Analyse des interactions ADN-protéines avec l’interférométrie de biocouche à base de streptavidine

Résumé

Cet article décrit un protocole permettant d’étudier les interactions ADN-protéines à l’aide d’un système d’interférométrie de biocouche (BLI) à base de streptavidine. Il décrit les étapes et les considérations essentielles pour l’utilisation de la cinétique de liaison de base ou avancée pour déterminer l’affinité de liaison à l’équilibre (K_D) de l’interaction.

Résumé

Les interactions protéine-ADN sous-tendent les processus cellulaires essentiels. La compréhension de ces interactions est essentielle pour élucider les mécanismes moléculaires de diverses voies. Des facteurs clés tels que la structure, la séquence et la longueur d’une molécule d’ADN peuvent influencer de manière significative la liaison aux protéines. L’interférométrie de biocouche (BLI) est une technique sans marquage qui mesure la cinétique de liaison entre les molécules, offrant une approche simple et précise pour étudier quantitativement les interactions protéine-ADN. L’un des principaux avantages de la BLI par rapport aux méthodes traditionnelles basées sur le gel est sa capacité à fournir des données en temps réel sur la cinétique de liaison, ce qui permet de mesurer avec précision la constante de dissociation à l’équilibre (K_D) pour les interactions dynamiques protéine-ADN. Cet article présente un protocole de base pour déterminer la valeur K_D de l’interaction entre une protéine de réplication de l’ADN, la protéine de réplication A (RPA) et un substrat d’ADN simple brin (ADNsb). La RPA se lie à l’ADNsb avec une grande affinité, mais doit également être facilement déplacée pour faciliter les interactions protéiques ultérieures dans les voies biologiques. Dans le test BLI décrit, l’ADNsb biotinylé est immobilisé sur un biocapteur enrobé de streptavidine. La cinétique de liaison (association et dissociation) de la RPA à l’ADN lié au biocapteur est ensuite mesurée. Les données résultantes sont analysées pour dériver des valeurs précises pour la constante de vitesse d’association (k_a), la constante de vitesse de dissociation (k_d) et la constante de liaison à l’équilibre (K D) à l’aide_d’un logiciel système.

Introduction

Les protéines cellulaires jouent un rôle central dans l’orchestration des processus biologiques complexes qui se produisent dans les organismes vivants. Le fonctionnement optimal de ces voies dépend de l’interaction entre les protéines et d’autres biomolécules à l’intérieur de la cellule, y compris les interactions avec les protéines partenaires et les acides nucléiques¹. Ainsi, la compréhension des subtilités des processus cellulaires nécessite une compréhension approfondie de la dynamique des interactions protéine-acide nucléique.

Traditionnellement, les interactions protéine-acide....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’appât, de l’analyte, des tampons et nettoyage du porte-goutte

1. Installation de l’instrument : Allumez l’instrument au moins 1 h avant de commencer l’expérience. Cela permettra à la lampe de se réchauffer.
2. Préparation des tampons de décapage et de nettoyage
   1. Tampon de décapage : Préparez 50 mL d’acide phosphorique 0,15 M [pH 2,0]).
   2. Tampon de nettoyage : Préparez 10 mL de HCl 0,5 N.

Résultats

Dans le BLI, la lumière blanche est réfléchie par l’interface de la biocouche/tampon et l’interface de référence interne vers le spectromètre. Le motif d’interférence qui en résulte est enregistré, et le décalage spectral est mesuré sur une période de temps et représenté sous forme de courbes de liaison en nm. La figure 1 montre une figure représentative montrant l’extrémité du biocapteur avec et sans liaison à l’analyte et le décalage de longueur d’onde spectrale (nm) correspondant. Les cou.......

Discussion

La capacité d’analyser la cinétique de liaison de n’importe quelle protéine à son substrat à l’aide de BLI permet d’isoler et de caractériser les facteurs spécifiques (tels que la séquence, la structure ou la longueur d’un ADN) régissant les interactions protéine-ADN au sein de la cellule¹⁹. Le système Octet N1, qui s’appuie sur les principes de l’interférométrie des biocouches, permet de mesurer quantitativement les interactions protéine-protéine et protéine-acid.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 mL Micro Tubes à centrifuger	Globe Scientific	111554A
96 Well Standard Black Microplate	Dot Scientific	4ti-0223
Biotinylated poly dT Oligonucleotide	IDT
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153-10G
Dithiothreitol (DTT)	Dot Scientific	DSD11000-10
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Dot Scientific	DSE57020-500
Acide chlorhydrique  ;	Fisher Scientific  ;	A144-500
Kimtec Science Kimwipes  ;	Kimtech	34120
Octet N1 Logiciel	Sartorius  ;	1.4.0.13
Biocapteur Octet SA  ;	Sartorius  ;	18-5019
PBS pH 7,2 (10x)	Gibco	1666711
Personal Assay Octet N1 System	Sartorius  ;
Acide phosphorique  ;	Ward’s Science	470302-024
Chlorure de sodium (NaCl)	Dot Scientific	DSS23020-5000
Tris Base	Dot Scientific	DST60040-5000
Tween20  ;	Bio-Rad	170-6531