Les tests de thrombolyse in vitro ont souvent eu du mal à reproduire les conditions in vivo, que ce soit dans le thrombus modèle digéré ou dans l’environnement dans lequel la thrombolyse se produit. Dans cet article, nous explorons comment le couplage de la boucle de Chandler et du test de fibrinolyse par écoulement fluorométrique en temps réel (RT-FluFF) est utilisé pour la surveillance de la lyse des caillots haute fidélité, ex-vivo.
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Article de méthode
Suivi de la fibrinolyse de caillots de sang total formés en boucle de Chandler sous flux de cisaillement dans un modèle de thrombolyse in vitro
Dans cet article
Résumé
Résumé
La thromboembolie et les complications qui y sont associées sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde, et divers tests ont été mis au point pour tester l’efficacité des médicaments thrombolytiques in vitro et in vivo. Il existe une demande croissante de modèles de caillots in vitro plus pertinents sur le plan physiologique pour le développement de médicaments en raison de la complexité et du coût associés aux modèles animaux, en plus de leur manque souvent de translatibilité à la physiologie humaine. Le débit, la pression et le taux de cisaillement sont des caractéristiques importantes du système circulatoire, les caillots qui se forment sous l’écoulement présentant des caractéristiques de morphologie et de digestion différentes de celles des caillots formés statiquement. Ces facteurs sont souvent non représentés dans les tests conventionnels de digestion par caillot in vitro , ce qui peut avoir des implications pharmacologiques qui ont un impact sur les taux de réussite de la traduction des médicaments.
Le testd’ibrinolyse orométrique F lowing FR eal-T ime Flu(RT-FluFF) a été développé en tant que plate-forme de test de thrombolyse haute fidélité qui utilise des caillots marqués par fluorescence formés sous écoulement de cisaillement, qui sont ensuite digérés à l’aide de plasma circulant en présence ou en l’absence d’agents pharmaceutiques fibrinolytiques. La modification des débits des étapes de formation et de digestion des caillots permet au système d’imiter les conditions artérielles, pulmonaires et veineuses dans des configurations expérimentales très diverses. Les mesures peuvent être prises en continu à l’aide d’un fluorimètre en ligne ou en prenant des points temporels discrets, ainsi qu’une mesure conventionnelle de la masse du caillot final. Le test RT-FluFF est un système flexible qui permet le suivi en temps réel de la digestion des caillots dans des conditions d’écoulement qui représentent plus précisément les conditions physiologiques in vivo tout en conservant le contrôle et la reproductibilité d’un système de test in vitro.
Introduction
Les maladies découlant fondamentalement d’étiologies thrombo-emboliques représentent une source majeure de morbidité et de mortalité dans la société actuelle. Les manifestations de la pathogenèse thrombo-embolique comprennent, sans s’y limiter, les infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires1. Une énorme quantité de recherches en cours, couvrant plusieurs disciplines, tourne autour de la mise au point de méthodes sûres et efficaces pour traiter la thrombose pathogène. Les variations dans les manifestations artérielles et veineuses de la thrombose et les d....
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Protocole
Toutes les méthodes mentionnées ci-dessous sont conformes aux protocoles du comité d’examen institutionnel (IRB) et du comité d’éthique de la recherche humaine de l’établissement. Tous les volontaires en bonne santé ont fourni un consentement écrit et éclairé avant le don de sang. Il convient de noter que tous les documents mentionnés dans le protocole se trouvent dans le Tableau des matériaux. Bien que la WB et le plasma humains soient abordés tout au long de ce protocole, l’utilisation de sang d’animaux de recherche et de produits sanguins appauvris en facteurs peut être achetée et remplacée.
1. Prélèvement de sang ....
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Résultats
Formation de caillot en boucle de Chandler
Lors de la formation des caillots, nous avons généralement visé des quadruples pour nous assurer que s’il existait des valeurs aberrantes de caillots (basées sur la morphologie et la masse macroscopiques), nous avions toujours la capacité d’effectuer des tests de thrombolyse en triple. En supposant des conditions de charge optimales, les caillots devraient tous être assez uniformes en longueur (~3,3 cm), en poids (~100 mg) et en apparence, comme le montre
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Discussion
Formation et étiquetage des caillots
Il a été démontré que la boucle de Chandler fournit un moyen facile et efficace de générer de manière reproductible des caillots qui imitent les thrombus16 in vivo. Des paramètres de réglage précis tels que la taille du tube, les vitesses de rotation, le diamètre du tambour et le temps de coagulation permettent la génération rapide de caillots dans différentes conditions de cisaillement qui peuvent capturer des caractéristiques arch.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Heart, Lung, And Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01HL167877. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 30 G ; Aiguilles hypodermiques jetables | Exel International ; | 26439 | Autres consommables |
| Barre de tour HSS de 6 mm Outil de stock Uxcell B07SXGSQ82 boucle Chandler de 150 mm de long | , ; | ||
| Microplaque transparente à fond plat à 96 puits transparente aux rayons UV | Corning | 3635 | Autres consommables, copolymère acrylique non traité, non stérile |
| Air-Tite Luer-lock Non stérile Seringues de 60 mL | Air-Tite | MLB3 | RT-FluFF Appareil, amortisseurs |
| Système d’eau ultrapure Arium Mini Plus | Sartorius | NA | DI source d’eau |
| Chlorure de calcium | Millipore Sigma | C5670 | Autres consommables |
| Transducteurs BP jetables | Instruments AD | MLT0670 | Appareil RT-FluFF |
| Dräger Siemans HemoMed Pod | Dräger | 5588822 | Appareil RT-FluFF |
| Dräger Moniteur patient Siemans | Dräger | SC 7000 | RT-FluFF |
| Appareil Tambour (cylindre, diamètre 120 mm, largeur 85 mm) | Boucle de Chandler, | ||
| visière faciale | Moxe | SHIELDS10 | Boucle de Chandler, ; |
| Fibrinogène à partir de plasma humain, Alexa Fluor 488 Conjugué | Thermo Scientific | F13191 | Autres consommables |
| Raccord, Polycarbonate, Robinet d’arrêt à quatre voies, Luer Lock mâle, non stérile | Masterflex | 30600-04 | Appareil RT-FLUFF |
| fluorescéine (FITC) | Thermo Scientific | 119245000 | Autres consommables |
| Bain-marie à usage général | Thermo Scientific | 2839 | Boucle de Chandler, ; |
| Plaque chauffante 4 & times ; 4 | Fisher Scientific | 1152016H | RT-FluFF |
| Appareil Plasma de source humaine Zen-Bio | SER-SPL | Autres consommables, anticoagulant CPDA-1 | |
| Sang total humain ; | Zen-Bio | SER-WB-SDS ; | Autres consommables, anticoagulant CPDA-1 |
| Tête de pompe L/S EASY-LOAD II pour tubes de précision haute performance, boîtier PPS, rotor en acier inoxydable | Masterflex | 77200-62 | RT-FluFF Appareil, tête de pompe |
| L/S Pompe à entraînement numérique à vitesse variable L/S avec E/S à distance, 6 à 600 tr/min ; 90 à 260 VAC | Masterflex | 7528-10 | RT-FLUFF Appareil, contrôleur |
| vitesse du moteur | CoCocina | ZK-MG | Chandler loop, ; |
| Nalgene Tubing T-Type Connectors | Thermo Scientific | 6151-0312 | RT-FluFF Appareil |
| Tube de pompe péristaltique ; | Masterflex | 06424-15 ; | Autres consommables |
| Solution saline tamponnée au phosphate | Millipore Sigma | P3813 | Autres consommables, poudre, pH 7,4, pour la préparation de solutions de 1 L |
| Alimentation à découpage | SoulBay | UC03U | Chandler loop, ; |
| Thermo Scientific National Target Seringues jetables entièrement en plastique 10 mL | Thermo Scientific | S751010 | Autres consommables |
| Activateur tissulaire du plasminogène, humain | Millipore Sigma | T0831 | Autres consommables |
| Tube ID 1/4'', OD 3/8''Fisher | Scientific | AGL00017 | Autres consommables, coupés en sections de 1,5 cm Utiliser pour connecter le tube aux connecteurs |
| de type TTube ID 5/32 », OD 7/32" | Tygon | ND-100-65, ADF 00009 ; | Autres consommables |
| V3 365 nm Mini - Lampe de poche UV à lumière noire | uvBeast | uvB-V3-365-MINI | Boucle de Chandler, utilisée pour vérifier les caillots terminés |
| ZGA37RG ZYTD520 Moteur à courant continu, 12 V, 100 tr/min | Pangyoo | ZGA37RG | boucle de Chandler, |
Références
- Ali, M. R., et al. Aspect of thrombolytic therapy: a review. Scientific World Journal. 2014, 586510(2014).
- Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboemb....
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Réimpressions et autorisations
