur tissulaire du plasminogène, humain	Millipore Sigma	T0831	Autres consommables
Tube ID 1/4'', OD 3/8''Fisher	Scientific	AGL00017	Autres consommables, coupés en sections de 1,5 cm Utiliser pour connecter le tube aux connecteurs
de type TTube ID 5/32 », OD 7/32"	Tygon	ND-100-65, ADF 00009  ;	Autres consommables
V3 365 nm Mini - Lampe de poche UV à lumière noire	uvBeast	uvB-V3-365-MINI	Boucle de Chandler, utilisée pour vérifier les caillots terminés
ZGA37RG ZYTD520 Moteur à courant continu, 12 V, 100 tr/min	Pangyoo	ZGA37RG	boucle de Chandler,

de de pompe