Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

Résumé

Cet article présente une procédure expérimentale détaillée pour reconstituer des attaches d’ADN contenant des nucléosomes pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique. Il décrit en outre plusieurs expériences en aval qui peuvent être menées pour visualiser le comportement de liaison des protéines interagissant avec la chromatine et analyser les changements dans les propriétés physiques des nucléosomes.

Résumé

Les nucléosomes constituent l’unité primaire de la chromatine eucaryote et ont fait l’objet de nombreuses études informatives sur des molécules uniques concernant leurs propriétés biophysiques et leurs interactions avec les protéines de liaison à la chromatine. La reconstitution des nucléosomes sur l’ADN pour ces études implique généralement une procédure de dialyse au sel qui fournit un contrôle précis sur le placement et le nombre de nucléosomes formés le long d’un lien d’ADN. Cependant, ce protocole prend du temps et nécessite une quantité substantielle d’ADN et d’octamères d’histones comme entrées. Pour offrir une stratégie alternative, une méthode de reconstitution in situ des nucléosomes pour la microscopie à force de force et de fluorescence à molécule unique qui utilise le chaperon d’histones Nap1 est décrite. Cette méthode permet aux utilisateurs d’assembler des nucléosomes sur n’importe quelle matrice d’ADN sans avoir besoin de fortes séquences de positionnement de nucléosomes, d’ajuster la densité des nucléosomes à la demande et d’utiliser moins de réactifs. La formation de nucléosomes in situ se produit en quelques secondes, offrant un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des mesures à molécule unique. Des exemples de deux tests en aval pour sonder la mécanique des nucléosomes et visualiser le comportement de protéines individuelles sur la chromatine sont décrits plus en détail.

Introduction

L’unité d’emballage primaire de la chromatine eucaryote est le nucléosome, dans lequel ~147 paires de bases (pb) d’ADN sont enroulées autour d’un octamère des protéines^{d’histones centrales 1,2}. En plus de l’empaquetage du génome, l’architecture des nucléosomes sert d’autre couche riche de régulation biophysique qui peut être exploitée par les protéines de liaison à la chromatine lors de l’exécution de leurs diverses fonctions ^3,4. L’accès expérimental et la mesure des caractéristiques physiques des nucléosomes ont été ....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’ADN biotinylé

1. Préparez une réaction volumique de 120 μL contenant 20 μg d’ADN λ, 33 μM de biotine-dCTP, 33 μM de biotine-dUTP, 33 μM de biotine-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unités d’enzyme Klenow et 1 tampon NEB 2.
   REMARQUE : Cette procédure utilise spécifiquement de l’ADN génomique linéaire double brin (ds) sans méthylation du bactériophage λ (48 502 bps), qui contient 12 nucléotides (nt) 5' monocaténaire (ss)²³. C....

Résultats

À l’aide de la configuration décrite à l’étape 3 (figure 1A), la formation de nucléosomes le long du lien d’ADN a été visualisée sous la forme de foyers fluorescents rouges sur un balayage 2D (figures 1B, à gauche) ou de trajectoires dans le temps sur un kymographe (figure 1B, à droite). Des nucléosomes correctement enveloppés ont produit des trajectoires de fluorescence qui étaient stationnaires dans le temps à l’intérieur de la li.......

Discussion

Le protocole décrit offre plusieurs avantages pour la reconstitution des nucléosomes, notamment la minimisation des réactifs et du temps, ainsi que la formation de nucléosomes dépendants des chaperons le long de n’importe quelle séquence d’ADN (potentiellement native). De plus, la méthode in situ permet un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des dosages à molécule unique de la mécanique des nucléosomes et de l’interaction protéine-chromatine........

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x tampon	HR N/A	N/A	30 mM  ; tris  ; acétate pH 7,5, 20 mM d’acétate de magnésium, 50 mM de chlorure de potassium, 0,1 mg/mL de BSA.
1x PBS (solution saline tamponnée au phosphate)	N/A	N/A	137 mM chlorure de sodium, 2,7 mM chlorure de potassium, 10 mM phosphate de sodium dibasique, 1,8 mM phosulfate de potassium monobasique.
Acide acétique, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Utiliser pour fabriquer du tris acétate
Biotine-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotine-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotine-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Albumine sérique bovine	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissoudre dans H2O et passage à travers un filtre de 0,22 μm
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide fonctionnalisé Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Centrifugeuse de paillasse avec refroidissement
Alcool éthylique,	Millipore Sigma	pur 459844
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissoudre dans H2O à 0,5 M
Octamère d’histones humaines (H4, L50C ; H2A, K119C)  ;	N/A	N/A	protéines d’histones recombinantes et celles hébergeant des mutations de marquage ont été purifiées en interne comme décrit précédemment (voir réf. 33, 34, 35, 36). En bref, les histones recombinantes ont été exprimées dans les cellules pLySS BL21 (De3) (Promega). Les corps d’inclusion ont été isolés après sonication, et les histones ont été extraites dans des conditions de dénaturation. Les histones ont été dialysées dans le tampon A (7 M d’urée, 10 mM de chlorhydrate de tris pH 8,0, 100 mM de chlorure de sodium, 1 mM d’EDTA et 5 mM de 2-mercaptoéthanol), et la solution a été ajoutée à une colonne gravitaire chargée de Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). L’écoulement a ensuite été ajouté à une colonne de gravité SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), et les histones ont été éluées de la colonne en ajoutant le tampon A complété par 600 mM de chlorure de sodium. Des histones porteuses de mutations de marquage (H4, L50C ; H2A, K119C) ont été purifiés puis conjugués au fluorophore souhaité via des colorants fonctionnalisés par maléimide (Cytiva, Lumidyne) en utilisant un rapport molaire colorant/protéine de 20:1 (voir réf. 33, 34). Les octamères d’histones ont été assemblés en ajoutant un rapport molaire égal de chaque histone de type sauvage ou marquée au fluorophore dans des conditions de dénaturation, dialysés dans un tampon à haute teneur en sel contenant 2 M de chlorure de sodium, puis purifiés par chromatographie d’exclusion stérique comme décrit précédemment (voir réf. 36, 37). Alternativement, des protéines d’histones individuelles et des octamères d’histones prêts à l’emploi peuvent être achetés dans le commerce (par exemple, Epicypher).  ;
Tampon d’image	N/A	N/A	20 mM chlorhydrate de tris pH 8,0, 100 mM chlorure de sodium
Fragment de Klenow (3' à 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Sans méthylation &lambda ; ADN
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maléimide Fluorophore LD655 fonctionnalisé
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Protéine recombinante purifiée fabriquée en interne (voir réf. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Configuration à double piège ; matériaux standard pour l’instrument fournis par le fabricant
Solution d’acétate de magnésium	Millipore Sigma	63052-100ML	À utiliser pour fabriquer un tampon HR
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Inclus avec le kit de fragments Klenow
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissoudre dans H2O et passer à travers un filtre de 0,22 um
Chlorure de potassium	Millipore Sigma	P3911	Utilisation pour fabriquer un tampon PBS et HR
Phosphate de potassium monobasique	Millipore Sigma	P0662	À utiliser pour fabriquer du PBS
em>S. cerevisiae Nap1	N/A	/A	Nap1 a été purifié en interne comme décrit précédemment (voir réf. 33, 34). Alternativement, Nap1 peut être acheté dans le commerce (par exemple, Active Motif).
Acétate de sodium	Millipore Sigma	241245	Dissoudre dans H2O à 3 M
Chlorure de sodium	Millipore Sigma	S9888	Utilisation pour fabriquer du PBS et un tampon d’image
Phosphate de sodium dibasique	Millipore Sigma	S9763	Utilisation pour fabriquer des
particules enrobées de biotine PBS SPHERO (3.0-3.4 µ ; m)	Spectrophotomètre Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Fisher	Scientific	ND2000	Spectrophotomètre NanoDrop
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissoudre dans H2O et ajuster au pH approprié ; utiliser pour faire du tampon d’image et du tris acétate

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