Rôle des lymphocytes T CD4 dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale récurrente-rémittente

Résumé

Un modèle expérimental d’encéphalomyélite auto-immune (EAE) chez la souris a été utilisé pour étudier le rôle des lymphocytes T CD4 dans la phase initiale et la rechute de l’EAE du point de vue de la phase d’activation et de la fonction de l’effet immunitaire.

Résumé

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune caractérisée par l’infiltration de cellules immunitaires et la démyélinisation du système nerveux central (SNC). L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) sert de modèle animal prototype pour l’étude de la SEP. Dans cette étude, nous avons cherché à étudier le rôle des lymphocytes T CD4 dans l’initiation et la rechute de l’EAE, en nous concentrant sur la phase d’activation et la réponse immunitaire. Pour créer le modèle de souris EAE, des souris femelles ont été immunisées avec de la glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG)35-55 émulsionnée avec un adjuvant de Freund complet (CFA). Les scores cliniques ont été évalués quotidiennement et les résultats ont démontré que les souris du groupe EAE présentaient un schéma cyclique classique. L’analyse de la coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) et au luxol fast blue (LFB) a révélé une infiltration significative de cellules inflammatoires dans le SNC et une démyélinisation chez les souris EAE. En ce qui concerne la phase d’activation, les lymphocytes T effecteurs CD4⁺CD69⁺ (Teff) et les lymphocytes T effecteurs mémoires CD4⁺CD44⁺CD62L^- (Tem) peuvent contribuer à l’initiation de l’EAE, cependant, la phase de rechute a probablement été dominée par les lymphocytes CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem. De plus, en termes de fonction immunitaire, les cellules T (Th)1 auxiliaires sont principalement impliquées dans l’initiation de l’EAE. Cependant, les cellules Th1 et Th17 contribuent toutes deux à la phase de rechute, et la fonction immunosuppressive des cellules T régulatrices (Treg) a été inhibée au cours du processus pathologique de l’EAE.

Introduction

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune caractérisée par l’infiltration du système nerveux central (SNC) par des cellules immunitaires et une démyélinisation ^1,2. Une étude récente a montré qu’il s’agissait de la maladie invalidante la plus fréquente chez les jeunes, avec une incidence en constante augmentation dans le monde³. L’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) est un modèle animal prototype de la SP qui simule de nombreux aspects de la phase inflammatoire de la SP⁴ chez l’humain. Du point de vue des fonctions immunitaires, les lymphocytes T CD4 initiaux qui n’ont pas encore rencontré d’antigènes sont appelés lymphocytes T(Th) 0 auxiliaires. Ces cellules subissent des processus de maturation et d’activation pour présenter diverses fonctions. Les lymphocytes T CD4 peuvent être classés en plusieurs sous-ensembles en fonction de leurs fonctions spécifiques, qui comprennent les cellules Th1, Th2, T régulatrice (Treg), T auxiliaire folliculaire (Tfh), Th17, Th9 et Th22⁵. Il est communément admis que les sous-types de cellules Th1 et Th17 sont des facteurs de pathogenèse cruciaux de l’EAE⁶. Les cellules Th1 pourraient sécréter de l’interféron γ (IFN-γ), et les cellules Th17 sécrètent de l’interleukine (IL)-17 et d’autres facteurs inflammatoires, qui pourraient activer d’autres cellules immunitaires comme les cellules microgliales et les astrocytes. Ces cellules produisent des cytokines inflammatoires⁷, telles que l’IL-18, l’IL-12, l’IL-23 et l’IL-1β, qui pourraient induire davantage la réponse immunitaire des cellules Th1/Th17, entraînant une démyélinisation progressive et des lésions axonales. Du point de vue de la phase d’activation, les lymphocytes T CD4 possèdent un destin prédéterminé pour se développer en sous-ensembles cellulaires distincts et en états différenciés, y compris les lymphocytes T naïfs, effecteurs et mémoires⁸. Les lymphocytes T CD4 initiaux prolifèrent et se différencient en une variété de sous-ensembles effecteurs ayant des fonctions différentes dans différents environnements⁹. La plupart des cellules effectrices ont une courte durée de vie, avec une petite population de cellules T se transformant en cellules T mémoires qui présentent des fonctions effectrices rapides lorsqu’elles rencontrent à nouveau les mêmes antigènes et fournissent à l’hôte une protection très puissante et à long terme^10,11.

Bien que les recherches actuelles suggèrent que les lymphocytes T CD4 jouent un rôle important dans le développement de l’EAE, on ne sait toujours pas comment les différents sous-ensembles de lymphocytes T CD4, classés en fonction de leur phase d’activation et de leur fonction d’effet immunitaire, contribuent à l’initiation et à la rechute de l’EAE. Dans la présente étude, nous avons établi le modèle EAE chez des souris C57BL6/J en immunisant le peptide myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG)35-55 et étudié l’initiation et la rechute de l’EAE, en nous concentrant sur la phase d’activation et la fonction immunitaire des lymphocytes T CD4.

Protocole

Un total de 18 souris femelles C57BL/6J âgées de six à huit semaines ont été divisées au hasard en un groupe témoin (n = 6) et un groupe EAE (n = 12) pour cette étude. Les souris ont été achetées au centre d’expérimentation animale de l’Université de médecine du Ningxia. Les souris ont été logées dans une pièce à température et humidité contrôlées avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un accès libre à de l’eau douce et à de la nourriture. L’approbation éthique a été obtenue du Comité d’éthique des animaux d’expérimentation de l’Université de médecine du Ningxia avant le début de l’étude.

1. Développement de l’EAE récurrente-rémittente chez les souris C57BL/6

1. Dissolution du réactif
   1. Dissoudre 5,4 mg de MOG35-55 (Table des matières) dans 1,8 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Peser 12,6 mg de Mycobacterium tuberculosis H37RA (tableau des matériaux) et l’ajouter à 1,8 mL de solution complète d’adjuvant de Freund (CFA) (tableau des matériaux). Dissoudre 360 μL de toxine coqueluche (PTX ; Table des matériaux) dans 7,2 mL de PBS à l’aide d’une pipette (Table of Materials).
2. Préparation de l’émulsion de MOG35-55 et CFA
   1. Pipeter la solution MOG35-55 et la solution CFA à l’aide de deux seringues de 5 mL préparées à l’étape 1.1 et les connecter à l’aide d’un robinet en T. Mélanger continuellement sur de la glace pendant 1 h jusqu’à l’obtention d’une émulsion laiteuse d’eau dans l’huile.
      REMARQUE : L’émulsion est préparée avec succès lorsqu’elle flotte à la surface de l’eau sans se disperser après l’avoir laissée tomber dans l’eau.
3. Anesthésie chez la souris
   1. Dévissez le capuchon du joint de remplissage à l’extrémité avant de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie. Versez lentement 20 ml d’isoflurane le long de la vis d’étanchéité au centre et verrouillez le bouchon de remplissage. Commutez l’interrupteur de la vanne en T pour vous assurer que le flux d’air de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie est communiqué avec le boîtier d’induction de l’anesthésie (tableau des matériaux).
   2. Connectez l’alimentation électrique de la pompe à air, allumez l’interrupteur de la pompe à air, puis tournez et ajustez la vanne de source d’air à l’extrémité avant du débitmètre d’oxygène de sorte que le débit de gaz de sortie soit de 400 ml/min. Ouvrez l’évaporateur, ajustez la concentration d’induction à 3 % et attendez que l’anesthésique remplisse la boîte d’induction.
   3. Environ 1 minute plus tard, placez les souris dans la boîte d’induction, puis fermez la boîte d’induction et attendez que les souris soient dans un sommeil profond, une relaxation musculaire et une respiration régulière ; ensuite, les souris pourraient être déterminées comme l’état idéal de l’anesthésie (Table des matériaux).
      REMARQUE : Commutez l’interrupteur de la vanne en T pour vous assurer que le flux d’air de l’évaporateur de l’appareil d’anesthésie est communiqué avec le masque d’anesthésie jusqu’à ce que les souris soient complètement anesthésiées.
4. Immunisation chez la souris
   1. Injecter par voie sous-cutanée 200 μL d’émulsion préparée à l’étape 1.2 à l’aide d’une seringue de 1 mL avec l’aiguille à quatre endroits sur le dos de la souris, à environ 0,5 cm des deux côtés de la colonne vertébrale à l’aisselle et dans le plan de l’aine¹² chez les souris du groupe EAE. Utiliser 50 μL d’émulsion à chaque site (tableau des matériaux).
5. Injection PTX
   1. Sortez les souris de la cage en attrapant la queue et placez-la sur le fil de la cage. Tenez la queue des souris avec les 4ème et 5ème doigts et tirez-la doucement vers le haut pour maintenir la tendance du corps et des membres vers l’avant. Saisissez la tête des souris et capturez la peau sur le dos des souris à l’aide du majeur et de l’annulaire.
   2. À 0 h et 48 h après l’immunisation, à l’étape 1.4, injecter 200 μL de PTX par voie intrapéritonéale à une position de 0,5 cm de chaque côté de la ligne médio-abdominale avec une profondeur de pénétration de 1 à 2 cm à l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille (tableau des matières).
      REMARQUE : Avant d’injecter PTX 48 h après l’immunisation de MOG35-55, il est nécessaire d’anesthésier les souris en utilisant les procédures décrites à l’étape 1.3. Les souris doivent être soignées jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment de conscience pour maintenir leur décubitus sternal.
   3. Pour les souris du groupe témoin, traitez avec une solution saline en utilisant la même méthode et évaluez quotidiennement le score clinique.
      REMARQUE : Les souris ont été évaluées pour détecter des signes d’EAE selon l’échelle suivante¹³ : 0 = aucun symptôme de la maladie, 1 = paralysie complète de la queue, 2 = paralysie/faiblesse partielle de l’arrière-train, 3 = paralysie complète des membres postérieurs, 4 = paralysie des membres antérieurs et postérieurs et 5 = état moribond.

2. Analyse histologique de la coloration

1. Collecte de cerveaux
   1. Anesthésez les souris en suivant l’étape 1.3. Euthanasiez les souris par luxation cervicale et ouvrez la poitrine pour exposer complètement le cœur. Coupez l’auricule dextra et perfusez-le lentement avec une solution saline pré-refroidie à l’aide d’une seringue de 20 ml avec une aiguille au ventricule gauche jusqu’à ce que le foie devienne gris et blanc.
   2. Perfuser lentement avec 4 % de paraformaldéhyde jusqu’à ce que le bout de la queue se retourne, que le corps devienne raide et que le foie devienne dur. Décapitez la tête, coupez le crâne, récupérez le cerveau à l’aide d’une pince à épiler et fixez-le dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h (tableau des matériaux).
2. Préparation des sections de paraffine
   1. Déshydratation par gradient : Immerger successivement les tissus cérébraux de l’étape 2.1 dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 h, de l’éthanol à 80 % pendant 1 h, de l’éthanol à 95 % pendant 1 h, de l’éthanol anhydre pendant 1 h, remplacer par de l’éthanol anhydre frais, poursuivre l’immersion pendant 1 h (Table des matériaux).
   2. Transparence : Immergez les tissus cérébraux de l’étape 2.2.1 dans du xylène pendant 30 min, remplacez-les par du xylène frais et continuez à immerger jusqu’à ce que les tissus soient transparents (tableau des matériaux).
   3. Enrobage : Incorporer les tissus cérébraux de l’étape 2.2.2 dans de la paraffine pendant 1 h, les remplacer par de la paraffine fraîche, poursuivre l’enrobage pendant 1 h, couper en tranches de 6 μm après le démoulage du moule, placer la lame dans de l’eau chaude, sécher à 37 °C, conserver à température ambiante (tableau des matériaux).
   4. Déparaffinage : Immerger les tissus cérébraux de l’étape 2.2.3 dans du xylène pendant 20 min, les remplacer par du xylène frais, poursuivre l’immersion pendant 20 min, les placer dans de l’éthanol anhydre pendant 5 min, les remplacer par de l’éthanol anhydre frais, les immerger pendant 5 min, de l’éthanol à 75 % pendant 5 min, rincer à l’eau du robinet (tableau des matériaux).
   5. Coloration à l’hématoxyline-éosine (H&E) : Teindre les tissus à partir de l’étape 2.2.4 avec une solution d’hématoxyline pendant 3 à 5 min, puis rincer à l’eau du robinet. Traitez les tissus avec une solution de différenciation de l’hématoxyline, brièvement et rincez abondamment à l’eau du robinet. Traitez les tissus avec la solution de bleuissement du robinet d’hématoxyline Scott et rincez à l’eau du robinet. Immergez dans de l’éthanol à 85 % pendant 5 min et de l’éthanol à 95 % pendant 5 min, et colorez les étapes avec un colorant à l’éosine pendant 5 min (tableau des matériaux).
   6. Déshydrater : Immerger successivement les tissus de l’étape 2.2.5 dans de l’éthanol anhydre pendant 5 min, les remplacer par de l’éthanol anhydre frais, poursuivre l’immersion pendant 5 min, les remplacer par de l’éthanol anhydre frais, les immerger pendant 5 min, les placer dans du xylène frais, les remplacer par du xylène frais, les immerger pendant 5 min, les fermer avec de la gomme neutre (Table des matières).
   7. Observer au microscope les tissus cérébraux et effectuer l’acquisition et l’analyse d’images (Table des matériaux).

3. Analyse de la coloration LFB

1. Collection de gaines de myéline : Coupez la colonne vertébrale de la souris de la terminaison de la tête vers le haut de 2 segments jusqu’à la terminaison de la queue vers le bas de 2 segments, soufflez la moelle épinière jusqu’à la terminaison de la queue et fixez la moelle épinière dans une solution de paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h.
   REMARQUE : La gaine de myéline a été prélevée sur les mêmes souris à l’étape 2.1, et les étapes de la perfusion cardiaque sont les mêmes qu’à l’étape 2.1.
2. Déparaffinisation et réhydratation des sections de paraffine : Placez successivement les lames de l’étape 3.1 dans du xylène pendant 20 min, remplacez-les par du xylène frais, poursuivez l’immersion pendant 20 min, de l’éthanol anhydre pendant 5 min, remplacez-les par de l’éthanol anhydre frais, immergez-les pendant 5 min, avec de l’alcool à 75 % pendant 5 min, lavez à l’eau du robinet.
3. Coloration bleue rapide : Placez la solution de coloration bleue rapide Luxol A dans un four à 60 °C et préchauffez pendant 30 min. Mettez les lames de l’étape 3.2 dans la solution A et couvrez-les d’une membrane plastique pendant 1 h pour éviter que les tranches ne se dessèchent, puis retirez les lames et lavez-les rapidement à l’eau du robinet.
4. Différenciation de l’arrière-plan : Placez les lames de l’étape 3.3 dans la solution B de coloration bleue rapide Luxol pendant 2 s (pendant que le colorant est chaud), et immergez-les directement dans la solution C de coloration bleue rapide Luxol pour la différenciation pendant 15 s, lavez à l’eau jusqu’à ce que la gaine de myéline soit bleue et que le fond soit presque incolore.
5. Coloration du comptoir à l’éosine : Mettez les lames de l’étape 3.4 dans le four à 65 °C pour le séchage. Une fois cela fait, retirez-les du four et laissez-les refroidir. Mettez les lames dans de l’éthanol à 95 % et de l’éosine pendant 1 min.
6. Déshydratation et scellement : Placez successivement les lames de l’étape 3.5 dans de l’éthanol anhydre pendant 5 min, remplacez-les par de l’éthanol anhydre frais, poursuivez l’immersion pendant 5 min, remplacez à nouveau par de l’éthanol anhydre frais, continuez à immerger pendant 5 min, du xylène 5 min, remplacez par du xylène frais, immergez pendant 5 min. Lavez et séchez les échantillons et scellez-les avec de la gomme neutre.
7. Examen au microscope : Recueillir et analyser des images à l’aide d’un microscope optique droit (Table des matériaux).

4. Analyse par cytométrie en flux

1. Ouvrez la cavité abdominale des souris. Extrayez la rate à l’aide d’une pince à épiler et coupez-la en petits morceaux de 1,5 à 2,5 cm dans du PBS sur de la glace à l’aide de ciseaux. Broyer la rate dans 10 mL de RPMI-1640 contenant 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) à l’aide d’un piston de seringue de 2,5 mL et la pousser à travers une crépine à cellules de 70 μm pour obtenir une suspension unicellulaire (Table des matériaux).
   REMARQUE : Les rates ont été prélevées sur les mêmes souris à l’étape 2.1.
2. Transvaser la suspension obtenue à l’étape 4.1 dans des tubes de 15 mL et lyser à l’aide de 5 mL de tampon de lyse des globules rouges sur de la glace pendant 10 min. Laver avec du RPMI-1640 contenant 2 % de FBS, centrifuger à 350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec du RPMI-1640 contenant 2 % de FBS.
3. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur automatique de cellules (Table des matériaux) et ajustez la concentration à 1 x 10⁶ cellules/mL.
4. Pipeter 100 μL de suspension cellulaire dans des tubes de 1,5 mL et incuber avec 1 μL d’anticorps anti-CD16/32¹⁴ (0,5 mg/mL) pendant 30 min pour bloquer la coloration non spécifique. Laver avec le RPMI-1640 et centrifuger à 350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans 100 μL de RPMI-1640 contenant 2 % de FBS.
5. Coloration avec des anticorps spécifiques pour CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC) et CD69 (BV674) pour les cellules de teff¹⁵ pendant 30 min, 2 μL pour chaque anticorps. Coloration avec des anticorps spécifiques pour CD45 (Alexa Fluor 700), CD3 (FITC), CD4 (APC), CD44 (BV421) et CD62L (PE) pour les cellules Tem¹⁶ pendant 30 min, 2 μL pour chaque anticorps. Laver avec le RPMI-1640 et centrifuger à 350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 350 μL de PBS. Analysez les proportions cellulaires à l’aide d’un cytomètre en flux et du logiciel associé (Table des matériaux).

5. Analyse des cytokines par réseau de billes cytométriques

1. Utilisez le réseau de billes cytométriques (Table des matériaux) pour mesurer l’IL-2, l’IL-4, l’IL-6, l’IL-10, l’IL-17A, le facteur de nécrose tumorale (TNF)-α et l’IFN-γ dans le cerveau des souris, selon les méthodes décrites ci-dessous.
2. Récupérez le cerveau de la souris comme décrit à l’étape 2.1.
3. Extraction de protéines totales : Coupez et pesez 50 mg de tissu cérébral (trois cerveaux dans le groupe témoin, le groupe EAE au stade maximal et le stade RR). Placez les cerveaux dans des tubes de 1,5 mL et ajoutez 500 μL de tampon de lyse contenant du PMSF, un inhibiteur de protéase et des inhibiteurs de phosphatase.
4. Découper les cerveaux en petits morceaux d’environ 1 mm³, extraire par homogénéisateur à ultrasons à 400 W, 5 s ON et 5 s OFF ; Répétez l’opération 5 fois. Placez le tube sur de la glace pendant 10 min, centrifugez à 12000 x g pendant 5 min et récupérez le surnageant (tableau des matériaux).
5. Préparez les étalons de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris comme décrit ci-dessous.
   1. Ouvrez un flacon d’étalons de souris lyophilisés Th1/Th2/Th17. Transvasez les étalons dans un tube conique en polypropylène de 15 ml. Étiquetez le haut du tube en standard.
   2. Reconstituer les étalons dans 2,0 mL de diluant de dosage. Laisser l’étalon reconstitué s’équilibrer pendant 15 min à température ambiante. Mélangez délicatement la protéine reconstituée par pipetage.
   3. Étiquetez les tubes de 12 mm x 75 mm et disposez-les dans l’ordre de dilution suivant : 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 et 1:256. Pipeter 300 μL de diluant de dosage dans chaque tube marqué.
   4. Effectuer des dilutions en série : Transvaser 300 μL de l’étalon supérieur dans le tube de dilution 1:2 et bien mélanger par pipetage. Poursuivez les dilutions en série en transférant 300 μL du tube 1:2 au tube 1:4 et ainsi de suite jusqu’au tube 1:256. Préparez un tube de 12 mm x 75 mm contenant uniquement le diluant de dosage qui servira de témoin négatif à 0 pg/mL.
      REMARQUE : Bien mélanger par pipetage. Ne pas vortex pour empêcher le couplage des anticorps sur les microbilles de tomber.
   5. Pour mélanger les billes de capture de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris, préparez 19 tubes, y compris des étalons avec 3 échantillons dans chaque groupe (groupe témoin, groupe EAE au stade de pointe et stade RR) pour l’expérience. Agiter vigoureusement la suspension de la bille de capture pendant 5 s avant de mélanger. Ajoutez 190 μL de chaque cordon de capture dans un seul tube et étiquetez-le comme un mélange de billes de captage. Tourbillonnez soigneusement le mélange de billes.
      REMARQUE : Les billes conjuguées aux anticorps se déposeront hors de la suspension au fil du temps. Il est nécessaire de vortex le flacon avant de prélever une aliquote de suspension de billes.
   6. Pour effectuer le test, vortex les billes de capture du mélange. Ajouter 50 μL de billes dans tous les tubes de dosage. Ajouter 50 μL de dilutions standard de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris dans les tubes témoins, comme indiqué dans le tableau 1.
   7. Ajouter 50 μL de réactif de détection PE Th1/Th2/Th17 de souris dans tous les tubes de test. Incuber les tubes de dosage pendant 2 h à température ambiante et les protéger de la lumière. Ajouter 1 mL de tampon de lavage dans chaque tube d’essai et centrifuger à 200 x g pendant 5 min. Aspirez et jetez soigneusement le surnageant de chaque tube de dosage.
   8. Ajouter 300 μL de tampon de lavage dans chaque tube de dosage pour remettre la bille en suspension. Analysez les données de cytokines Th1/Th2/Th17 de souris à l’aide du logiciel FCAP Array (Table of Materials).

  

Résultats

Évaluation des scores cliniques
Comme le montre la figure 1, les souris du groupe témoin n’ont présenté aucun symptôme clinique. Les souris du groupe EAE, qui ont été immunisées avec MOG35-55, ont présenté une paralysie de la queue environ 12 jours après l’immunisation. Au 16e jour, les symptômes ont atteint une paralysie complète des membres postérieurs (définie comme le stade de pointe, Peak). Après cela, les symptômes ont progressivement disparu. Les symptômes cliniques des souris ont été aggravés vers le 25e jour et ont atteint une paralysie complète des membres postérieurs vers le 30e jour (définie comme un stade récurrent, RR). Notamment, les symptômes ont duré plus longtemps que la fois précédente, ce qui a développé une caractéristique cyclique classique. La principale manifestation de l’EAE récurrente-rémittente Les souris connaissent différents stades d’épidémie, de rémission et de rechute au cours de la progression de la maladie, qui ont une certaine périodicité et fluctuation.

Analyse histologique
Les souris du groupe témoin présentaient une structure de tissu cérébral intacte avec des vaisseaux sanguins uniformément répartis et clairement définis, sans aucune infiltration de cellules inflammatoires. (Figure 2A). Au stade maximal des souris du groupe EAE, une infiltration significative de cellules inflammatoires a été observée dans le cerveau (Figure 2B), formant des changements en forme de brassard autour des vaisseaux sanguins (indiqués par une flèche rouge). De même, chez les souris du groupe EAE au stade RR, il y avait une infiltration évidente de cellules inflammatoires (Figure 2C), avec une agrégation prédominante autour des vaisseaux sanguins (indiquée par une flèche rouge).

Analyse de la coloration LFB
Dans le groupe témoin, la gaine de myéline de la substance blanche de la colonne vertébrale est apparue bleue, indiquant que sa structure était intacte et serrée (Figure 3A). Au stade culminant du groupe EAE, la substance blanche de la colonne vertébrale présentait une couleur bleu clair ou blanche ; la structure semblait lâche et discontinue, avec une présence significative de dégénérescences vacuolaires indiquée par une flèche rouge (Figure 3B). Dans le stade RR du groupe modèle EAE, une perte importante de myéline de substance blanche dans la moelle épinière a été observée. La structure semblait lâche et un nombre important de dégénérescences vacuolaires ont pu être observées (indiquées par des flèches rouges ; Figure 3C).

Test de cytométrie en flux
Les résultats présentés dans la figure 4A,B ont démontré une augmentation significative de la proportion de cellules Teff CD4⁺CD69⁺ chez les souris EAE au stade de pointe par rapport au groupe témoin (P < 0,0001). De plus, la proportion de ces cellules a également augmenté au cours de la phase RR, bien que la différence ne soit pas statistiquement significative (P > 0,05). La figure 4C,D a révélé une augmentation notable de la proportion de cellules CD4⁺CD44⁺CD62L^- Tem chez les souris EAE aux stades de pointe et RR, par rapport au groupe témoin (P < 0,0001).

Cytokine mesurée par réseau de billes cytométriques
Les résultats illustrés à la figure 5 montrent que, par rapport au groupe témoin, les niveaux d’IL-4 (P < 0,0001), d’IL-6 (P < 0,001), d’IFN-γ (P < 0,0001) et de TNF-α (P < 0,0001) étaient significativement élevés dans le groupe EAE au stade de pointe. Bien que l’expression de l’IL-17A ait également augmenté, la différence n’était pas statistiquement significative (P > 0,05). De plus, le niveau d’IL-2 n’a montré aucun changement au cours de la phase de pointe des souris EAE (P > 0,05) ; cependant, elle a augmenté de manière significative au cours de la phase RR (P < 0,01). De plus, les expressions du TNF-α (P < 0,001) et de l’IL-17A (P < 0,01) au stade RR étaient significativement plus élevées que celles observées dans le groupe témoin. À l’inverse, l’expression de l’IL-10 dans le groupe EAE était significativement plus faible que dans le groupe témoin, tant aux stades de crête qu’aux stades RR (P < 0,0001).

Figure 1 : Évaluation du score clinique. Le score clinique a été évalué quotidiennement et montre que les souris ont développé une EAE cyclique classique immunisée par MOG35-55. (A) Le diagramme de la progression des symptômes des souris EAE. (B) L’évaluation des souris EAE à l’aide de scores cliniques moyens. Les données sont exprimées en moyenne ± MEB, n = 6. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à un facteur avec des comparaisons a posteriori pour évaluer les différences statistiquement significatives. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Carte microscopique de la coloration H&E du cerveau. (A) Cerveau de souris dans le groupe témoin. (B) Le cerveau des souris EAE est au stade de pointe. Les cellules inflammatoires ont été infiltrées dans le cerveau au stade maximal chez les souris du groupe EAE et distribuées autour des vaisseaux sanguins pour former un changement en forme de coiffe (flèche rouge). (C) Cerveau de souris EAE au stade RR. Les cellules inflammatoires des souris du groupe EAE du stade RR se sont agrégées autour des vaisseaux sanguins (flèche rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Carte microscopique de la coloration LFB de la gaine de myéline. (A) Gaine de myéline de souris dans le groupe témoin. (B) Gaine de myéline de souris EAE au stade de pointe. La substance blanche de la colonne vertébrale était bleu clair ou blanche, la structure était lâche et discontinue, et un grand nombre de dégénérescences vacuolaires apparaissaient (flèche rouge). (C) Gaine de myéline de souris EAE au stade RR. La myéline de la substance blanche de la moelle épinière a été largement perdue, la structure était lâche et un grand nombre de dégénérescences vacuolaires sont apparues (flèche rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : L’immunisation par MOG35-55 a induit la régulation à la hausse de la proportion de cellules CD4 Teff et Tem au stade de pointe et de RR chez les souris EAE. (A) Graphique de flux illustratif montrant l’immunocoloration des cellules CD4⁺CD69⁺. (B) Pourcentage de cellules de teff CD4⁺CD69⁺. (C) Graphique d’écoulement illustratif montrant l’immunomarquage des cellules CD44⁺CD62L⁺ (porte sur les cellules T CD4). (D) Pourcentage de cellules CD44⁺CD62L⁺ Tm. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM, n = 5. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à un facteur avec des comparaisons a posteriori pour évaluer les différences statistiquement significatives. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Niveau de cytokines dans le cerveau de souris analysé par réseau de billes cytométriques. Les données sont exprimées en moyenne ± MEB, n = 3. Les données ont été analysées à l’aide d’une ANOVA à un facteur avec des comparaisons a posteriori pour évaluer les différences statistiquement significatives. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Étiquette du tube	Concentration (pg/mL)	Dilution standard des cytokines
1	0 (témoin négatif)	pas de dilution standard (diluant de dosage uniquement)
2	20	1:256
3	40	1:128
4	80	1:64
5	156	1:32
6	312.6	1:16
7	625	1:8
8	1250	1:4
9	2500	1:2
10	5000	Norme supérieure

Tableau 1 : Liste des dilutions standard des cytokines dans les tubes témoins.

Discussion

La SEP est la maladie démyélinisante auto-immune la plus répandue du SNC, qui touche des millions de personnes dans le monde¹⁷. L’EAE est le modèle animal typique pour simuler les caractéristiques pathologiques cliniques de la SEP¹⁸. Des études ont démontré que les personnes atteintes de SP présentent des troubles cognitifs et d’autres handicaps dus à la dégénérescence des axones et des neurones du SNC 19,20,21. Au stade maximal et RR du modèle EAE, les souris présentaient une paralysie de la queue et des membres postérieurs. De plus, on a observé que des cellules inflammatoires s’infiltrent dans le SNC, entraînant divers degrés de perte de gaine de myéline. Ces résultats ont indiqué que l’établissement réussi du modèle EAE dans cette expérience était réussi.

Le processus d’émulsification du MOG35-55 et du CFA doit être effectué sur de la glace pour éviter la dégradation du MOG35-55 causée par la génération de chaleur pendant le processus d’homogénéisation. PTX est administré par voie intrapéritonéale pour améliorer la perméabilité vasculaire, ce qui permet aux lymphocytes T de traverser facilement la barrière hémato-encéphalique et d’atteindre la gaine de myéline entourant les neurones^22. Ce qui nécessite une attention particulière, c’est que dans les cas où les souris deviennent paralysées et ne supportent pas de manger ou de boire par elles-mêmes, il est important de leur fournir des plateaux de nourriture et d’eau dans leur cage ou de les nourrir manuellement pour éviter une soif et une faim excessives.

La cytométrie en flux a été utilisée pour analyser la proportion de cellules Teff CD4⁺CD69⁺ et de cellules Tem CD4⁺CD44⁺CD62L^- . La proportion de cellules Teff CD4⁺CD69⁺ dans la rate des souris EAE était remarquablement régulée à la hausse au stade de pointe. De plus, il était plus élevé que celui du groupe témoin au stade de la rechute, bien que cette différence n’ait pas atteint une signification statistique. D’autre part, la proportion de cellules Tem CD4 ⁺ CD44 ⁺ CD62L^- était significativement plus élevée chez les souris EAE par rapport au groupe témoin au stade de pointe et RR. Cela suggère que l’initiation de l’EAE pourrait impliquer à la fois les cellules Teff CD4⁺CD69⁺ et les cellules Tem CD4⁺CD44⁺CD62L^- au stade de pointe, tandis que le stade RR est peut-être principalement dominé par les cellules Tem CD4⁺CD44⁺CD62L^- . CD69 est la molécule de surface membranaire la plus précoce exprimée lors de l’activation des lymphocytes. Il joue un rôle crucial dans la modulation de l’adhésion et de la migration des lymphocytes T, aidant ainsi les cellules immunitaires à identifier et à localiser les sites d’infection ou d’inflammation dans le corps²³. Les lymphocytes T au repos n’expriment pas CD69, mais lorsqu’ils sont stimulés et activés par des activateurs anti-CD3/TCR, ils peuvent être exprimés par induction²⁴. Après l’étape effectrice, une partie importante des lymphocytes T subissent l’apoptose car ils sont incapables de se différencier davantage. Cette réduction est principalement causée par l’absence de cytokines pro-survie, y compris l’IL-2, qui sont produites lors de la stimulation de l’antigène. De plus, la régulation négative des récepteurs de ces cytokines contribue davantage à ce phénomène de contraction clonale²⁵. De plus, l’élimination de l’agent infectieux par une réponse immunitaire adaptative conduit à la contraction clonale des lymphocytes T, laissant finalement moins de cellules mémoire à longue durée de vie pour fournir une réponse immunitaire à l’hôte en cas de réinfection par l’agent pathogène²⁶. Dans la présente étude, la proportion de lymphocytes T CD4⁺CD69⁺ était remarquablement élevée au stade de pointe, mais diminuait au stade RR, ce qui indiquait que les cellules CD4 Teff sont incapables de survivre pendant une certaine période et finissent par subir une apoptose, seule une petite fraction des lymphocytes T spécifiques de l’antigène se développe en lymphocytes T à mémoire à longue durée de vie. Les cellules Tem ont une faible expression de CD62L. Cependant, ils sont capables d’exprimer certains récepteurs de chimiokines et molécules d’adhésion qui facilitent leur migration vers les tissus enflammés. Après la réactivation de l’antigène, le taux de prolifération est relativement lent, mais les cytokines sont rapidement libérées pour initier la fonction effectrice²⁷. Dans la présente étude, les antigènes chez les souris libérés de l’émulsion et attaquant à nouveau le système immunitaire, les cellules Tem peuvent être réactivées et libérer un grand nombre de cytokines, telles que l’IL-6 et l’IFN-γ, ce qui peut entraîner la rechute des souris EAE.

Les populations primaires de lymphocytes T CD4 pro-inflammatoires associées aux maladies auto-immunes (y compris la SEP) sont les cellules Th1 qui sécrètent l’IL-2, l’IL-6, l’IFN-γ, le TNF-α et les cellules Th17 qui sécrètent l’IL-17. Il a été démontré que l’IFN-γ associé aux cellules Th1 peut avoir un effet néfaste direct sur les oligodendrocytes, entraînant des dommages aux neurones du SNC^{du patient 28}. Les cellules Th17 jouent également un rôle important dans plusieurs maladies auto-immunes, y compris la SEP. La recherche a observé des niveaux élevés de cellules Th17 et d’ARNm IL-17 dans les lésions cérébrales des patients atteints de SEP par rapport aux personnes non atteintes de la maladie²⁹. Les cellules Treg, qui se caractérisent par la production d’IL-10 et de TGF-β³⁰, ont un effet immunosuppresseur et jouent un rôle crucial dans le maintien de la tolérance du système immunitaire aux auto-composants, permettant ainsi à l’organisme de maintenir l’homéostasie immunitaire. Ici, nous avons observé une régulation positive significative de l’expression de l’IL-4, de l’IL-6, de l’IFN-γ et du TNF-α dans le groupe EAE au stade du pic. De plus, l’expression de l’IL-17A a également été augmentée, bien qu’il n’y ait pas eu de signification. En revanche, les niveaux d’expression du TNF-α et de l’IL-17A au stade RR étaient significativement plus élevés par rapport au groupe témoin. Cela suggère que le stade de pointe de l’EAE est principalement piloté par les cellules Th1 plutôt que par les cellules Th17, tandis que le stade RR de l’EAE a été initié à la fois par les cellules Th1 et Th17. Il convient de noter que l’expression de l’IL-10 dans le groupe EAE à la fois au pic et à la période RR était nettement plus faible que celle du groupe témoin, ce qui suggère que la fonction immunosuppressive des cellules Treg a été entravée pendant la procession pathologique de l’EAE.

En conclusion, nos études suggèrent l’établissement réussi d’un modèle d’EAE récurrente-rémittente chez la souris par immunisation avec le peptide MOG35-55. Du point de vue de la phase active, le stade de pointe de l’EAE a probablement été initié par les cellules Teff CD4⁺CD69⁺ et CD4⁺CD44⁺CD62L-Tem Stem, tandis que la rechute du stade RR de l’EAE pourrait être principalement dominée par les cellules Tem CD4⁺CD44⁺CD62L^-. Du point de vue de la fonction de l’effet immunitaire, le stade maximal de l’EAE a été principalement initié non pas par les cellules Th17 mais par les cellules Th1. Cependant, le stade RR de l’EAE a été initié par les cellules Th1 et Th17. La fonction immunosuppressive des cellules Treg a été inhibée au cours du processus pathologique de l’EAE. Néanmoins, les mécanismes moléculaires sous-jacents à l’activation des cellules Th1/Th17 et à la suppression des cellules Treg nécessitent des recherches plus approfondies.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Appareil d’anesthésie évaporateur	Norvap	20-17368
; Isoflurane	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.
70 &mu ; crépine à cellules m	XIYAN Co., Ltd.	15-1070
Alexa Fluor 700 anti-souris CD45 Anticorps	Biolegend	103128
APC anti-souris CD4	Biolegend	100616
Compteur automatique de cellules	Jiangsu JIMBIO technology Co., LTD	JIMBIO iCyta S2
BD* Cytometric Bead Array (CBA) Souris Th1/Th2/Th17 CBA Kit	BD Biosciences	560485
Biotine anti-souris CD16/32 Anticorps	Biolegend	101303
Brilliant Violet 510 Anti-souris CD69 Anticorps	Biolegend	104532
BV786 Rat Anti-Souris CD62L(MEL-14)	BD Pharmingen	563109
Colonne Tissu& Kit d’extraction de protéines cellulaires	Shanghai Epizyme Biomedical Technology Co., Ltd	PC201Plus
Adjuvant complet de Freund	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	;
Déshydrateur	DIAPATH	Donatello
Seringue stérilisée jetable (1 mL)	Yikang Group	210820
Seringue stérilisée jetable (2,5 mL)	Yikang Group	210820
Seringue stérilisée jetable (5 mL)	Yikang Group	210820
Machine à teindre	DIAPATH	Giotto
Machine d’enrobage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd	JB-P5
Ethanol	SCRC	100092683
Sérum bovin fœtal	Procell Life Science& Technology Co., Ltd.	FSP500
FITC Hamster Anti-Souris CD3e(145-2C11)	BD Pharmingen	553062
Cytomètre	en flux Becton,Dickinson and Company	FACSCelesta
Cytomètre en flux	Becton,Dickinson and Company Accuri	C6
Flow Jo software	BD Biosciences	10.8.1
Plate-forme congelée	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd  ;	JB-L5
Lame en verre	Servicebio	G6004
HE kit de solutions de colorants	Servicebio	G1003
Solution d’hématoxyline-éosine	Servicebio	G1002
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse	Thermo Fisher Scientific	Mogafugo8R
Système d’imagerie	Nikon	NIKON DS-U3
Luxol kit de coloration bleue rapide	Servicebio	G1030
Ms CD44 BV421 IM7	BD Pharmingen	564970
Mycobacterium tuberculosis H37RA	BD Pharmingen	231141
Glycoprotéine oligodendrocytaire de myéline (MOG35-55)	AnaSpec	AS-60130-1
Gomme neutre	SCRC	10004160
Organizer	KEDEE	KD-P
Four	Labotery	GFL-230
Trancheuse de pathologie	Leica	RM2016
Toxine coquelucheuse de Bordetella pertussis	Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.	P7208
Saline tamponnée au phosphate	Servicebio	G4202
Pipette 0.5-10 &mu ; L	DLAB Scientific	7010101004
Pipette 100-1000 &mu ; L	DLAB Scientific	7010101014
Pipette 20-200 &mu ; L	DLAB Scientific	7010101009
RPMI-1640	Procell Life Science& Technology Co., Ltd.
Valve en T	Guangdong Kanghua Medical Co., LTD	A06
Épandeur de tissus	Zhejiang Kehua Instrument Co., Ltd	KD-P
Microscope optique droit	Nikon	NIKON ECLIPSE E100
Xylene	SCRC	10023418