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Identification de biomarqueurs pour la spécificité du sexe de la maladie d’Alzheimer sur la base des profils de transcriptome glial

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DOI :

10.3791/66552

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20 mai 2024

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1Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Shuangliu Hospital of Traditional Chinese Medicine, 3Department of Automation, Tsinghua University, 4Affiliated Reproductive & Women-Children Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Department of Neurology, Dalian Municipal Central Hospital, Central Hospital of Dalian University of Technology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude a analysé les transcriptomes à noyau unique de trente-trois personnes atteintes de la maladie d’Alzheimer (MA), révélant des DEG spécifiques au sexe dans les cellules gliales. L’analyse de l’enrichissement fonctionnel a mis en évidence les voies synaptiques, neuronales et hormonales. Des gènes clés, à savoir NLGN4Y et ses régulateurs, ont été identifiés, et des candidats thérapeutiques potentiels pour la MA spécifique au genre ont été proposés.

Résumé

De nombreux biomarqueurs spécifiques au sexe ont récemment été révélés dans la maladie d’Alzheimer (MA) ; Cependant, les cellules gliales cérébrales ont rarement été signalées. Cette étude a analysé 220 095 transcriptomes à noyau unique du cortex frontal de trente-trois individus atteints de la maladie d’Alzheimer dans la base de données GEO. Des gènes exprimés différentiellement (DEG) spécifiques au sexe ont été identifiés dans les cellules gliales, dont 243 dans les astrocytes, 1 154 dans les microglies et 572 dans les oligodendrocytes. Les analyses d’annotation fonctionnelle de l’ontologie génétique (GO) et les analyses d’enrichissement des voies de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) ont révélé une concentration fonctionnelle dans les voies synaptiques, neuronales et hormonales. Le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) a identifié MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PAKACB, CAMK2D et NLGN4Y dans les astrocytes, TREM2, FOS, APOE, APP et NLGN4Y dans la microglie, et GRIN2A, ITPR2, GNAS et NLGN4Y dans les oligodendrocytes comme gènes clés. NLGN4Y était le seul gène partagé par les trois cellules gliales et a été identifié comme le biomarqueur de la spécificité sexuelle de la MA. Le réseau de corégulation du facteur de transcription génique (TF)-miARN a identifié des régulateurs clés pour NLGN4Y et ses MTC cibles. Ecklonia kurome Okam (Kunbu) et Herba Ephedrae (Mahuang) ont été identifiés, et les effets des ingrédients actifs sur la MA ont été mis en évidence. Enfin, l’analyse de l’enrichissement de Kunbu et Mahuang a suggéré qu’ils pourraient agir comme candidats thérapeutiques pour la spécificité de genre de la MA.

Introduction

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie mondiale à forte incidence, et elle représente 60 à 80 % des démences1. Malgré sa forte incidence, la pathogenèse mécaniste de la MA n’est pas clairement délimitée, et il n’y a pas eu de traitements efficaces jusqu’à présent2. Les principales pathologies de la MA ont été identifiées comme étant l’atrophie neuronale et l’accumulation de débris pathologiques, principalement la protéine Tau associée aux microtubules, et la β-amyloïde (Aβ)3,4. La pathogenèse de la MA est associée à une autophagie anormale, un stress oxydatif, un dysfonctionnement mitochondrial, une inflammation et un trouble du métabolisme énergétique5. Les enquêtes de prévalence ont prouvé que les deux tiers des patients atteints de la maladie d’Alzheimer étaient des femmes6. Il existe des différences spécifiques au sexe dans la MA dans l’étiologie, les manifestations cliniques, la prévention et le traitement. Ainsi, la révélation du mécanisme biologique à l’origine des différences spécifiques au sexe dans la MA et le ciblage de la médecine traditionnelle chinoise (MTC) peuvent potentiellement fournir un cadre théorique plus complet pour comprendre la pathogenèse de la MA et pour guider davantage une stratégie de traitement plus précise.

Les cellules neurogliales, en particulier les microglies, les astrocytes et les oligodendrocytes, contribuent potentiellement à la pathogenèse de la MA. Dans la MA, les microglies sont activées et génétiquement modifiées, ce qui contribue à la réponse inflammatoire, à la phagocytose et à la clairance Aβ 7,8 ; Les astrocytes sont génétiquement modifiés, ce qui affecte l’activité synaptique, l’homéostasie ionique et le métabolisme de l’énergie et des lipides9 ; L’oligodendrocyte est génétiquement modifié avec une spécificité sexuelle, ce qui contribue à la perte neuronale, aux enchevêtrements neurofibrillaires et aux lésions de la substance blanche10,11.

Dans cette étude, nous avons utilisé le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq) comme technique supérieure. Par rapport au séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq), le snRNA-seq offre des avantages en termes de richesse des échantillons, d’intégrité du type de cellule et de fiabilité des données12,13. Le séquençage de l’ARNn a été largement utilisé dans des études axées sur la MA et l’exploration du rôle des cellules gliales 14,15,16. Sa large adoption dans ces domaines de recherche souligne son efficacité à fournir des informations précieuses sur les caractéristiques transcriptionnelles des cellules gliales dans la MA. En tirant parti des avantages du snRNA-seq, les chercheurs ont pu découvrir des informations cruciales concernant l’implication des cellules gliales dans la pathologie de la MA et identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Afin d’explorer les caractéristiques transcriptionnelles neurogliales spécifiques au sexe dans la MA et les MTC potentielles pour la spécificité sexuelle de la MA, cette étude a analysé les données de séquençage de l’ARNnb du cortex frontal des patients atteints de la MA à partir de la base de données publique NCBI GEO. Les gènes exprimés différentiellement (DEG) spécifiques au sexe, l’ontologie des gènes (GO), l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG), le réseau d’interaction protéine-protéine (IPP) et le réseau gène-TF-miARN sont analysés plus en détail pour révéler des biomarqueurs clés et une pathogenèse potentielle. Enfin, des MTC potentielles ont été suggérées, et leurs ingrédients actifs ont été présentés à l’aide de tableaux en effectuant une recherche dans les bases de données de Coremine Medical, du TCMIP et du TCMSP.

Protocole

Les étapes 2 à 9 de l’analyse ont été mises en œuvre à l’aide du logiciel R (voir la figure supplémentaire 1 et le fichier supplémentaire 1), tandis que les autres étapes ont été exécutées sur les plateformes en ligne. Les détails des bases de données utilisées dans ce protocole (ainsi que les liens Web) sont fournis dans la Table des matériaux.

1. Acquisition de données

  1. Accédez à la base de données GEO (Gene Expression Omnibus) accessible au public au National Center of Biotechnology Information.
  2. Recherchez les données GEO nommées maladie d’Alzheimer dans le champ de recherche.
  3. Sélectionnez les organismes supérieurs comme Homo sapiens sur le côté droit.
    REMARQUE : Les résultats de la recherche étaient des données sur la maladie d’Alzheimer chez Homo sapiens.
  4. Après avoir filtré les informations recherchées, téléchargez les fichiers de données GSE167490 et GSE183068 , qui englobent features.tsv, barcode.tsv et matrix.mtx pour chaque échantillon de noyau. Les ensembles de données comprenaient 34 échantillons de MA provenant du cortex frontal, avec une distribution égale de 17 échantillons masculins et 17 échantillons féminins (tableau supplémentaire 1).

2. Fusion d’échantillons

  1. Configurez les chemins d’accès aux données et les noms d’échantillons en conséquence sur l’ordinateur. Importez les 34 exemples téléchargés et attribuez-leur des noms spécifiques au sexe à l’aide des noms de fonction.
  2. Générez des objets Seurat pour tous les échantillons de manière à traiter par lots à l’aide de la liste des fonctions et de Read10X, en spécifiant les paramètres min.cells = 3 et min.features = 200.
  3. Utilisez la fonction RenameCells pour ajouter des exemples d’ID en tant que préfixes aux codes-barres de cellule afin de conserver les codes-barres de cellule pendant le processus de fusion. Cela a permis de s’assurer que chaque cellule conservait son identité unique et pouvait être retracée jusqu’à sa source d’échantillon d’origine après la fusion.

3. Contrôle de la qualité (QC)

  1. Utilisez la fonction PercentageFeatureSet pour calculer les rapports de gènes mitochondriaux, les rapports de gènes érythrocytaires et les rapports de gènes de ribosomes pour chaque cellule.
  2. Stockez ces ratios calculés dans les métadonnées à l’aide de l’opérateur [[ ]] pour attacher ces informations directement aux métadonnées de chaque cellule.
  3. Utilisez la fonction de sous-ensemble pour effectuer le filtrage des cellules, en spécifiant les paramètres nFeature_RNA > 200, nFeature_RNA < 10000, nCount_RNA < 60000, percent.mt < 10, percent.rb < 5 et percent. HB < 75.
  4. Excluez GSM5106107 de l’analyse.

4. Vérification de l’effet de lot

  1. Effectuer le traitement des données.
    1. Normalisez les données à l’aide de la fonction NormalizeData .
    2. Identifiez les 2000 principales entités variables du jeu de données à l’aide de la fonction FindVariableFeatures .
    3. Effectuez une analyse en composantes principales (ACP)17 sur les données à l’aide de RunPCA, en conservant 50 composantes principales.
    4. Générez un tracé en coude à l’aide de la fonction ElbowPlot pour déterminer le nombre optimal de dimensions pour l’analyse ultérieure. Considérez les 50 premières dimensions.
    5. Mettez à l’échelle les données à l’aide de ScaleData pour vous assurer que toutes les fonctionnalités sont à une échelle comparable.
    6. Identifiez les voisins les plus proches à l’aide de FindNeighbors basé sur 30 dimensions.
    7. Appliquez l’algorithme UMAP à l’aide de RunUMAP pour réduire la dimensionnalité des données à 30 dimensions.
  2. Visualisez les données traitées à l’aide de la fonction DimPlot avec le paramètre de réduction défini sur umap et le paramètre group.by défini sur orig.ident.
    REMARQUE : Cette étape peut générer un graphique visualisant les données dans l’espace UMAP réduit, regroupées par les identités de cellule d’origine. En examinant les graphiques UMAP, il est devenu évident qu’il y avait une présence d’effet de lot. Le regroupement ou la séparation distincts des cellules en fonction de leur lot ou de leur origine expérimentale suggère que les lots expérimentaux ont influencé les profils d’expression génique.

5. Intégration des données

  1. Normalisez et standardisez les données à l’aide de la fonction SCTransform .
  2. Appliquez l’algorithme d’harmonie18 pour intégrer les 33 données restantes de noyaux uniques. Utilisez le test SCT pour l’intégration et définissez le nombre maximal d’itérations d’harmonie sur 20.
  3. Utilisez la fonction FindClusters avec un paramètre de résolution défini sur 0,07 pour identifier les clusters distincts dans les données.
  4. Utilisez la fonction RunUMAP avec un nombre spécifié de dimensions (dims = 30) pour réduire davantage la dimensionnalité des données et visualiser les clusters dans un espace de dimension inférieure.

6. Annotation du type de cellule

  1. Collecter les gènes marqueurs (tableau supplémentaire 2) des cellules grâce à une revue approfondie de la littérature existante.
  2. Après l’identification de l’hétérogénéité du cluster cellulaire, classez le type de chaque cellule du cluster par les gènes marqueurs exprimés spécifiquement.
  3. Présentez différents types cellulaires avec la visualisation UMAP à l’aide du package ggplot2, où l’oligodendrocyte a été mis en évidence avec le code couleur #DB7093, le neurone excitateur avec le #FF69B4, l’astrocyte avec le #1874CD, la microglie avec #63B8FF, la cellule précurseur d’oligodendrocytes avec #DB7093, le neurone inhibiteur avec #FFC0CB et la cellule endothéliale avec #FF69B4.
  4. Calculez les proportions de chaque type de cellule stratifiées par sexe.

7. Extraction des données des cellules gliales

  1. Extrayez les données astrocytaires des données en vrac intégrées à l’aide de la fonction de sous-ensemble.
  2. Extrayez des données microgliales à partir des données en vrac intégrées à l’aide de la fonction de sous-ensemble.
  3. Extrayez les données d’oligodendrocytes à partir des données en vrac intégrées à l’aide de la fonction de sous-ensemble.

8. Capture des gènes exprimés différentiellement (DEG) spécifiques au sexe glial

  1. Identifiez les DEG spécifiques au sexe des astrocytes à l’aide de la fonction FindMarkers (ident.1 = mâle, ident.2 = femelle, group.by = group.sum, assay = RNA) avec des valeurs seuils : valeur p < 0,05 et |avg_log2FC| > 30. Étiquetez les DEG régulés à la hausse comme étant vers le haut, les DEG régulés à la baisse comme étant vers le bas et les autres comme étant stables.
    1. Visualisez les DEG à l’aide de la fonction ggplot , l’axe des x représentant la différence de pourcentage entre deux conditions (pct.1 - pct.2) et l’axe des y représentant les avg_log2FC. Les gènes régulés à la hausse ont été mis en évidence en utilisant la couleur PaleVioletRed, les gènes régulés à la baisse avec le rose et les gènes stables avec DodgerBlue3.
  2. Identifiez les DEG de la microglie spécifiques au sexe à l’aide de la fonction FindMarkers (ident.1 = mâle, ident.2 = femelle, group.by = group.sum, assay = RNA) avec des valeurs seuils : valeur p < 0,05 et |avg_log2FC| > 1. Étiquetez les DEG régulés à la hausse comme étant vers le haut, les DEG régulés à la baisse comme étant vers le bas et les autres comme étant stables.
    1. Visualisez les DEG à l’aide de la fonction ggplot , l’axe des x représentant la différence de pourcentage entre deux conditions (pct.1 - pct.2) et l’axe des y représentant les avg_log2FC. Les gènes régulés à la hausse ont été mis en évidence en utilisant la couleur OrangeRed, les gènes régulés à la baisse avec LightSalmon et les gènes stables avec SteelBlue1.
  3. Identifiez les DEG spécifiques au sexe des oligodendrocytes à l’aide de la fonction FindMarkers (ident.1 = mâle, ident.2 = femelle, group.by = group.sum, assay = RNA) avec des valeurs seuils : valeur p < 0,05 et |avg_log2FC| > 10. Étiquetez les DEG régulés à la hausse comme étant vers le haut, les DEG régulés à la baisse comme étant vers le bas et les autres comme étant stables.
    1. Visualisez les DEG à l’aide de la fonction ggplot , l’axe des x représentant la différence de pourcentage entre deux conditions (pct.1 - pct.2) et l’axe des y représentant le avg_log2FC. Les gènes régulés à la hausse ont été mis en évidence en utilisant la couleur DeepPink, les gènes régulés à la baisse avec HotPink et les gènes stables avec DeepSkyBlue3.

9. Analyses d’enrichissement fonctionnel des DEG spécifiques au sexe

  1. Effectuez une analyse d’enrichissement en ontologie génétique (GO) sur des DEG spécifiques au sexe pour chaque type de cellule gliale à l’aide de la fonction enrichGO . Définissez les paramètres suivants : OrgDb = org. Hs.eg.db, keyType = SYMBOL, ont = ALL, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 et qvalueCutoff = 0,05.
  2. Convertissez les symboles de gènes en ID de gènes correspondants à l’aide de la fonction bitr. Effectuez une analyse d’enrichissement de l’Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) sur les DEG spécifiques au sexe pour chaque type de cellule gliale à l’aide de la fonction enrichKEGG . Ajustez les paramètres comme suit : organism = has, keyType = kegg, pAdjustMethod = BH, pvalueCutoff = 0,01 et qvalueCutoff = 0,05.

10. Statistiques de fréquence des DEG gliaux dans les voies go et kegg, diagrammes de Venn de chaque DEG glial spécifique au sexe et construction du réseau PPI

  1. Calculez la fréquence des DEG gliales spécifiques au sexe dans les voies GO et KEGG à l’aide d’un histogramme de fréquence.
  2. Accédez à la base de données STRING pour construire les réseaux PPI.
  3. Choisissez l’option Protéines multiples. Recherchez la liste des noms dans la zone de recherche. Définir « Organismes » comme Homo sapiens.
  4. Examinez la liste des protéines obtenues à partir de la recherche. Cliquez sur Continuer pour continuer.
  5. Exportez les réseaux PPI en sélectionnant l’option de téléchargement , de préférence au format PNG avec une résolution plus élevée.
  6. Visualisez la distribution de la co-expression pour les principaux gènes spécifiques au sexe à l’aide des diagrammes de Venn.
  7. Identifiez le(s) gène(s) partagé(s) en tant que(s) gène(s) clé(s) dans l’étude en fonction de l’analyse du diagramme de Venn.

11. Construction de réseaux réglementaires multifactoriels

  1. Accédez à NetworkAnalyst.
  2. Cliquez sur Entrée de la liste des gènes et spécifiez l’organisme comme H. sapiens (humain). Définissez le type d’ID comme symbole de gène officiel. Entrez le nom du gène dans le champ de recherche, puis cliquez sur Télécharger et continuer.
  3. Sélectionnez Interactions gène-miARN et choisissez miRTarBase v8.0. Confirmez la sélection en cliquant sur OK.
  4. Passez à la section Interactions entre les gènes TF et sélectionnez la base de données ENCODE . Cliquez sur OK pour confirmer la sélection.
  5. Ensuite, accédez à TF-miRNA Coregulatory Network et cliquez sur OK pour continuer.
  6. Enfin, choisissez Procéder à la génération du réseau de régulation multifactoriel intégrant les interactions gène-miARN et les interactions TF-gène.

12. Analyse de la MTC des gènes et des cibles

  1. Accédez à la base de données en ligne de Coremine Medical.
  2. Entrez le nom du gène spécifique et sélectionnez le gène correspondant avec le suffixe gène/protéine, humain dans le champ de recherche sous la section Explorer .
  3. Naviguez dans la section Drogues et identifiez les MTC associées aux drogues recherchées.
    REMARQUE : Les médicaments statistiquement significatifs ont été marqués en bleu.
  4. Déterminez les cinq principales MTC en fonction de leur valeur « significative » en tant que MTC thérapeutiques.

13. Résumé de la recherche sur les ingrédients de la MTC dans le ciblage d’un gène clé

  1. Accédez à la Plateforme de recherche en pharmacologie intégrative de la médecine traditionnelle chinoise (TCMIP) et à la Plateforme de base de données et d’analyse de pharmacologie des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP). Entrez les noms des herbes dans la barre de recherche pour récupérer leurs ingrédients correspondants.
  2. Récupérez les ingrédients dans la base de données PubMed avec une limite de temps allant jusqu’au 10 avril 2023. Les termes de recherche utilisés comprenaient le nom de la molécule dans TCMSP et les composants chimiques dans TCMIP comme termes de recherche, et se limitaient aux articles publiés en anglais.
  3. Résumer et analyser les herbes et leurs ingrédients correspondants agissant sur la DA.

14. Confirmation du ciblage de la fonction de traitement des MTC dans la spécificité sexuelle de la MA

  1. Importez des herbes dans le MITCT et accédez à la page de description correspondante.
  2. Utilisez la fonction Exporter les données et sélectionnez le format CSV pour télécharger les termes d’enrichissement de GO - Biological Process, GO - Cellular Component, GO - Molecular Function et Reactome Pathway.
  3. Visualisez les termes d’enrichissement téléchargés pour chaque plante à l’aide de diagrammes à barres.

Résultats

Analyse SnRNA-seq des profils de transcriptome glial frontal et annotation des types cellulaires
Au total, 220 095 noyaux et 32 077 gènes dans le cortex frontal de 17 MA mâles et 17 DA femelles ont été obtenus (Figure 1A). Le graphique UMAP a visualisé l’ensemble des transcriptomes frontaux des noyaux uniques affichant des types distincts de noyaux après analyse de réduction de dimension (Figure 1B). Le nombre total de noyaux annotés capturés par sexe a été indiqué, ce qui fait la somme de 58 902 astrocytes, 14 265 microglies, 77 466 oligodendrocytes, 3 520 endothéliaux, 25 252 neurones excitateurs, 31 268 neurones inhibiteurs et 9 422 cellules progénitrices oligodendrocytes (Figure 1C). Les expressions moyennes des marqueurs de type cellulaire connus pour chaque glie ont été projetées sur les graphiques UMAP afin d’identifier les populations cellulaires (Figure 1D).

Les DEG spécifiques au sexe dans les astrocytes
58 902 noyaux astrocytaires ont été analysés (Figure 2A), dont 27 504 chez les mâles (46,69%) et 31 398 chez les femelles (53,31%). Les DEG spécifiques au sexe ont révélé une régulation à la hausse de 138 gènes, y compris l’heure DST, CACNA2D3 et AC016831,7, une régulation à la baisse de 105 gènes, y compris CNTN5, RORA, RASSF8 et CADM2, et 4995 gènes inchangés (Figure 2B). De plus, les analyses GO et KEGG ont révélé que ces DEG se concentraient principalement dans les voies des neurones, des synapses et des hormones, avec des voies neuronales comprenant la régulation du développement du projet neuronal, de la colonne vertébrale neuronale, etc., des voies synaptiques, y compris l’organisation synaptique et la synapse glutamatergique/cholinergique, et des voies hormonales comprenant la synthèse des hormones thyroïdiennes et la sécrétion d’insuline (Figure 2C, D). Trente gènes avec la fréquence maximale ont été obtenus (Figure 2E), PLCB1 se classant en premier. Des réseaux d’IPP ont été construits pour explorer la relation entre ces gènes (figure 2F) et ont identifié DLG2, CAMK2D, CALM2 et PRKACB comme gènes de base. Les graphiques UMAP ont montré des différences entre les DEG sélectionnés : KCND2, CAMK2D, MT3, LINC00278 et XIST étaient plus élevés chez les femelles et plus faibles chez les mâles, tandis que NLGN4Y, DLG2, PRKACB, CALM2, UTY et TTTY14 étaient opposés (Figure 2G). MT3, CALM2, DLG2, KCND2, PRKACB, CAMK2D et NLGN4Y ont finalement été déterminés comme des DEG spécifiques au sexe des astrocytes, comme le montre le tableau 1.

Les DEG spécifiques au sexe dans la microglie
14 265 noyaux microgliaux (figure 3A) ont été analysés, dont 5 327 (37,34 %) chez les mâles et 8 938 (62,66 %) chez les femelles. Les DEG spécifiques au sexe ont révélé une régulation à la hausse de 224 gènes, y compris KCNIP4 et LRRTM4, et une régulation à la baisse de 930 gènes, dont APOE, MT-CO3 et FTL, et 13 111 gènes inchangés (figure 3B). De plus, les analyses GO et KEGG ont identifié que ces DEG se concentraient principalement dans les voies des neurones, des phagosomes, des hormones et autres, avec des voies neuronales comprenant la synapse de neurone à neurone, les voies phagocytaires y compris le phagosome et la régulation de la phagocytose, les voies hormonales y compris la voie de signalisation des œstrogènes, la voie de signalisation de l’ocytocine, etc., et d’autres y compris la régulation de la réponse inflammatoire, de l’apprentissage ou de la mémoire, la clairance de la bêta-amyloïde, etc. (Figure 3C,D). Trente gènes avec la fréquence maximale ont été obtenus, TLR2 et TREM2 étant à égalité pour la deuxième place (Figure 3E). Des réseaux d’IPP ont été construits pour explorer la relation entre ces gènes (figure 3F) et ont identifié ACTB, APP et FYN comme gènes de base. Les graphiques UMAP ont montré des différences entre les DEG sélectionnés : APP, FOS, XIST et CTSD étaient plus élevés chez les femmes et plus faibles chez les mâles, tandis que NLGN4Y, TREM2, LINC0028, APOE, UTY et TTTY14 étaient opposés (figure 3G). TREM2, FOS, APOE, APP et NLGN4Y ont finalement été déterminés comme des DEG de la microglie spécifiques au sexe, comme le montre le tableau 2.

Les DEG spécifiques au sexe dans les oligodendrocytes
77 466 noyaux oligodendrocytaires ont été analysés (figure 4A), dont 42 469 chez les mâles (54,82 %) et 34 997 chez les femelles (45,18 %). Les DEG spécifiques au sexe ont révélé une régulation à la hausse de 384 gènes, y compris PCDH9, MT-CO1, NEAT1 et NPAS3, une régulation négative de 188 gènes, y compris FRMD4A, PLP1 et LSAMP, et les 76 894 gènes restants inchangés (figure 4B). De plus, les analyses GO et KEGG ont révélé que ces DEG se concentraient principalement dans les voies des neurones, des synapses et des hormones, avec des voies neuronales comprenant la colonne vertébrale des neurones, des voies synaptiques comprenant la synapse de neurone à neurone et la synapse glutamatergique/dopaminergique, et les voies hormonales, y compris la voie de signalisation de la neurotrophine, la synthèse et la sécrétion d’aldostérone, la voie de signalisation du calcium, etc. Trente gènes avec la fréquence maximale ont été obtenus (Figure 4E), GRIN2A et PSEN1 étant à égalité en deuxième position. Des réseaux d’IPP ont été construits pour explorer la relation entre ces gènes (figure 4F) et ont identifié GRIN2A et GRIA2 comme gènes de base. Les graphiques UMAP ont montré des différences dans certaines DEG : GRIN2A, ITPR2, GNAS et XIST étaient plus élevés chez les femmes et plus faibles chez les mâles, tandis que NLGN4Y, UTY et TTTY14 étaient opposés (figure 4G). GRIN2A, ITPR2, GNAS et NLGN4Y ont finalement été déterminés en tant que DEG spécifiques au sexe des oligodendrocytes, comme le montre le tableau 3.

Interaction entre les gènes clés et les 30 principaux gènes des cellules gliales, et NLGN4Y en tant que gène commun partagé
Les diagrammes de Venn et les réseaux PPI ont fourni une vue d’ensemble de l’interaction étroite entre les gènes clés (figures 5A, B) et les 30 premiers gènes (figures 5C, D) de chaque cellule gliale. Les résultats ont montré que ACYB, APP, JUN, PRKACB et DLG2 étaient au cœur du réseau IPP, et que NLGN4Y était un gène commun partagé pour les DEG spécifiques au sexe dans toutes les cellules gliales.

Construction d’un réseau gène-TF-miARN
Le réseau de miARN NLGN4Y-TF contenait 13 nœuds et 12 arêtes (Figure 6A). NLGN4Y a été régulé par 1 TF, à savoir CTCF, et 11 miARN, dont has-miR-185, has-miR-137 et has-miR-9.

Affichage du médicament cible et des MTC de NLGN4Y avec réseau
Au total, 1 médicament cible NLGN4Y et 64 MTC cibles indirectes ont été récupérés dans Coremine Medical. Les MTC ayant une signification statistique dans les résultats ont été marqués en bleu. Le médicament Antithrombine III et cinq MTC du réseau, à savoir Heikunbu, Wulingzhi, Xiazhicao, Shuizhi et Mahuang, ont été visualisés, ce qui a été considéré comme statistiquement significatif (figure 6B).

Effets des MTC cibles et des principes actifs correspondants sur la DA
Pour Kunbu, 10 ingrédients du TCMIP et 48 ingrédients du TCMSP ont été récupérés. En effectuant une recherche dans la base de données PubMed, 5 ingrédients liés à la MA ont été trouvés : le fucostérol, le saringostérol, la thiamine, l’acide stéaridonique et le phlorofucofuroeckol-A, dont la biodisponibilité orale (OB) des deux premiers était de ≥30 % et similaire au sexe du médicament (DL) était de ≥0,18. Le tableau 4 donne plus de détails. En ce qui concerne Mahuang, 28 ingrédients du TCMIP et 363 ingrédients du TCMSP ont été récupérés. Avec la même méthode que Kunbu, 25 ingrédients liés à la DA ont été récupérés. Parmi eux, 6 ingrédients avec OB ≥30% et DL ≥0,18 : quercétine, ériodictyol, naringénine, taxifoline, stigmastérol et lutéoline, sont énumérés en haut du tableau 5.

Analyse du réseau et de l’enrichissement des gènes de Hurb
Le réseau Hurb-gène-maladie est illustré à la figure 6C. Le gène cible partagé par Kunbu et Mahuang était ACHE, dont les maladies associées étaient la MA et les déficits cognitifs. Les gènes cibles de Kunbu seul étaient ALKBH3 et ELOVL4, des maladies liées au vieillissement et à l’atrophie cérébrale, respectivement.

Les résultats des enrichissements en GO (BP, MF et CC) pour Kunbu (figure 7A, figure 8A, figure 9A) et Mahuang (figure 7B, figure 8B, figure 9B) sont affichés à l’aide de diagrammes à barres. Les trajectoires du réactome pour Kunbu (figure 10A) et Mahuang (figure 10B) sont également illustrées. Les termes enrichis marqués de flèches étaient liés à l’axe « hormone-synapse-neurone », tels que l’activité des récepteurs des hormones stéroïdiennes, la projection des neurones et la voie de signalisation médiée par les hormones stéroïdes à Kunbu et la transmission synaptique chimique, l’expression génique dépendante des œstrogènes et le processus du système nerveux à Mahuang.

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Figure 1 : Acquisition de données d’expression génique, profilage du séquençage de l’ARN à noyaux uniques et caractérisation du type cellulaire. (A) Échantillons obtenus à partir de GEO DataSets pour la préparation de l’analyse. (B) Graphique UMAP en 2 dimensions de la somme des noyaux (N = 116 101 pour les mâles ; N = 103 994 pour les femmes). (C) Proportions pour chaque type de cellule réparties par sexe. (D) Expression moyenne de 5 marqueurs de type cellulaire bien établis projetés sur le graphique UMAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Les astrocytes sont hétérogènes et présentent des modifications transcriptomiques spécifiques au sexe dans la maladie d’Alzheimer. (A) Graphique UMAP des noyaux astrocytaires (N = 59 010). (B) DEG spécifiques au sexe. (C, D) Les diagrammes circulaires ont illustré les termes significativement enrichis fonctionnellement des DEG astrocytaires obtenus à partir des bases de données GO et KEGG (GO : C, KEGG : D). (E) Les 30 DEG astrocytes-sexe les plus fréquents dans les voies GO et KEGG. (F) Réseau d’IPP des 30 DEG astrocytaires-sexe les plus fréquents dans les voies GO et KEGG. (G) Expression moyenne de DEG remarquables spécifiques au sexe projetées sur les graphiques UMAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Les microglies sont hétérogènes et présentent des modifications transcriptomiques spécifiques au sexe dans la maladie d’Alzheimer. (A) Graphique UMAP des noyaux microgliaux (N = 14 265). (B) DEG spécifiques au sexe. (C, D) Des diagrammes circulaires ont illustré les termes significativement enrichis fonctionnellement des DEG microgliaux obtenus à partir des bases de données GO et KEGG (GO : C, KEGG : D). (E) Les 30 DEG microglia-sexe les plus fréquents inGO et KEGGpathways. (F) Réseau d’IPP des 30 DEG microglia-sexe les plus fréquents dans les voies GO et KEGG. (G) Expression moyenne de DEG remarquables spécifiques au sexe projetées sur les graphiques UMAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Les oligodendrocytes sont hétérogènes et présentent des modifications transcriptomiques spécifiques au sexe dans la maladie d’Alzheimer. (A) Graphique UMAP des noyaux oligodendrocytaires (N = 77 466). (B) DEG spécifiques au sexe. (C, D) Des diagrammes circulaires ont illustré les termes significativement enrichis fonctionnellement des DEG oligodendrocytaires obtenus à partir des bases de données GO et KEGG (GO : C, KEGG : D). (E) Les 30 DEG les plus fréquentes des oligodendrocytes et du sexe dans les voies GO et KEGG. (F) Réseau IPP des 30 DEG oligodendrocytaires-sexe les plus fréquents dans les voies GO et KEGG. (G) Expression moyenne de DEG remarquables spécifiques au sexe projetées sur les graphiques UMAP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Chevauchements des DEG et des réseaux d’IPP des DEG de fréquence supérieure. (A,B) Diagramme de Venn illustrant les gènes clés de chaque glie et le réseau d’IPP correspondant. (C, D) Diagramme de Venn illustrant les 30 principaux DEG spécifiques au sexe fréquents pour chaque glie enrichie dans les voies GO et KEGG et le réseau IPP correspondant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Schéma de réseau avec NLGN4Y et ses MTC ciblant comme noyau. (A) Réseau de corégulation gène-TF-miARN. (B) Réseau gène-médicament-MTC pour NLGN4Y. (C) Réseau MTC-gène-maladie de Kunbu et Mahuang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Analyse de l’enrichissement de GO (BP) pour Kunbu et Mahuang. (A) Les 20 principaux processus biologiques enrichis de Kunbu. (B) Les 20 principaux processus biologiques enrichis de Mahuang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 8 : Analyse d’enrichissement GO (MF) pour Kunbu et Mahuang. (A) Les 20 principales fonctions moléculaires enrichies de Kunbu. (B) Les 20 principales fonctions moléculaires enrichies de Mahuang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 9 : Analyse de l’enrichissement GO (CC) pour Kunbu et Mahuang. (A) Les 20 principaux composants cellulaires enrichis de Kunbu. (B) Les 20 principaux composants cellulaires enrichis de Mahuang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 10 : Trajectoires du réacatome de Kunbu et de Mahuang. (A) Trajectoires du réacatome de Kunbu. (B) Voies du réacatome de Mahuang. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Gènes clés des DEG spécifiques au sexe dans les astrocytes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Gènes clés des DEG spécifiques au sexe dans la microglie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Gènes clés des DEG spécifiques au sexe dans les oligodendrocytes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : Principes actifs de Kunbu' sur la maladie d’Alzheimer. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 5 : Principes actifs de Mahuang' sur la maladie d’Alzheimer. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure supplémentaire 1 : Capture d’écran de l’utilisation du logiciel R. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 1 : Renseignements sur l’échantillon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 2 : Gènes marqueurs. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Le code R. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La spécificité du genre a été identifiée dans l’épidémiologie, la pathologie et la manifestation clinique de laCOVID-19. Ici, nous avons confirmé le mécanisme pathologique potentiel de « l’axe hormone-synapse-neurone » à partir de gènes gliaux spécifiques au sexe et des voies associées chez les patients atteints de MA. NLGN4Y était le seul gène partagé dans les trois cellules gliales et a été choisi comme biomarqueur de la spécificité sexuelle de la MA. TF et les miARN régulant NLGN4Y étaient fortement liés aux différences entre les sexes et au développement du système nerveux. De plus, les MTC cibles Kunbu et Mahuang ont été considérées comme affectant potentiellement l’axe « hormone-synapse-neurone » et ont été identifiées comme agissant comme des candidats thérapeutiques pour la MA par régulation de la spécificité de genre.

L’algorithme Harmony a fourni des avantages distincts par rapport aux autres algorithmes d’intégration en intégrant des données dans des cellules rares, en optimisant l’utilisation de la mémoire et la vitesse de calcul pour de grands échantillons, et en s’adaptant à des modèles expérimentaux complexes avec diverses sources cellulaires et plates-formes technologiques18. Le contrôle qualité et les sections d’intégration des données ont été des éléments essentiels pour améliorer la précision et la fiabilité de l’analyse, ce qui a permis aux chercheurs de mieux comprendre la biologie de la maladie d’Alzheimer et d’autres maladies neurodégénératives. L’exécution méticuleuse de ces étapes est essentielle pour obtenir la qualité et la validité globales des résultats dérivés des expériences de séquençage de l’ARN à noyau unique.

L’une des modifications apportées à ce protocole a été l’utilisation de la fonction SCTransform pour normaliser et normaliser les données20. Cette étape a permis de s’assurer que les données étaient comparables et normalisées pour une analyse plus approfondie. Pour atténuer l’effet de lot, une étape supplémentaire d’intégration des données a été franchie, ce qui a permis de corriger l’effet de lot et d’améliorer la précision des résultats. Le dépannage a été effectué lorsque l’un des échantillons (GSM5106107) a montré des performances inhabituelles par rapport aux autres échantillons, et il a été exclu de l’analyse.

L’une des limites de cette étude concernait la taille relativement petite de l’échantillon utilisé, ce qui pourrait limiter la représentativité des résultats à l’ensemble de la population. De plus, l’utilisation de données provenant de plusieurs laboratoires et groupes de recherche a introduit une hétérogénéité inhérente, limitant potentiellement la reproductibilité et la généralisabilité des résultats. Bien que l’identification des facteurs régulateurs clés de NLGN4Y ait été réalisée grâce à un réseau de corégulation gène-TF-miARN, une vérification expérimentale supplémentaire a été nécessaire pour déterminer les rôles fonctionnels et les mécanismes sous-jacents attribués à ces facteurs régulateurs. Bien que l’analyse de l’enrichissement ait suggéré que Mahuang et Kunbu étaient des candidats potentiels pour un traitement de la MA spécifique au sexe, il n’a pas été suffisant de se fier uniquement aux prédictions bioinformatiques pour établir leur efficacité et leur innocuité. Des expériences et des études cliniques supplémentaires étaient impératives pour valider les effets thérapeutiques de ces médicaments prometteurs.

L’approche décrite dans cette étude a montré un potentiel considérable pour divers domaines de recherche, notamment dans le discernement des DEG spécifiques au sexe dans les cellules gliales dans la MA. De telles recherches promettent d’élucider les disparités pathogènes nuancées entre les individus masculins et féminins, facilitant ainsi la formulation d’interventions thérapeutiques spécifiques au sexe. De plus, l’applicabilité de la méthode s’est étendue à d’autres maladies neurodégénératives, offrant des possibilités d’identifier des DEG spécifiques au sexe et d’augmenter la compréhension des mécanismes sous-jacents des maladies.

En conclusion, l’étude a présenté un protocole complet et robuste pour l’analyse des données de séquençage de l’ARN à noyau unique de patients atteints de la maladie d’Alzheimer, ouvrant potentiellement la voie au développement d’interventions thérapeutiques adaptées. De plus, la méthodologie employée dans cette étude pourrait être étendue à d’autres maladies neurodégénératives, offrant ainsi la possibilité de découvrir des modèles d’expression génique spécifiques au sexe et d’approfondir la compréhension de ces maladies complexes.

Déclarations de divulgation

Il n’y a aucun conflit d’intérêts dans ce manuscrit, et tous les auteurs ont approuvé la soumission pour publication.

Remerciements

Les auteurs sont reconnaissants à Jessica S Sadick, Michael R O’Dea, Philip Hasel, etc., d’avoir fourni le GSE167490 ensemble de données. Les auteurs apprécient que Faten A Sayed, Lay Kodama, Li Fan, etc., offrent le GSE183068 ensemble de données. Les auteurs remercient Shuqing Liu pour l’aide apportée à l’analyse des données et Wen Yang pour la fourniture de la plateforme d’analyse des données. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82174511), les boursiers Apricot Grove de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu, le programme d’amélioration de la recherche sur les talents disciplinaires (QJJJ2022001), le programme de revitalisation des talents de LiaoNing (XLYC 1807083), le Fonds du Bureau d’administration du Sichuan de médecine et d’herbes chinoises (2023MS578), le projet national de formation à l’innovation et à l’entrepreneuriat de premier cycle (202310633003X) et Sujets innovants de la pratique de la recherche scientifique pour les étudiants de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (ky-2023100). Hanjie Liu et Hui Yang ont contribué à la conception de l’étude, à la collecte, à l’interprétation des données, à la rédaction et à la révision du manuscrit. Shuqing Liu et Siyu Li ont participé à la conception de l’étude, à la collecte des données et à la rédaction du manuscrit. Wen Yang et Anwar Ayesha étaient responsables de la collecte et de l’interprétation des données. Xin Tan a préparé des figures et/ou des tableaux. Cen Jiang, Yi Liu et Lushuang Xie ont conçu l’étude et révisé / édité le manuscrit. Tous les auteurs ont contribué à l’article et ont approuvé la version soumise.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Database
Coremine Medical databaseDéveloppée conjointement par la Norvège, l’Académie chinoise des sciences, l’Académie chinoise des sciences médicales, la Bibliothèque médicale nationale des États-Unis et d’autres institutionsLorsque vous explorez des concepts dans CoreMine Medical, vous accédez à une base de données structurée pour relier des concepts importants, classés par pertinence statistique, à votre sujet. Par exemple, si vous tapez « maladie d’Alzheimer », en plus de récupérer des documents et des ressources qui traitent de la maladie, vous pourrez afficher des réseaux et des listes qui montrent comment le concept de votre requête est lié à d’autres concepts biomédicaux. Il fournit une vue d’ensemble des concepts qui se rapportent à votre recherche et constitue une interface pour naviguer dans les informations sur ces concepts.
Lien Web : https://coremine.com/medical/
Gene Expression Omnibus (GEO)National Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)GEO est un référentiel public de données génomiques fonctionnelles prenant en charge les soumissions de données conformes à MIAME. Les données basées sur des matrices et des séquences sont acceptées. Des outils sont fournis pour aider les utilisateurs à interroger et à télécharger des expériences et des profils d’expression génique organisés.
Lien Web : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Plateforme de recherche basée sur la pharmacologie intégrative de la médecine traditionnelle chinoise (TCMIP, version : 2.0)AucunIntroduction à la plateforme de recherche computationnelle en réseau basée sur la pharmacologie intégrée pour la médecine traditionnelle chinoise [TCMIP v2.0], http://www.tcmip.cn/ ) Il s’agit d’une exploration intelligente de données plate-forme basée sur la base de données en ligne de l’Encyclopédie de la médecine traditionnelle chinoise (ETCM), qui intègre la gestion des données médicales massives et les services de calcul pharmacologique. Il vise à révéler la connotation scientifique de la théorie de la médecine traditionnelle chinoise et la valeur scientifique de la pensée originale dans la médecine traditionnelle chinoise, à résumer et à transmettre l’expérience de médecins célèbres, à contrôler la qualité de la médecine traditionnelle chinoise, à expliquer les principes d’action de la médecine traditionnelle chinoise, à la recherche et au développement de la nouvelle médecine chinoise, en particulier la découverte et l’optimisation des combinaisons de médicaments modernes, Fournir une base de données solide et des outils d’analyse. Sur la base de TCMIP v1.0, une mise à niveau complète est mise en œuvre, comprenant cinq bases de données principales et sept modules fonctionnels. Grâce à l’intégration du système et de l’intégration des modules, il est possible d’obtenir rapidement une analyse complète de la corrélation à plusieurs niveaux du réseau d’interaction « prescription du syndrome pathologique ». En tant que plate-forme intelligente d’exploration de données, TCMIP v2.0 fournira une base de données solide et une plate-forme d’analyse pour révéler la connotation scientifique de la théorie de la médecine traditionnelle chinoise et la valeur scientifique de la pensée originale dans la médecine traditionnelle chinoise, résumant et héritant de l’expérience de médecins célèbres, le contrôle de la qualité de la médecine traditionnelle chinoise, élucidant les principes d’action de la médecine traditionnelle chinoise, la recherche et le développement de nouveaux médicaments de médecine traditionnelle chinoise, en particulier la découverte et l’optimisation de combinaisons de médicaments modernes.
Lien Web : http://www.tcmip.cn/TCMIP  ;
Networkanalyzeest une plateforme d’analyse de visualisation en ligne pour l’analyse de l’expression génique et la méta-analyse. Il peut effectuer une analyse comparative, quantitative, différentielle et d’enrichissement de l’expression génique, une analyse d’interaction protéine-protéine, une analyse d’intégration de plusieurs ensembles de données, et peut également dessiner des images de grande valeur telles que l’ACP, le diagramme de réseau d’interaction protéine-protéine, la carte thermique, le diagramme de volcan, le diagramme de Wayne, etc.
Lien Web : Base de
données https://www.networkanalyst.ca/NetworkAnalyst/ PubMedNational Center for Biotechnology Information in the United States (NCBI)La base de données Pubmed est une base de données de littérature biomédicale gérée par la National Library of Medicine (NLM) aux États-Unis, visant à fournir les derniers résultats de la recherche médicale aux scientifiques, médecins, chercheurs et étudiants du monde entier. Cette base de données rassemble de la littérature biomédicale du monde entier, y compris des articles de revues, des articles, des livres, etc. À ce jour, la base de données Pubmed a rassemblé plus de 30 millions d’articles et est continuellement mise à jour chaque semaine.
Lien Web : https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/
R softwareRoss Ihaka et Robert GentlemanR est un langage et un environnement pour le calcul statistique et les graphiques. Il s’agit d’un projet GNU qui est similaire au langage et à l’environnement S qui ont été développés aux Laboratoires Bell (anciennement AT& T, aujourd’hui Lucent Technologies) par John Chambers et ses collègues. R peut être considéré comme une implémentation différente de S. Il y a
quelques différences importantes, mais une grande partie du code écrit pour S fonctionne sans modification sous R.
Lien Web : https://www.r-project.org/
Base de données et plateforme d’analyse pharmacologique des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP)Zhejiang Jiuwei Health Co., LtdTCMSP n’est pas seulement un référentiel de données, mais aussi une plate-forme d’analyse permettant aux utilisateurs d’étudier de manière exhaustive les médecines traditionnelles chinoises (MTC) : y compris l’identification des composants actifs, le criblage des cibles médicamenteuses et la génération de réseaux composés-cibles-maladies, ainsi que les informations pharmacocinétiques détaillées sur les médicaments impliquant la ressemblance médicamenteuse (DL), la biodisponibilité orale (OB), la barrière hémato-encéphalique (BHE), la perméabilité épithéliale intestinale (Caco-2), l’ALogP, la surface négative fractionnée (FASA-) et le nombre de   ; H-bond  ; donneur/accepteur   ; (Hdon/Hacc). Jusqu’à présent, le TCMSP a attiré une large attention et plusieurs groupes ont publié plus de 10 articles en utilisant notre base de données TCMSP en environ un an https://tcmsp-e.com><.

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