Ici, nous présentons un protocole d’électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide (PAGE) pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques de Sipunculus nudus.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Séparation et affichage rapides d’agents fibrinogénolytiques actifs chez Sipunculus nudus par électrophorèse sur gel fibrinogène-polyacrylamide
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les agents fibrinogénolytiques capables de dissoudre directement le fibrinogène ont été largement utilisés dans le traitement anticoagulant. Généralement, l’identification de nouveaux agents fibrinogénolytiques nécessite d’abord la séparation de chaque composant, puis la vérification de leurs activités fibrinogénolytiques. Actuellement, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) et la chromatographie sont principalement utilisées dans l’étape de séparation. Pendant ce temps, le dosage sur plaque de fibrinogène et les produits de réaction PAGE sont généralement adoptés pour montrer leurs activités fibrinogénolytiques. Cependant, en raison de la séparation spatio-temporelle de ces deux étapes, il est impossible de séparer et d’afficher les agents fibrinogénolytiques actifs avec le même gel. Pour simplifier les processus de séparation et d’affichage de l’identification des agents fibrinogénolytiques, nous avons construit une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques des vers d’arachide (Sipunculus nudus) dans cette étude. Cette méthode comprend la préparation de fibrinogène-PAGE, l’électrophorèse, la renaturation, l’incubation, la coloration et la décoloration. L’activité fibrinogénolytique et le poids moléculaire de la protéine peuvent être détectés simultanément. Selon cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénate de ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.
Introduction
Ces dernières années, en raison de l’augmentation continue des maladies thrombotiques, les maladies thrombotiques sont devenues un nouveau problème majeur de santé mondiale1. À l’heure actuelle, les médicaments antithrombotiques sont classés en trois groupes : les médicaments anti-agrégation plaquettaire, les anticoagulants et les médicaments thrombolytiques. Parmi eux, les médicaments thrombolytiques, tels que l’urokinase (Royaume-Uni), l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), etc., sont les seuls médicaments utilisés en clinique qui peuvent hydrolyser le thrombus2. Parallèlement, des médicaments thrombolytiques plus sûrs et plus efficaces sont mis au point grâce à l’identification de nouveaux agents thrombolytiques3.
Cependant, l’identification de nouveaux agents thrombolytiques prend du temps et demande beaucoup de main-d’œuvre, ce qui implique principalement les étapes de séparation/purification et de caractérisation/vérification. La première consiste à séparer chaque composant, et la seconde à afficher leurs activités fibrino(géno)lytiques 4,5. Dans des études précédentes, malgré le fait que nous ayons réussi à isoler une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique (sFE) du ver de l’arachide (Sipunculus nudus) par chromatographie d’affinité et dosage de la plaque de fibrine (ogène) 6,7,8, ces processus prennent beaucoup de temps et de main-d’œuvre. Tout d’abord, il est nécessaire de déterminer si les homogénats de ver d’arachide ont une activité fibrino(géno)lytique par la méthode sur plaque de fibrine(ogène) et les produits de réaction basés sur la PAGE9. Ensuite, une série de chromatographies, telles que la chromatographie d’échange d’ions, la chromatographie de filtration sur gel, la chromatographie d’affinité et d’autres méthodes, doivent être effectuées pour la séparation et la purification10,11. Par la suite, le dosage de la plaque de fibrine est effectué à nouveau pour vérifier l’activité fibrinogénolytique de chaque composant séparé. Enfin, la PAGE native et le dodécylsulfate de sodium (SDS) sont réalisés pour déterminer le poids moléculaire des agents fibrinogénolytiques actifs12. Par conséquent, il est essentiel de séparer et d’afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs.
Pour séparer et afficher rapidement les agents fibrinogénolytiques actifs dans les homogénats de vers d’arachide, une nouvelle méthode fibrinogène-PAGE a été développée en combinant les méthodes PAGE et sur plaque de fibrinogène, c’est-à-dire que les substrats des agents fibrinolytiques fibrinolytiques ont été ajoutés au gel natif-PAGE. Après native-PAGE, les composants ont été séparés en fonction de leur poids moléculaire. Pendant ce temps, chaque composant fibrinogénolytique actif peut être mis en évidence par coloration. Grâce à cette méthode, nous avons réussi à détecter plus d’un agent fibrinogénolytique actif de l’homogénat du ver de l’arachide en 6 heures. De plus, cette méthode fibrinogen-PAGE est rapide et économique. De plus, cette méthode pourrait être utilisée pour étudier les agents fibrinogénolytiques des autres organismes.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
1. Préparation de l’homogénat du ver d’arachide
- Ajouter 50 g de vers d’arachide et 150 ml de solution saline dans l’homogénéisateur.
- Homogénéiser à 24000 tr/min pendant 60 s.
REMARQUE : Répétez 3 fois. - Centrifuger l’homogénat à 9710 x g pendant 30 min à 4 °C.
- Prélever le surnageant sous forme d’homogénat de vers d’arachide pour une étude plus approfondie.
2. Préparation du gel Fibrinogen-PAGE
- Peser 0,01 g de fibrinogène dans un bécher en verre de 50 ml.
- Ajouter 1,9 mL de DDH2O, 1,3 mL de Tris-HCl (1,5 M, pH 8,8) et 0,05 mL de SDS (10 %, p/v) dans le bécher ; Bien mélanger par pipetage.
- Placez le bécher à 37 °C pendant 30 min.
REMARQUE : Cette étape consiste à dissoudre le fibrinogène. - Ajouter 1,7 mL d’acrylamide (30 %, p/v), 0,05 mL de persulfate d’ammonium (APS ; 10 %, p/v), 0,002 mL de TEMED ; Bien mélanger par pipetage.
REMARQUE : Il s’agit d’un gel de séparation. - Versez le gel de séparation dans un moule à gel de 10 puits.
- Ajouter 2 mL de DDH2O dans le moule à gel ; Attendez 30 min.
- Retirez soigneusement l’eau en retournant le moule.
- Ajouter 1,4 mL de DDH2O, 0,25 mL de Tris-HCl (1,0 M, pH 6,8), 0,02 mL de SDS (10 %, p/v), 0,33 mL d’acrylamide (30 %, p/v), 0,02 mL d’APS (10 %, p/v), 0,002 mL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans le bécher ; Bien mélanger par pipetage.
REMARQUE : Il s’agit d’un gel de chargement. - Versez le gel de chargement dans le même moule à gel que à l’étape 2.5 ; Insérez le peigne immédiatement.
REMARQUE : Le gel fibrinogène-PAGE utilisé ici était composé du fibrinogène (0,2 %) contenant du gel séparateur et du gel de charge. La concentration de fibrinogène peut être ajustée au besoin.
3. Électrophorèse
- Placez le gel fibrinogen-PAGE préparé avec le moule à colle dans le réservoir d’électrophorèse ; verser 1300 mL de solution d’électrophorèse (1,963 g de Tris, 12,22 g de glycine, 0,65 g de SDS et 1300 mL de DDH2O) dans le réservoir ; Sortez le peigne.
- Ajouter 5 μL de tampon de charge 5x non dénaturant aux 20 μL de sFE et 20 μL d’homogénat de ver d’arachide ; bien mélanger par pipetage ; les charger dans le gel fibrinogen-PAGE préparé.
REMARQUE : Ne faites pas bouillir le mélange. sFE est une enzyme fibrino(géno)lytique identifiée précédemment 6,7,8 et est utilisée comme contrôle positif dans cette étude. L’homogénat de ver de l’arachide est l’échantillon à détecter. Tampon de charge non dénaturant sans bleu de bromophénol, β-mercaptoéthanol et SDS par rapport au tampon de chargement SDS-PAGE. Chaque voie d’échantillonnage est séparée par le tampon de chargement SDS-PAGE 1x pour détecter clairement le mouvement de la protéine. - Effectuez une électrophorèse à 80 V pendant 30 min, ou à 120 V pendant 20 min.
- Retirez le gel fibrinogen-PAGE du moule à colle.
4. Renaturation
- Transférez le gel fibrinogen-PAGE dans une boîte en plastique.
- Ajoutez 100 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) et 2 ml de Triton X-100 dans la boîte. Placez-le sur un shaker à 60-70 tr/min pendant 10 min.
- Retirez le tampon de lavage par pipetage.
REMARQUE : Répétez trois fois.
5. Incubation
- Ajouter 50 ml de Tris-HCl (0,05 M, pH 7,4) dans la boîte en plastique.
- Incuber à 37 °C pendant 4 h.
REMARQUE : Le temps d’incubation peut être ajusté en fonction de l’intensité de l’activité fibrinogénolytique.
6. Coloration
- Retirez le tampon d’incubation par pipetage.
- Ajoutez 50 ml de solution de coloration Coomassie Brillant Blue dans la boîte et placez la boîte sur un agitateur à 60-70 tr/min pendant 30 min.
7. Décoloration
- Retirez la solution colorante par pipetage.
- Ajouter 50 ml de DDH2O dans la boîte.
- Placez la boîte sur un shaker à 60-70 tr/min pendant 30 min.
REMARQUE : DD H2O a été utilisé ici comme solution de décoloration. Le temps d’agitation peut être ajusté en fonction de l’intensité de l’activité fibrinogénolytique.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Après électrophorèse, toutes les bandes du marqueur ont été clairement affichées. Les 1x voies de chargement SDS-PAGE n’affichaient que des bandes de 10 kDa (bleu de bromophénol). Les échantillons de sFE et de vers d’arachide n’ont montré aucune bande observable (figure 1). Bien que les bandes des échantillons ne soient pas visibles, les performances du marqueur et du bleu de bromophénol ont indiqué que l’électrophorèse a été réussie et les échantillons ont été séparés en fonction de leur po...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
sFE est une nouvelle enzyme fibrino(géno)lytique isolée à partir de vers d’arachide par notre équipe précédemment 3,6,8,13. Cependant, les processus d’identification de la sFE prenaient du temps et de la main-d’œuvre, impliquant la détection de l’activité fibrinogénolytique, la séparation des composants protéiques et les étapes de confirmation de l’activité. En...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette recherche a été financée par le Bureau des sciences et de la technologie de la ville de Xiamen (n° 3502Z20227197), le Bureau des sciences et de la technologie de la province du Fujian (n° 2019J01070 ; n° 2022J01311), et le projet d’innovation et d’entrepreneuriat de haut niveau des talents du plan scientifique et technologique de Quanzhou (n° 2022C015R). Nous remercions Fucai Wang (Université de Huaqiao) et Lei Tong (Université de Huaqiao) pour leur assistance technique.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1 ; M Tris-HCl (pH 6,8) | Solarbio | T1020 | |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | |
| 30 % Acrylamide/Bis-acrylamide | Biosharp | BL513B | |
| Persulfate d’ammonium | XiLONG SCIENTIFIC | 7727-54-0 | |
| Bécher | PYREX | 2-9425-02 | |
| Tube à centrifuger (1,5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Incubateur à température constante | JINGHONG | JHS-400 | |
| Coomas Brillant Blue Solution de coloration | Beyotime | P0017F | |
| Balance analytique électronique | DENVER | TP-213 | |
| Fibrinogen | Solarbio | F8051 | |
| Pointes de pipette de chargement de gel, Bulk | Biosharp | BS-200-GTB | |
| Homogénéisateur | AHS | ATS-1500 | |
| Oscillateur à rotation horizontale | NuoMi | NMSP-600 | |
| Milli-Q Référence | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | BIO-RAD | 165-8000~165-8007 | |
| N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine | Sigma | T9281 | |
| Pointe de pipette (1 mL) | Pointe | Axygene T-1000XT-C | |
| (10 µ ; L) | Axygene | T-10XT-C | |
| Pointe de pipette (200 µ ; L) | Pipette Axygene | T-200XT-C | |
| (1 mL)Pipette | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| (10µ ; L) | Pipette Thermo Fisher Scientific | ZX98775 | |
| (200 & micro ; L) | Pipette Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| (50 µ ; L) | Thermo Fisher Scientific | ZY15331 | |
| Centrifugeuse réfrigérée | cence | H1650R | |
| Dodécylsulfate de sodium | Sigma-Aldrich | V900859 | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| Tris-HCl | Solarbio | T8230 | |
| Triton X-100 | Solarbio | T8200 |
Références
- Bikdeli, B., et al. COVID-19 and thrombotic or thromboembolic disease: Implications for prevention, antithrombotic therapy, and follow-up. J Am Coll Cardiol. 75 (23), 2950-2973 (2020).
- Tsivgoulis, G., et al. Thrombolysis for acute ischaemic stroke: current status and future perspectives. Lancet Neurol. 22 (5), 418-429 (2023).
- Tang, M., Hu, C., Lin, H., Yan, H. Fibrinolytic drugs induced hemorrhage: mechanisms and solutions. Blood Coagul Fibrinolysis. 34 (5), 263-271 (2023).
- Lu, M., et al. Purification, characterization, and chemical modification of Bacillus velezensis SN-14 fibrinolytic enzyme. Int J Biol Macromol. 177, 601-609 (2021).
- Abu-Tahon, M. A., Abdel-Majeed, A. M., Ghareib, M., Housseiny, M. M., Abdallah, W. E. Thrombolytic and anticoagulant efficiencies of purified fibrinolytic enzyme produced from Cochliobolus hawaiiensis under solid-state fermentation. Biotechnol Appl Biochem. 70 (6), 1954-1971 (2023).
- Lin, W., Lin, H., Xin, P., Yan, H., Kang, B., Tang, M. A Comprehensive approach to analyze the cell components of cerebral blood clots. J Vis Exp. (197), e65791(2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. J Vis Exp. (196), e65631(2023).
- Tang, M., Lin, H., Huang, Y., Xu, R., Cui, X., Yan, H. Plasmin affinity purification method based on agarose gel and plasmin and application thereof. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN116103270A/en?oq=CN202310108470 (2023).
- Walton, P. L. An improved fibrin plate method for the assay of plasminogen activators. Clinica Chimica Acta. 13 (5), 680-684 (1966).
- Ngere, J. B., Ebrahimi, K. H., Williams, R., Pires, E., Walsby-Tickle, J., McCullagh, J. S. O. Ion-exchange chromatography coupled to mass spectrometry in life science, environmental, and medical research. Anal Chem. 95 (1), 152-166 (2023).
- Kato, S., Takeuchi, K., Iwaki, M., Miyazaki, K., Honda, K., Hayashi, T. Chitin- and streptavidin-mediated affinity purification systems: A screening platform for enzyme discovery. Angew Chem Int Ed Engl. 62 (31), e202303764(2023).
- Sharma, N., Sharma, R., Rajput, Y. S., Mann, B., Singh, R., Gandhi, K. Separation methods for milk proteins on polyacrylamide gel electrophoresis: Critical analysis and options for better resolution. International Dairy Journal. 114, 104920(2021).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , Available from: https://patents.google.com/patent/CN109295042A/en (2019).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
