Article de méthode

Séparation et affichage rapides d’agents fibrinogénolytiques actifs chez Sipunculus nudus par électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide

DOI :

10.3791/66536

⸱

19 avril 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Quanzhou First Hospital Affiliated to Fujian Medical University, 2Medicine School, Huaqiao University, 3Department of Laboratory Medicine, Hospital of Huaqiao University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons un protocole d’électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide (PAGE) pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques de Sipunculus nudus.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les agents fibrinogénolytiques capables de dissoudre directement le fibrinogène ont été largement utilisés dans le traitement anticoagulant. Généralement, l’identification de nouveaux agents fibrinogénolytiques nécessite d’abord la séparation de chaque composant, puis la vérification de leurs activités fibrinogénolytiques. Actuellement, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et la chromatographie sont principalement utilisées dans l’étape de séparation. Pendant ce temps, le dosage sur plaque de fibrinogène et les produits de réaction PAGE sont généralement adoptés pour montrer leurs activités fibrinogénolytiques. Cependant, en raison de la séparation spatio-temporelle de ces deux étapes, il est impossible de séparer et d’afficher les agents fibrinogénolytiques actifs avec le même gel. Pour simplifier les processus de séparation et d’affichage de l’identification des agents fibrinogénolytiques, nous avons construit une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques des vers d’arachide (Sipunculus nudus) dans cette étude. Cette méthode comprend la préparation de fibrinogène-PAGE, l’électrophorèse, la renaturation, l’incubation, la coloration et la décoloration. L’activité fibrinogénolytique et le poids moléculaire de la protéine peuvent être détectés simultanément. Selon cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénate de ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces dernières années, en raison de l’augmentation continue des maladies thrombotiques, les maladies thrombotiques sont devenues un nouveau problème majeur de santé mondiale1. À l’heure actuelle, les médicaments antithrombotiques sont classés en trois groupes : les médicaments anti-agrégation plaquettaire, les anticoagulants et les médicaments thrombolytiques. Parmi eux, les médicaments thrombolytiques, tels que l’urokinase (Royaume-Uni), l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), etc., sont les seuls médicaments utilisés en clinique qui peuvent hydrolyser le thrombus2. Parallèlement, des médicaments thrombolytiques plus sûrs et plus efficaces sont mis au point grâce à l’identification de nouveaux agents thrombolytiques3.

Cependant, l’identification de nouveaux agents thrombolytiques prend du temps et demande beaucoup de main-d’œuvre, ce qui implique principalement les étapes de séparation/purification et de caractérisation/vérification. La première consiste à séparer chaque composant, et la seconde à afficher leurs activités fibrino(géno)lytiques 4,5. Dans des études précédentes, malgré le fait que nous ayons réussi à isoler une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique (sFE) du ver de l’arachide (Sipunculus nudus) par chromatographie d’affinité et dosage de la plaque de fibrine (ogène) 6,7,8, ces processus prennent beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Tout d’abord, il est nécessaire de déterminer si les homogénats de ver d’arachide ont une activité fibrino(géno)lytique par la méthode sur plaque de fibrine(ogène) et les produits de réaction basés sur la PAGE9. Ensuite, une série de chromatographies, telles que la chromatographie d’échange d’ions, la chromatographie de filtration sur gel, la chromatographie d’affinité et d’autres méthodes, doivent être effectuées pour la séparation et la purification10,11. Par la suite, le dosage de la plaque de fibrine est effectué à nouveau pour vérifier l’activité fibrinogénolytique de chaque composant séparé. Enfin, la PAGE native et le dodécylsulfate de sodium (SDS) sont réalisés pour déterminer le poids moléculaire des agents fibrinogénolytiques actifs12. Par conséquent, il est essentiel de séparer et d’afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs.

Pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs dans les homogénats de vers d’arachide, une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE a été développée en combinant les méthodes PAGE et sur plaque de fibrinogène, c’est-à-dire que les substrats des agents fibrinolytiques fibrinolytiques ont été ajoutés au gel natif-PAGE. Après native-PAGE, les composants ont été séparés en fonction de leur poids moléculaire. Pendant ce temps, chaque composant fibrinogénolytique actif peut être mis en évidence par coloration. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénat du ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation de l’homogénat du ver d’arachide

  1. Ajouter 50 g de vers d’arachide et 150 ml de solution saline dans l’homogénéisateur.
  2. Homogénéiser à 24000 tr/min pendant 60 s.
    REMARQUE : Répétez 3 fois.
  3. Centrifuger l’homogénat à 9710 x g pendant 30 min à 4 °C.
  4. Prélever le surnageant sous forme d’homogénat de vers d’arachide pour une étude plus approfondie.

2. Préparation du gel Fibrinogen-PAGE

  1. Peser 0,01 g de fibrinogène dans un bécher en verre de 50 ml.
  2. Ajouter 1,9 mL de DDH2O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) et 0,05 mL de SDS (10 %, p/v) dans le bécher ; Bien mélanger par pipetage.
  3. Placez le bécher à 37 °C pendant 30 min.
    REMARQUE : Cette étape consiste à dissoudre le fibrinogène.
  4. Ajouter 1,7 mL d’acrylamide (30 %, p/v), 0,05 mL de persulfate d’ammonium (APS ; 10 %, p/v), 0,002 mL de TEMED ; Bien mélanger par pipetage.
    REMARQUE : Il s’agit d’un gel de séparation.
  5. Versez le gel de séparation dans un moule à gel de 10 puits.
  6. Ajouter 2 mL de DDH2O dans le moule à gel ; Attendez 30 min.
  7. Retirez soigneusement l’eau en retournant le moule.
  8. Ajouter 1,4 mL de DDH2O, 0,25 mL de Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL de SDS (10 %, p/v), 0,33 mL d’acrylamide (30 %, p/v), 0,02 mL d’APS (10 %, p/v), 0,002 mL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans le bécher ; Bien mélanger par pipetage.
    REMARQUE : Il s’agit d’un gel de chargement.
  9. Versez le gel de chargement dans le même moule à gel que à l’étape 2.5 ; Insérez le peigne immédiatement.
    REMARQUE : Le gel fibrinogène-PAGE utilisé ici était composé du fibrinogène (0,2 %) contenant du gel séparateur et du gel de charge. La concentration de fibrinogène peut être ajustée au besoin.

3. Électrophorèse

  1. Placez le gel fibrinogen-PAGE préparé avec le moule à colle dans le réservoir d’électrophorèse ; verser 1300 mL de solution d’électrophorèse (1,963 g de Tris, 12,22 g de glycine, 0,65 g de SDS et 1300 mL de DDH2O) dans le réservoir ; Sortez le peigne.
  2. Ajouter 5 μL de tampon de charge 5x non dénaturant aux 20 μL de sFE et 20 μL d’homogénat de ver d’arachide ; bien mélanger par pipetage ; les charger dans le gel fibrinogen-PAGE préparé.
    REMARQUE : Ne faites pas bouillir le mélange. sFE est une enzyme fibrino(géno)lytique identifiée précédemment 6,7,8 et est utilisée comme contrôle positif dans cette étude. L’homogénat de ver de l’arachide est l’échantillon à détecter. Tampon de charge non dénaturant sans bleu de bromophénol, β-mercaptoéthanol et SDS par rapport au tampon de chargement SDS-PAGE. Chaque voie d’échantillonnage est séparée par le tampon de chargement SDS-PAGE 1x pour détecter clairement le mouvement de la protéine.
  3. Effectuez une électrophorèse à 80 V pendant 30 min, ou à 120 V pendant 20 min.
  4. Retirez le gel fibrinogen-PAGE du moule à colle.

4. Renaturation

  1. Transférez le gel fibrinogen-PAGE dans une boîte en plastique.
  2. Ajoutez 100 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) et 2 ml de Triton X-100 dans la boîte. Placez-le sur un shaker à 60-70 tr/min pendant 10 min.
  3. Retirez le tampon de lavage par pipetage.
    REMARQUE : Répétez trois fois.

5. Incubation

  1. Ajouter 50 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) dans la boîte en plastique.
  2. Incuber à 37 °C pendant 4 h.
    REMARQUE : Le temps d’incubation peut être ajusté en fonction de l’intensité de l’activité fibrinogénolytique.

6. Coloration

  1. Retirez le tampon d’incubation par pipetage.
  2. Ajoutez 50 ml de solution de coloration Coomassie Brillant Blue dans la boîte et placez la boîte sur un agitateur à 60-70 tr/min pendant 30 min.

7. Décoloration

  1. Retirez la solution colorante par pipetage.
  2. Ajouter 50 ml de DDH2O dans la boîte.
  3. Placez la boîte sur un shaker à 60-70 tr/min pendant 30 min.
    REMARQUE : DD H2O a été utilisé ici comme solution de décoloration. Le temps d’agitation peut être ajusté en fonction de l’intensité de l’activité fibrinogénolytique.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Après électrophorèse, toutes les bandes du marqueur ont été clairement affichées. Les 1x voies de chargement SDS-PAGE n’affichaient que des bandes de 10 kDa (bleu de bromophénol). Les échantillons de sFE et de vers d’arachide n’ont montré aucune bande observable (figure 1). Bien que les bandes des échantillons ne soient pas visibles, les performances du marqueur et du bleu de bromophénol ont indiqué que l’électrophorèse a été réussie et les échantillons ont été séparés en fonction de leur poids moléculaire.

Bien que l’ensemble du gel soit devenu bleu en raison de la coloration, la décoloration a rendu transparente la zone où le fibrinogène a été dégradé par les agents fibrinogénolytiques. Par rapport au marqueur, le sFE a indiqué une bande fibrinogénolytique active proche de 25 kDa. L’homogénat du ver d’arachide présentait 25 kDa, 33 kDa, 43 kDa et une série de bandes supérieures à 70 kDa (Figure 2). Les résultats ont indiqué que le sFE ne contenait qu’un composant fibrinogénolytique de 25 kDa, mais que l’homogénat du ver de l’arachide contenait des composants sFE et d’autres agents fibrinogénolytiques. La figure supplémentaire 1 est un exemple d’image en gel montrant le marqueur en bleu profond et les échantillons cibles sous forme de bandes brillantes.

figure-results-1
Figure 1 : Gel après électrophorèse. M : Marqueur ; Voie 1 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE ; Couloir 2 : sFE ; Voie 3 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE ; Voie 4 : homogénat de vers d’arachide ; Voie 5 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Gel après décoloration. M : Marqueur ; Voie 1 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE ; Couloir 2 : sFE ; Voie 3 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE ; Voie 4 : homogénat de vers d’arachide ; Voie 5 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Image gel montrant le marqueur en bleu profond et les échantillons cibles sous forme de bandes brillantes. M : Marqueur ; Voie 1 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE ; Couloir 2 : sFE ; Voie 3 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE ; Voie 4 : homogénat de vers d’arachide ; Voie 5 : 1x tampon de chargement SDS-PAGE. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

sFE est une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique isolée à partir de vers d’arachide par notre équipe précédemment 3,6,8,13. Cependant, les processus d’identification de la sFE prenaient du temps et de la main-d’œuvre, impliquant la détection de l’activité fibrinogénolytique, la séparation des composants protéiques et les étapes de confirmation de l’activité. En tant que méthode simple, le dosage sur plaque de fibrinogène est principalement utilisé dans l’étape de criblage préliminaire pour vérifier l’activité fibrinogénolytique des échantillons. Cependant, la méthode de dosage sur plaque de fibrinogène ne peut pas séparer quel composant est actif. Par conséquent, la chromatographie et le natif/SDS-PAGE doivent être utilisés pour séparer leurs composants après la détection de l’activité. Ensuite, les produits de réaction sont à nouveau résolus par le SDS-PAGE pour confirmer la dégradation du fibrinogène du substrat. Dans ce travail, le substrat fibrinogène a été ajouté au gel PAGE pour détecter l’agent fibrinogénolytique. Après électrophorèse, renaturation, incubation, coloration et décoloration, le poids moléculaire et l’activité fibrinogénolytique des agents fibrinogénolytiques actifs ont été clairement affichés avec le même gel. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif dans l’homogénat du ver de l’arachide en 6 heures.

Pour obtenir des résultats optimaux, une plus grande attention doit être accordée à la préparation, à la renaturation et à l’incubation du gel fibrinogen-PAGE. D’une manière générale, plus la concentration de fibrinogène est faible, plus la zone fibrinogénolytique est incolore, ce qui indique l’activité fibrinogénolytique des agents. Cependant, plus la concentration de fibrinogène est faible, plus le fond est incolore et plus il est difficile de distinguer la zone fibrinogénolytique du fond. Le temps de renaturation affectera considérablement l’activité fibrinogénolytique des composants. Si ce temps est trop court pour éliminer le SDS dans le gel PAGE, l’activité fibrinogénolytique des composants sera inhibée par le SDS rémanent. De même, si le temps d’incubation est trop court, la réaction fibrinogénolytique n’est pas complète. Lorsque le temps d’incubation est trop long, le marqueur utilisé pour indiquer le poids moléculaire sera emporté. Dans cette étude, bien que ces conditions aient été optimisées, ces conditions ont été définies pour séparer et afficher les agents fibrinogénolytiques des vers d’arachide. Ainsi, les conditions personnalisées de ces étapes critiques doivent être définies en fonction d’agents fibrinogénolytiques spécifiques.

Il est important de mentionner que ce fibrinogène-PAGE ne convient qu’au criblage des agents fibrinogénolytiques ayant une activité lytique du fibrinogène, mais pas aux agents ayant une activité lytique du fibrinogène ou une activité d’activation du plasminogène. Si nous voulons afficher ces activités, la méthode peut être optimisée en remplaçant le fibrinogène par de la fibrine ou du plasminogène. Un autre point à noter est que les agents fibrinogénolytiques actifs testés dans cette étude étaient des monomères, qui n’ont pas été affectés dans la condition d’électrophorèse SDS. Par conséquent, si les agents testés sont des polymères, cette méthode doit être ajustée à une condition native-PAGE qui ne peut pas afficher la masse moléculaire. Par conséquent, la méthode fibrinogène-PAGE introduite ici n’était qu’une version de base générale, qui peut être optimisée pour cribler rapidement les autres agents fibrinogénolytiques.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par le Bureau des sciences et de la technologie de la ville de Xiamen (n° 3502Z20227197), le Bureau des sciences et de la technologie de la province du Fujian (n° 2019J01070 ; n° 2022J01311), et le projet d’innovation et d’entrepreneuriat de haut niveau des talents du plan scientifique et technologique de Quanzhou (n° 2022C015R). Nous remercions Fucai Wang (Université de Huaqiao) et Lei Tong (Université de Huaqiao) pour leur assistance technique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1  ; M Tris-HCl (pH 6,8)SolarbioT1020
1,5 M Tris-HCl (pH 8,8)SolarbioT1010
30 % Acrylamide/Bis-acrylamideBiosharpBL513B
Persulfate d’ammoniumXiLONG SCIENTIFIC7727-54-0
BécherPYREX2-9425-02
Tube à centrifuger (1,5 mL)BiosharpBS-15-M
Incubateur à température constanteJINGHONGJHS-400
Coomas Brillant Blue Solution de colorationBeyotimeP0017F
Balance analytique électroniqueDENVERTP-213
FibrinogenSolarbioF8051
Pointes de pipette de chargement de gel, BulkBiosharpBS-200-GTB
HomogénéisateurAHSATS-1500
Oscillateur à rotation horizontaleNuoMiNMSP-600
Milli-Q RéférenceMilliporeZ00QSV0CN
Mini-PROTEAN Tetra CellBIO-RAD165-8000~165-8007
N,N,N',N'-TetramethylethylenediamineSigmaT9281
Pointe de pipette (1 mL)PointeAxygene T-1000XT-C
(10 µ ; L)AxygeneT-10XT-C
Pointe de pipette (200 µ ; L)Pipette AxygeneT-200XT-C
(1 mL)PipetteThermo Fisher ScientificZY18723
(10µ ; L)Pipette Thermo Fisher ScientificZX98775
(200 & micro ; L)Pipette Thermo Fisher ScientificZY20280
(50 µ ; L)Thermo Fisher ScientificZY15331
Centrifugeuse réfrigéréecenceH1650R
Dodécylsulfate de sodiumSigma-AldrichV900859
TrisSolarbioT8060
Tris-HClSolarbioT8230
Triton X-100SolarbioT8200
de pipette

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
  2. Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
  3. Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
  4. Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
  5. Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
  6. Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
  7. Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
  8. Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
  9. Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
  10. Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
  11. Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
  12. Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
  13. Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).

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