Article de méthode

Essai de migration in vitro en temps réel pour les lymphocytes T CD8+ murins primaires

DOI :

10.3791/66580

⸱

24 mai 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester, 2David H. Smith Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole fournit une méthode d’isolement primaire des lymphocytes T murins et de microscopie à intervalle de la migration des lymphocytes T dans des conditions environnementales spécifiques avec une analyse quantitative.

Résumé

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La réponse immunitaire adaptative dépend de la capacité d’un lymphocyte T à migrer dans le sang, la lymphe et les tissus en réponse aux agents pathogènes et aux corps étrangers. La migration des lymphocytes T est un processus complexe qui nécessite la coordination de nombreux signaux provenant de l’environnement et des cellules immunitaires locales, y compris les chimiokines, les récepteurs de chimiokines et les molécules d’adhésion. De plus, la motilité des lymphocytes T est influencée par les signaux environnementaux dynamiques environnants, qui peuvent modifier l’état d’activation, le paysage transcriptionnel, l’expression des molécules d’adhésion, etc. In vivo, la complexité de ces facteurs apparemment entrelacés rend difficile la distinction des signaux individuels qui contribuent à la migration des lymphocytes T. Ce protocole fournit une série de méthodes allant de l’isolement des lymphocytes T à l’analyse assistée par ordinateur pour évaluer la migration des lymphocytes T en temps réel dans des conditions environnementales très spécifiques. Ces conditions peuvent aider à élucider les mécanismes qui régulent la migration, améliorant ainsi notre compréhension de la cinétique des lymphocytes T et fournissant des preuves mécanistes solides qui sont difficiles à obtenir par des expériences sur des animaux. Une compréhension plus approfondie des interactions moléculaires qui ont un impact sur la migration cellulaire est importante pour développer des thérapies améliorées.

Introduction

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Les lymphocytes T sont les principaux effecteurs de la réponse immunitaire adaptative spécifique à l’antigène. Au niveau de la population, les lymphocytes T sont hétérogènes, composés de sous-ensembles cellulaires avec des fonctions spécialisées distinctes. Il est important de noter que les lymphocytes T CD8+ sont les principaux effecteurs cytolytiques du système immunitaire, qui éliminent directement les cellules infectées ou dysfonctionnelles1.

Les lymphocytes T CD8+ matures résident dans les tissus et circulent dans le sang et les lymphatiques à la recherche d’antigènes. Au cours de l’infection, les lymphocytes T sont présentés avec des antigènes dans le sang ou les tissus et s’écoulent rapidement vers la rate ou le ganglion lymphatique drainant le plus proche pour commencer une réponse immunitaire productive. Dans les deux cas, les lymphocytes T sont activés, subissent une expansion clonale et quittent le système lymphatique pour entrer dans le sang, s’ils ne s’y sont pas déjà produits. Au cours de ce processus, la signalisation intracellulaire confère la régulation négative des récepteurs de guidage lymphatique et la régulation positive de nombreux récepteurs d’intégrines et de chimiokines essentiels à la migration spécifique des tissus2. En fin de compte, la migration dirigée des lymphocytes T vers les sites d’infection est entraînée par des signaux environnementaux convergents qui incluent la signalisation de l’intégrine et de la chimiokine.

Les chimiokines peuvent être classées en deux classes principales : (1) les signaux homéostatiques, qui sont essentiels à la différenciation, à la survie et à la fonction basale, et (2) les signaux inflammatoires, tels que CXCL9, CXCL10 et CCL3, qui sont nécessaires à la chimiotaxie. Généralement, les chimiokines créent un gradient de signal qui entraîne une migration directionnelle, connue sous le nom de chimiotaxie, en plus d’activer l’expression de l’intégrine1. La chimiotaxie est finement régulée et très sensible, les lymphocytes T étant capables de répondre à de minuscules changements de gradient qui peuvent les conduire vers une direction ou un emplacement spécifique.

En plus de ces facteurs liés aux lymphocytes T, la migration est également affectée par la composition et la densité de la matrice extracellulaire (MEC). L’ECM est composée d’un réseau dense de protéines, y compris le collagène et les protéoglycanes, qui fournissent l’échafaudage pour les récepteurs adhésifs de l’intégrine sur les lymphocytes T. Les intégrines sont une famille diversifiée de protéines transmembranaires, chacune avec des domaines de liaison hautement spécialisés et des effets de signalisation en aval. L’expression dynamique des récepteurs de l’intégrine à la surface d’un lymphocyte T permet une adaptation rapide à leur environnement changeant3. Il est important de noter que les intégrines connectent l’ECM et les réseaux d’actine cytosquelettique intracellulaires qui travaillent ensemble pour générer la force propulsive nécessaire au mouvement des lymphocytes T.

En résumé, les schémas de migration varient en fonction du phénotype des cellules immunitaires ou des signaux environnementaux. Ces processus biologiques complexes sont étroitement régulés par l’expression de cytokines, de chimiokines et d’intégrines à la surface des lymphocytes T, des cellules environnantes et des tissus locaux infectés. In vivo, ces mécanismes migratoires peuvent être complexes et peuvent résulter de plusieurs signaux additifs4. En raison de cette complexité, il peut être impossible d’établir une relation de cause à effet entre des variables apparemment imbriquées. Pour surmonter cela, il existe plusieurs approches in vitro pour étudier des aspects spécifiques de la migration des lymphocytes T, tels que la réponse à des signaux spécifiques de chimiokines et l’interaction entre les intégrines des lymphocytes T et les protéines de liaison ECM. Ce protocole aborde les méthodes d’isolement et d’activation des lymphocytes T CD8+ murins, avec des tests de migration in vitro dans l’espace bidimensionnel et des outils d’analyse computationnelle pour analyser la migration des lymphocytes T spécifiés. Ces méthodes sont avantageuses pour l’utilisateur car elles ne nécessitent pas de matériaux ou de dispositifs sophistiqués, comme c’est le cas pour certains autres tests de migration cellulaire décrits dans la littérature. Les données de migration cellulaire générées à l’aide de ces méthodes peuvent fournir des preuves de réponses immunitaires d’une manière simpliste, ce qui permet une enquête plus approfondie et éclairée in vivo.

Protocole

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Les protocoles pour les animaux ont été approuvés par le Comité universitaire sur les ressources animales de l’Université de Rochester. Les souris de cette étude ont été maintenues dans l’espace exempt d’agents pathogènes de l’animalerie de l’Université de Rochester. Des souris C57BL/6 mâles/femelles, âgées de 6 à 12 semaines (15 à 30 g), ont été utilisées pour la présente étude. L’isolement des tissus de souris peut être effectué sur une paillasse avec des gants pour couvrir les mains et un masque facial pour couvrir le nez et la bouche, ou à l’intérieur d’une enceinte de biosécurité. Toutes les cultures cellulaires et la préparation des plaques doivent être effectuées dans une enceinte de biosécurité. Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Purification et activation des lymphocytes T CD8+

  1. Préparation des matériaux
    1. Pour la sélection négative des lymphocytes T CD8+ : Préparez un milieu de sélection négative à partir du surnageant des lignées cellulaires d’hybridomes GK1.5 et des anticorps M5/114, qui produisent respectivement des anticorps anti-CD4 et anti-MHCII. Mélangez le surnageant dans un rapport de 1:1, filtrez-le et stockez-le à 4 °C pour une utilisation future (>0,5 μg de chaque anticorps/million de cellules totales). Des kits commerciaux d’isolement de lymphocytes T CD8+ sont également disponibles.
    2. Pour l’activation des lymphocytes T : Ajouter 500 μL d’anticorps CD3 (10 μg/mL) et CD28 (16 μg/mL) dans 1 DPBS (sans calcium ni magnésium) à une plaque de 24 puits non traitée par culture tissulaire (CT) et conserver toute la nuit à 4 °C pour assurer la liaison de la plaque.
      REMARQUE : Les anticorps et les protéines enrobent mieux les plaques/boîtes de culture non traitées au TC que celles traitées au TC ordinaires, de sorte que les plaques de culture non traitées au TC sont utilisées pour la génération de lymphocytes T.
  2. Préparez une boîte de culture de 10 cm (ou l’équivalent) en plaçant une passoire cellulaire de 70 μm dans la boîte et versez 2 ml de milieu R9 dans le filtre (milieu R9 : RPMI 1640x complété par 10 % de FBS, 1 % d’antibiotique-antimycosique, 20 mM de tampon HEPES, 1 % d’acides aminés non essentiels MEM, 50 μM de β-mercaptoéthanol).
  3. Obtenez une souris avec un patrimoine génétique, un sexe, un âge et un poids appropriés, tels que déterminés par le plan expérimental.
  4. Euthanasier la souris à l’aide de CO2 suivie d’une luxation cervicale, ou de stratégies d’euthanasie appropriées définies par les protocoles locaux de soins et d’utilisation des animaux et approuvées par l’établissement.
  5. Placez la souris en position couchée, étirez les quatre membres perpendiculairement au corps et épinglez les repose-pieds à une planche de dissection à l’aide de broches en T de dissection de souris, ou équivalent. Faites une incision superficielle et centrale à travers la couche cutanée sur le bas-ventre ventral avec des ciseaux de dissection chirurgicale de souris et coupez directement jusqu’au menton (~8 cm). Séparez la peau de la muqueuse péritonéale pour exposer les ganglions lymphatiques. Étirez la peau perpendiculairement loin du tronc et épinglez-la5.
    1. Excise doucement les ganglions lymphatiques cervicaux, axiaux, brachiaux et inguinaux de manière bilatérale à l’aide d’une pince émoussée (ou du type préféré d’un kit de dissection chirurgicale standard chez la souris). Transférer dans la passoire de cellule préparée à l’étape 1.2.
    2. Ouvrez le péritoine et retirez la rate. Transférer dans la passoire de cellule préparée à l’étape 1.2.
    3. Jetez la carcasse de la souris dans le récipient approprié pour matières biologiques.
  6. Préparez une suspension unicellulaire des tissus lymphoïdes secondaires par perturbation mécanique sur la crépine cellulaire de 70 μm avec 2 mL de milieu R9 à partir de l’étape 1.2 en tournant l’outil de perturbation tissulaire d’un demi-tour dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre à plusieurs reprises.
    REMARQUE : L’extrémité du piston d’une seringue Luer-lock, soit 3 mL ou 10 mL, fonctionne bien pour écraser et homogénéiser le tissu. Des matériaux alternatifs peuvent être utilisés à la discrétion de l’utilisateur.
  7. Laver les cellules, l’extrémité de la seringue, la passoire et la boîte de culture avec 7 ml de milieu, en veillant à ce que la passoire reste verticale pour empêcher le transfert de plus gros morceaux de tissu ou d’agrégats cellulaires qui peuvent être présents dans la suspension unicellulaire.
  8. Transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 ml.
  9. Granulez les cellules à 270 x g à température ambiante (20 °C) pendant 5 min et décantez le surnageant.
  10. Ajouter 500 μL de tampon de lyse pendant 1 min pour éliminer les globules rouges. Diluer avec 9,5 mL de milieu R9 et essorer à 270 x g (20 °C) pendant 5 min. Décanter le surnageant.
  11. Remettre la pastille en suspension dans 10 mL du milieu de sélection négative préalablement préparé contenant des anti-MHCII et des anti-CD4 (étape 1.1.1). Creusez à température ambiante (20 °C) pendant 30 min.
  12. Granulez les cellules à 270 x g pendant 5 min et décantez le surnageant. Laver 3 fois avec 10 ml de médium R9.
  13. Simultanément, dans un tube conique de 15 mL, laver 200 μL de billes d’IgG anti-rat de mouton dans 7 mL de milieu. Placez le tube sur un aimant, retirez le fluide et répétez l’étape de lavage deux fois. Remettre les billes en suspension dans 7 mL de médium R9.
  14. Granulez les cellules à 270 x g (20 °C) pendant 5 min, décantez le surnageant, puis remettez la pastille en suspension dans 7 mL de suspension de billes à partir de l’étape 1.13. Basculez à température ambiante (20 °C) pendant 45 min.
  15. Enrichir les lymphocytes T CD8+ par appauvrissement des billes magnétiques. Placez le tube conique directement sur l’aimant sans couvercle pendant 3 min pour retirer les cellules liées aux anticorps/billes. Les cellules CD8+ doivent être conservées. Avec le tube toujours dans l’aimant, prélever la suspension cellulaire à l’aide d’une pipette sérologique ou l’équivalent et la transférer dans un nouveau tube de 15 mL. Centrifuger à 270 x g (20 °C) pendant 5 min et laver 3x à feu moyen.
  16. Lavez deux fois la plaque d’activation pré-enduite (étape 1.1.2) avec 1x DPBS sans pipeter directement sur la surface inférieure de la plaque.
  17. Facultatif : Effectuez une séparation des lymphocytes vivants/morts pour éliminer les cellules mortes.
    1. Transférer les cellules dans un tube conique de 15 ml. Ajouter doucement 2 mL de milieu de séparation des lymphocytes au fond de la suspension cellulaire. Centrifugeuse à 900 x g pendant 10 min (à température ambiante) à faible accélération et décélération.
      REMARQUE : Les cellules vivantes se sépareront à l’interface du milieu et du milieu de séparation (couche blanche moyenne). Les cellules mortes se granulent au fond du tube et peuvent être jetées à la fin.
    2. Transférez la couche intermédiaire contenant des lymphocytes vivants dans un nouveau tube et centrifugez à 270 x g pendant 5 min à température ambiante. Décanter le surnageant.
  18. Remettre la pastille en suspension dans 12 mL de milieu avec 10 U/mL d’IL-2 de souris recombinante. Déposer 1 mL par puits dans une plaque de 24 puits non traitée par TC et transférer à 37 °C pendant la nuit.

2. Lifting des lymphocytes T CD8+ activés

  1. Visualisez les cellules à l’aide d’un microscope optique de paillasse standard, à l’aide de l’objectif 4x ou 10x.
    REMARQUE : Les lymphocytes T activés apparaîtront plus grands et ronds ou allongés par rapport aux lymphocytes T inactivés et devraient avoir des amas denses de cellules dans tout le puits.
  2. Pour soulever les cellules activées, perturbez les cellules avec une pipette de 1 mL, en veillant à bien mélanger sur les bords de la plaque. Transférez les cellules dans un nouveau tube conique de 15 ml.
    REMARQUE : Les cellules activées sont plus collantes et nécessitent un pipetage plus vigoureux.
  3. Lavez les puits avec 1 mL de milieu R9 pour enlever les cellules restantes. Répétez l’opération une fois de plus si nécessaire. Centrifuger les cellules à 270 x g (20 °C) pendant 5 min. Jetez le surnageant.
  4. Effectuez une séparation des lymphocytes vivants/morts pour éliminer les cellules mortes comme aux étapes 1.17-1.18.
  5. Maintenir les lymphocytes T par prélèvement de cellules vivantes/mortes tous les 3-4 jours dans un milieu R9 avec de l’IL-2 dans une plaque à 6 puits non CT.
    REMARQUE : Les lymphocytes T prolifèrent mieux dans les puits de petite dimension lors de l’activation précoce, peut-être en raison de contacts entre lymphocytes T ou de facteurs solubles dérivés des lymphocytes T qui aident à leur activation. La prolifération rapide des lymphocytes T provoque le jaunissement du milieu de culture dans les 24 à 48 heures suivant la culture. À ce stade, soulevez les cellules et transférez-les dans un puits plus grand (non revêtu, plaque à 6 puits non TC) avec suffisamment de milieu de culture frais pour nourrir les cellules (généralement 5 ml par puits). Remplacez le milieu épuisé par du frais chaque fois que le changement de couleur du milieu jaune l’indique, ou tous les 3-4 jours.

3. Préparation du plat en verre

  1. Préparez des chambres ou des plaques de migration de cellules en verre en les enrobant de 300 μL/cm2 Protein A (0,1 mg/mL) pendant une nuit à 4 °C, lavez deux fois avec 1x DPBS en distribuant sur le plat et en transvasant avant de passer à l’étape suivante.
  2. Enduire la chambre ou la plaque de migration d’une chimère de souris recombinante ICAM-1 ou VCAM-1 Fc de 300 μL/cm( 0,1-2,75 mg/mL) avec une chimiokine de souris recombinante (0,1-10 μg/mL) pendant 2-3 h à température ambiante. D’autres ligands de l’intégrine tels que la fibronectine, le collagène IV de souris et l’E-cadhérine de souris sont rendus pour recouvrir directement la chambre à 2,5-10 μg/mL pendant la nuit à 4 °C.
    1. Lavez les chambres deux fois avec 1x DPBS en distribuant sur le plat et en décantant immédiatement après avant d’ajouter des cellules.
      REMARQUE : Les lymphocytes T peuvent migrer différemment dans différentes concentrations de ligands d’intégrines et de chimiokines en fonction de l’état d’activation, de différenciation, de sensibilisation et d’amorçage. Il est fortement suggéré de mesurer la migration cellulaire à des concentrations multiples différentes.
  3. Plaquez les cellules adhérentes sur des plaques recouvertes de verre 24 h avant le début de l’imagerie si vous co-cultivez des cellules T avec d’autres cellules, telles que des cellules cancéreuses, pour mesurer la destruction des cellules cancéreuses par les cellules T en temps réel.

4. Préparation des cellules

  1. En option : Colorez les cellules T et les cellules adhérentes avec le colorant de suivi cellulaire au choix à raison de 1 μg/mL par 1 x 107 cellules dans 1 x DPBS pendant 15 min à 37 °C, ou selon le protocole du fabricant.
  2. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un appareil équivalent.
  3. Plaquez 1 x 105 lymphocytes T CD8+ (ou la quantité désirée) dans le milieu L-15 de Leibovitz complété par 1-5 g/L de glucose dans une chambre à 37 °C.
    REMARQUE : Le milieu L-15 est formulé pour être utilisé sans système de bicarbonate de CO2-sodium. Il est tamponné à l’aide d’acides aminés basiques libres, de tampons de phosphate et de galactose pour maintenir les niveaux de pH.
  4. Facultatif : Effectuer le blocage de l’intégrine.
    1. Préincuber les lymphocytes T avec un anticorps bloquant contre une intégrine (1-10 μg/mL), anti-souris CD11a (M17/4), anti-souris CD18 (M18/2), anti-souris VLA-4 (9C10) pendant 10 min et laisser ramper en présence du même anticorps.

5. Microscopie à intervalle de temps

  1. Effectuez une microscopie vidéo.
  2. Pour les lymphocytes T, acquérez des images en fond clair et fluorescentes toutes les 10 à 60 s pendant 10 à 60 minutes, ou les paramètres d’acquisition souhaités.
    REMARQUE : La migration des lymphocytes T est sensible à la température et la température optimale pour la migration des lymphocytes T de souris est de 37 °C. Le système de contrôle de la température utilisé par ce protocole se compose d’une platine de microscope fermée et isolée avec un système de chauffage attaché. La chambre d’imagerie se trouve sur le pont d’imagerie. Le périmètre de cette chambre est doté d’un puits rempli d’eau distillée qui permet une chaleur et une humidité constantes pendant l’imagerie. Le micropuits est positionné au centre de la chambre d’imagerie.

6. Analyse assistée par logiciel de la migration des lymphocytes T

  1. Utilisez le logiciel Volocity pour évaluer la migration des lymphocytes T.
    1. Ouvrez Volocity et créez une nouvelle séquence d’images.
    2. Sélectionnez et déplacez tous les films de microscopie vidéo time-lapse vers la zone bleue de Volocity.
    3. Ajustez la luminosité et le contraste à l’aide de l’outil d’amélioration du contraste sur les paramètres souhaités par le chercheur.
    4. Vérifiez les tailles d’image : 0,325 μm pour 20x, 0,65 μm pour 10x.
    5. Séquence : définissez des points de temps (ex : 81 images si vous prenez une image toutes les 15 s pendant 20 min, 4 par min).
    6. Décochez tous les points de temps dans l’onglet de mesure.
    7. Trouvez des objets à l’aide de l’intensité et faites glisser la barre de manière à ce qu’elle soit juste à droite du pic.
    8. Exclure les objets par taille : toutes les cellules dont le diamètre est inférieur à 10 μm et supérieur à 100 μm afin d’exclure les débris cellulaires ou les particules non cellulaires. Excluez les lymphocytes T qui migrent pendant moins de 20 % du temps d’enregistrement (qui peut varier en fonction de la définition de chaque investigateur).
    9. Ignorer les objets statiques (case à cocher).
    10. Joindre automatiquement les parcelles rompues (case à cocher).
    11. Réglez le chemin le plus court sur 20 μm maximum.
    12. La trace de la migration d’une cellule est la ligne reliant l’emplacement de la même cellule au fil du temps. Assurez-vous que l’algorithme de suivi effectue le suivi en détectant l’endroit où les objets individuels sont détectés par segmentation dans chaque image, et que les objets sont mis en correspondance entre les images.
    13. Enregistrez un nouveau protocole en choisissant Mesures > Enregistrer le protocole > Nom Nouveau protocole.
    14. Cliquez sur mesurer tous les points temporels dans l’onglet mesure.
    15. Triez les pistes par période, de la plus élevée à la plus faible.
    16. Consignez les numéros d’identification de toutes les cellules dont les traces sont bonnes, tels que définis par l’enquêteur. Après le suivi automatique des cellules, l’évaluation manuelle de chaque piste de cellule est nécessaire pour exclure les pistes faussement identifiées ou rompues. Excluez les cellules avec des pistes incorrectes.
    17. Exportez le fichier sous forme de texte séparé par des virgules et transférez les données vers le logiciel d’analyse souhaité.
      REMARQUE : Paramètres de base : Vitesse (μm/min), déplacement (mouvement net, μm), longueur de la piste (longueur totale du trajet, μm) et indice de méandre (MI ; déplacement net/longueur de la piste). MI = 1 indique une piste linéaire complètement droite).
  2. Effectuez un suivi manuel à l’aide de l’image J.
    1. Ouvrez les plugins et sélectionnez suivi et suivi manuel. Définissez les paramètres - intervalles de temps, étalonnage x/y (taille des pixels) et étalonnage z (en mode de suivi manuel). Démarrez le suivi de chaque cellule en cliquant sur Ajouter une piste, en sélectionnant une cellule au premier point temporel et en continuant à travers tous les points temporels. Ensuite, cliquez sur Terminer la piste. Répétez l’opération pour toutes les cellules d’intérêt.
      REMARQUE : Trackmate, un autre outil de suivi de cellules, est un logiciel de suivi automatique disponible via le plugin ImageJ.

Résultats

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La confirmation de l’activation des lymphocytes T peut être obtenue par cytométrie en flux, à la recherche d’une expression accrue de CD69 et CD44, qui sont des marqueurs canoniques de l’activation dans les lymphocytes T murins6. De plus, la pureté de la population de lymphocytes T peut être déterminée par cytométrie en flux pour les lymphocytes T CD3+ CD8+ . Cette méthode permet d’obtenir >90 % de lymphocytes T CD8+ .

La migration des lymphocytes T peut être évaluée à l’aide de programmes de suivi cellulaire assistés par logiciel qui sont à la fois reproductibles et adaptables aux besoins de l’investigateur. Parmi les paramètres de base utilisés pour déterminer les effets expérimentaux, citons la vitesse cellulaire (longueur de migration par temps donné pour déterminer la vitesse à laquelle une cellule se déplace), le déplacement (distance de migration, une ligne droite du point de départ au point d’arrivée, pour déterminer la distance de migration d’une cellule), la longueur de la piste (distance de migration, la longueur totale du chemin de migration, pour déterminer la distance de migration d’une cellule), et l’indice de méandre (MI est compris entre 0 et 1 pour déterminer la rectitude de la migration, 1 = droit). Ces paramètres sont utilisés pour évaluer les différences migratoires entre les lymphocytes T CD8+ naïfs et activés rampant le long du verre à revêtement ICAM-1 avec CXCL12 (Figure 1). Une augmentation de la vitesse moyenne, du déplacement et de l’indice de méandre a été observée chez les lymphocytes T CD8+ activés par rapport aux cellules naïves, ce qui indique que les lymphocytes T activés ont une capacité de migration accrue. De même, l’impact de différentes chimiokines sur les modèles de migration cellulaire peut être élucidé avec ces méthodes. Par exemple, les lymphocytes T CD8+ activés présentent une migration accrue en présence de CXCL12, mais pas de CCL2 ou de CCL22, et la migration augmente de manière dose-dépendante jusqu’à une concentration saturante (figure 2). De plus, le suivi cellulaire assisté par logiciel permet de caractériser la migration des cellules individuelles, ce qui permet de comprendre les effets des ligands individuels sur le comportement des lymphocytes T. Des traces de cellules représentatives peuvent être observées dans la figure 3.

Prises ensemble, ces données soutiennent l’efficacité des méthodes actuelles en confirmant que nous pouvons (1) suivre la migration cellulaire sur une base cellulaire individuelle, et (2) distinguer les différences de migration des lymphocytes T CD8+ en fonction de l’état d’activation et en présence de différentes chimiokines et molécules d’adhésion. Ce test est une étape essentielle dans la dissection de mécanismes de signalisation complexes et l’information sur des expériences in vivo ciblées qui peuvent approfondir les contributions biologiques de signaux spécifiques d’une manière spécifique au type de cellule.

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Figure 1 : Essais in vitro de migration des lymphocytes T CD8+ naïfs et activés. Les lymphocytes T CD8+ de souris naïves ou activées par CD3/CD28 ont été autorisés à migrer sur ICAM-1 plus CXCL12 pendant 10 min. La vitesse, le déplacement et l’indice de méandre de la migration cellulaire ont été analysés à l’aide de la microscopie à intervalle de temps et de la volocité. Chaque groupe possède 36 lymphocytes T individuels (moyenne ± SEM). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Essais in vitro de migration dépendante des chimiokines des lymphocytes T CD8+ activés. Les lymphocytes T CD8+ de souris activés par CD3/CD28 ont été autorisés à migrer sur ICAM-1 plus une chimiokine indiquée. Les rapports du nombre de cellules rampant sur plus de 50 μm pendant 20 min (pourcentage du total) ont été déterminés dans un champ de vision. Un seul test a analysé >10 cellules (n = 3 tests par groupe ± moyenne SEM). Test t non apparié, *p< 0,05 par rapport au témoin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Traces migratoires de lymphocytes T CD8+ activés sur ICAM-1 plus CXCL12 pendant 20 min. Chaque ligne colorée indique la trajectoire migratoire de chaque cellule T dans une direction allant du point de la cellule à l’opposé. Dans ce test particulier, 24 cellules sur 38 ont migré dans une longueur significative (au moins la distance de leur largeur cellulaire selon notre définition). Les lymphocytes T ont migré sur différentes longueurs de distances, indiquant que chaque cellule était dans un état différent d’activation ou d’amorçage. Toutes les cellules migratrices se déplaçaient dans des directions différentes à condition que la surface soit uniformément enduite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Comprendre l’impact biologique des signaux convergents in vivo est difficile et difficile à interpréter. Les protocoles présentés ici fournissent une méthode raisonnable pour comprendre la migration des lymphocytes T dans des conditions hautement définies et biologiquement pertinentes. Ces conditions peuvent être spécifiées à la discrétion de l’investigateur, et les protocoles peuvent être modifiés pour répondre aux besoins de diverses populations de lymphocytes T, à l’état d’activation et au phénotype cellulaire. De plus, de nombreux ligands et récepteurs peuvent être interrogés par ces procédures définies de blocage des anticorps 7,8 et de verre recouvert de ligands 8,9,10. Cette technique a également constitué une plate-forme essentielle pour développer des cellules immunitaires modifiées11,12.

Les étapes importantes du protocole comprennent l’isolement du tissu lymphoïde secondaire, l’activation des lymphocytes T, le revêtement des boîtes d’imagerie en verre et l’analyse des données. Pour l’œil inexpérimenté, les ganglions lymphatiques incrustés dans les tissus peuvent être difficiles à identifier et à extraire. Cela peut être surmonté avec de la pratique. Une fois que les lymphocytes T ont été isolés et purifiés, l’étape d’activation entraîne des cellules collantes qui, si elles ne sont pas soulevées correctement, peuvent entraîner un faible rendement. Cela peut être évité en lavant généreusement et soigneusement les puits. La vaisselle en verre doit être correctement recouverte du ligand d’intérêt et lavée avant l’ajout de cellules. Cela garantira qu’une couche robuste de protéines est disponible pour que les cellules puissent adhérer, tout en veillant à ce que l’excès de réactif ne perturbe pas la biologie. La liaison de surface du verre de protéine A et la liaison de la protéine A Fc dans le pH physiologique et la concentration en sel sont suffisamment fortes pour résister au lavage lors du versement doux et de la décantation du tampon. Les protéines résiduelles, le cas contraire, dans le milieu ne causent aucune toxicité, même si elles peuvent perturber l’interaction cellulaire avec les ligands liés si les ligands non liés sont à des concentrations élevées. Nous excluons cette possibilité en rinçant le verre à couche plusieurs fois. Enfin, il existe de nombreux logiciels commerciaux et non commerciaux conviviaux qui permettent aux chercheurs de détecter même des différences subtiles dans les comportements et les morphologies cellulaires. On ne saurait trop insister sur l’importance de rassurer manuellement les résultats analysés afin d’exclure les erreurs que le logiciel pourrait commettre.

Les méthodes de purification et d’activation des lymphocytes T peuvent être modifiées pour répondre aux besoins du chercheur afin d’obtenir l’état cellulaire et le phénotype appropriés pour récapituler les observations in vivo. Différents types et états cellulaires peuvent être utilisés pour traiter différents mécanismes d’infection et de réponse immunitaire 7,8,9,10,11,13, y compris le comportement des lymphocytes T naïfs et mémoires et divers aspects de la réponse mémoire, tels que l’amorçage et le recrutement, dans des conditions spécifiques aux tissus 14. Cette méthode peut être utilisée pour la co-culture avec différents types de cellules afin de mieux comprendre les interactions cellulaires, y compris les temps et la durée de contact cellule-cellule 7,9, la présentation de l’antigène 9,13 et la destruction des cellules cibles6. Des rapporteurs et des marqueurs supplémentaires peuvent être utilisés pour évaluer les structures subcellulaires7, les granules15, l’apoptose6, etc.

Le protocole est un excellent outil pour guider d’autres expériences in vivo basées sur des observations dans des conditions simplifiées et hautement définies. Bien que l’évaluation in vitro de la motilité cellulaire puisse être très réductrice, il s’agit d’une étape importante dans la décomposition d’activités biologiques complexes. Grâce aux résultats de ces expériences, les chercheurs peuvent aborder le travail in vivo d’une manière plus pertinente et ciblée sur le plan physiologique.

La simplicité de cette méthode représente également sa principale limitation ; Bien que représentatifs des activités in vivo, tous les résultats peuvent être confirmés par la microscopie multiphotonique intra-vitale, par exemple. La méthode décrite dans le présent document est l’une des plus simples qui soit entièrement disponible pour les laboratoires de recherche avec un microscope à fond clair et/ou un microscope à épifluorescence avec une caméra numérique intégrée au système de microscope ou placée séparément sur l’objectif de l’endoscope. D’autre part, il existe davantage d’options pour l’analyse avancée de la migration des cellules immunitaires in vitro. Premièrement, les cellules immunitaires sont souvent entraînées par des gradients de chimiokines dans le système biologique. L’analyse des comportements des cellules immunitaires sous gradients de chimiokines peut être réalisée de plusieurs manières. Une méthode simple consiste à utiliser une diapositive spécialement conçue (voir le tableau des matériaux). Ce système de puits canalisés, lorsque son fond est recouvert de ligands d’intégrine, permet d’analyser la migration des cellules immunitaires sous gradient de chimiokines statiques. D’autres tests simples pour la chimiotaxie des cellules immunitaires comprennent la microscopie à intervalle de temps de la migration cellulaire vers une pointe de micropipette qui libère des chimiokines16, sous le testd’agarose 17 et la chambre Zigmond18. Pour des tests de migration plus sophistiqués sous des gradients de chimiokines contrôlés, des lames personnalisées avec des générateurs de gradients microfluidiques sont nécessaires19,20. Deuxièmement, les cellules immunitaires peuvent migrer dans des conditions physiques uniques en utilisant différents mécanismes, parfois sans utiliser l’adhésion dépendante de l’intégrine aux ligands. L’essai de migration in vitro en unidimensionnelle peut être réalisé avec ou sans enrobage de ligand d’intégrine et reproduit la motilité des cellules immunitaires dans les vaisseaux capillaires21,22. Une autre option est l’essai de migration cellulaire dans l’espace tridimensionnel23,24 pour étudier les mécanismes sous-jacents à la migration interstitielle des cellules25,26. Dans l’ensemble, nous avons décrit des méthodes simples, reproductibles et fiables pour étudier les événements de migration cellulaire dynamique.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent que toutes les recherches et la préparation du manuscrit ont été menées en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

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Nous remercions les membres précédents et actuels du Kim Lab qui ont contribué à l’élaboration de ces protocoles au fil du temps. Des données représentatives ont été rendues possibles par P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/États-Unis et P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/États-Unis. Cette publication a été rendue possible en partie grâce à la subvention numéro T32 GM135134 à la bourse du Service national de recherche Ruth L. Kirschstein.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Antenne de 10 cmCorning353003ou équivalent
Tube conique de 15 mlThermoFisher339650ou équivalent
1x DPBSGibco14190144sans calcium et sans magnésium
Plaque à 6 puits non traitée TCCorning3736ou équivalent
70 µ ; Filtre à cellules mFisherScientific352350ou équivalent
Tampon de lyse ACKThermoFisherA1049201ou équivalent
Centrifugeuse Allegra 6KRThermoScientificsorvall 16R avec rotor et godet tx400 3655ou équivalent
Beta mercaptoethanolSigmaM3148ou équivalent
CellTrace VioletThermoFisherC34571ou équivalent
CentrifugeuseThermoScientificSorvall ST 16Rou équivalent
Collagène (IV)Corning354233ou équivalent
Boîte de culture DeltaT .17 mm d’épaisseur verre transparentBioptechs04200417C
Dynabeads Mouton anti-Rat IgGInvitrogen11035
DynaMag 15 MagnetThermoFisher Scientific12301Dou équivalent
Kit d’isolement des lymphocytes T Easy sep mouse StemCell19851
FBSSigmaAldrichF2442-500MLou équivalent
FibronectineSigmaAldrich10838039001ou équivalent
Fijihttp://fiji.sc/weblink
Cubes de filtreNikon ou Olympus
GK1.5ATCCTIB-207
HEPESThermoFisher15630080ou équivalent
Caméra CCD HQCoolSNAPou équivalent
ImageJhttp://imagej.nih.gov/ij/hweblink
ImageJ suivi automatique ImageJ enfichable http://imagej.net/TrackMate
weblink Suivi manuel ImageJ branchez https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.htmlweblink
L-15DiversVoir les matériauxMedium Recette : Leibovitz' s Milieu L-15 sans rouge de phénol (Gibco) complété par 1-5 g/L
de glucose Milieu L-15 de Liebovitz, sans rouge de phénolSeringue jetable ThermoFisher21083027
Luer LokFisherScientific 14-955-459ou équivalent
Milieu de séparation des lymphocytesCorning25-072-CIou équivalent
M5/114ATCCTIB-120
MEM Acides aminés non essentielsThermoFisher11140050ou équivalent
Système de chauffage de microscopeOkolabokolab.comModèles personnalisés disponibles
Millicell EZ slide MilliporeC86024
Mojosort souris CD8+ Naï ; ve Kit d’isolement de cellules TBiolegend480043
Souris E-cadhérineR& D systems8875-EC-050ou équivalent
Kit de dissection chirurgicale de sourisFisher Scientific13-820-096ou éléments
NISNikonSoftware
non-TC 24wpCorning353047ou équivalent
Pénicilline-streptomycineThermoFisher15140122ou équivalent
Protéine AThermoFisher Scientificou équivalent
R9DiversVoir les matériauxMedium Recette : RPMI 1640x complété par 10 % de FBS, 1 % d’antibiotique-antimycosique (Gibco), 20 mM de tampon HEPES (Gibco), 1 % d’acides aminés non essentiels MEM (Gibco), 50 &mu ; M &beta ;-mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich)
Souris recombinante ICAM-1 Fc chimèreR& D systems796-IC-050ou équivalent
Souris recombinante IL2Biolegend575410ou équivalent
RPMI 1640xThermoFisher11875093ou équivalent
Broches TFisher ScientificS99385ou équivalent
Microscope TE2000-UNikonou équivalent
Souris recombinante chimiokineR& D systèmesou équivalent
VCAM-1 Fc chimèreR& D systems643-VM-050ou équivalent
VolocityPerkinElmerSoftware
équivalents

Références

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